СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ С ПОМОЩЬЮ ПРОТЕАСОМНОЙ СИСТЕМЫ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ РАЗРАБОТКИ СРЕДСТВ ПРОФИЛАКТИКИ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ С ПОМОЩЬЮ ПРОТЕАСОМНОЙ СИСТЕМЫ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ РАЗРАБОТКИ СРЕДСТВ ПРОФИЛАКТИКИ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ


RU (11) 2279290 (13) C2

(51) МПК
A61K 39/00 (2006.01)
G01N 33/573 (2006.01) 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 10.08.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(14) Дата публикации: 2006.07.10 
(21) Регистрационный номер заявки: 2004130389/13 
(22) Дата подачи заявки: 2004.10.19 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2004.10.19 
(43) Дата публикации заявки: 2006.03.27 
(45) Опубликовано: 2006.07.10 
(56) Аналоги изобретения: VOGES D. et aL. The 26S proteasome: a molecular machine designed for controlled proteolysis, Annu Rev Biochem. 1999;68:1015-68. MURAKAMI Y. et al. Omithine decarboxylase is degraded by the 26S proteasome without ubiquitination, Nature. 1992 Dec 10;360(6404),597-9. BEN-SHAHAR S. et al. 26 S proteasome-mediated production of an authentic major histocompatibility class I-restricted epitope from an intact protein substrat, J Biol Chem. 1999 Jul 30,274(31):21963-72. 
(72) Имя изобретателя: Марков Виктор Иванович (RU); Ковтун Анатолий Леонидович (RU); Махлай Александр Александрович (RU); Меркулов Вадим Анатольевич (RU); Карпов Вадим Львович (RU) 
(73) Имя патентообладателя: Вирусологический центр НИИ Микробиологии Министерства обороны Российской Федерации (RU) 
(98) Адрес для переписки: 141306, Московская обл., г. Сергиев-Посад-6, Вирусологический центр НИИ Микробиологии Министерства обороны Российской Федерации, начальнику центра 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ С ПОМОЩЬЮ ПРОТЕАСОМНОЙ СИСТЕМЫ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ РАЗРАБОТКИ СРЕДСТВ ПРОФИЛАКТИКИ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
Изобретение относится к области молекулярной биологии и вирусологии. Предложен способ получения иммуногенного препарата вируса Венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ) с помощью протеасомной системы. Способ предусматривает получение рекомбинантных пептидов ODC-E2-L, ODC-E2-M и ODC-E2-N путем их выделения из культуры E.coli BL-21 (DЕ3). Далее проводят гидролиз рекомбинантных пептидов на препарате активированных 26S протеасом, в результате чего получают очищенные иммуногенные вирусоспецифические пептиды ODC-E2-L-gyd, ODC-E2-M-gyd и ODC-E2-N-gyd. Изобретение может быть использовано для разработки защитных препаратов нового поколения против ВЭЛ. 3 ил., 3 табл.




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Изобретение может быть использовано в вирусологических, иммунологических и молекулярно-биологических исследованиях по разработке защитных препаратов нового поколения против вирусных инфекционных заболеваний.

В настоящее время проблема специфической профилактики вирусных инфекций является одной из важнейших, поскольку в структуре заболеваемости и смертности населения эти заболевания занимают одно из ведущих мест. Поэтому совершенствование средств специфической профилактики и разработка принципиально новых вакцинных препаратов против вирусных инфекций является актуальной задачей.

Как бактериальная клетка, так и вирусы представляют собой мозаику антигенов, среди которых лишь немногие обладают наибольшими протективными свойствами, т.е. являются главными эпитопами. Поэтому идеальным было бы готовить вакцины, содержащие только необходимые антигены.

Традиционные методические подходы к идентификации и выделению таких "нужных" антигенов требуют значительных финансовых и трудовых затрат, а также не позволяют в абсолютно чистом виде получить "идеальный" иммуноген вследствие многостадийности процессов подготовки, в процессе которой может нарушаться их специфичность.

Последние достижения в области молекулярной биологии и иммунологии позволяют определить подходы, с помощью которых можно преодолеть вышеуказанные трудности.

Накопилось достаточное количество доказательств, что протеасома, внутриклеточный белковый комплекс, обладающий протеолитической и АТФазной активностью, участвует в формировании антигенных пептидов. В ответ на вирусную инфекцию или другой стресс протеасома деградирует вирусные белки до специфических коротких пептидов, которые представляются антигену главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) класса I [1, 2]. Процесс этот высоко специфичен, поскольку протеасома генерирует пептиды (искомые эпитопы) строго определенной длины, которые с высокой аффинностью связываются с транспортным белком ТАР (transporter of antigen processing), переносящим пептиды молекулам ГКГ класса I. Затем комплекс транспортируется на поверхность клетки, где цитотоксические Т-лимфоциты распознают комбинацию пептид-молекула ГКГ и, при соответствующих условиях, убивают клетку, инфицируемую вирусом. Отсюда следует, что протеасома играет решающую роль в генерировании иммунного ответа при вирусной инфекции. Этот мультиферментный комплекс обладает высокой специфичностью при гидролизе белков и узнает определенные аминокислотные блоки. Как результат образуются специфические пептиды (а не случайный набор), которые обладают биологической активностью, проявляющейся в их способности образовывать комплекс с молекулами ГКГ и, соответственно, с рецепторами Т-лимфоцитов.

Возможность воспроизвести образование биологически активных пептидов in vitro (на выделенных препаратах протеасом) позволила бы получать специфические вакцины даже в том случае, когда при иммунизации целыми вирусными частицами этого добиться не удается (что, по-видимому, связано с "неэкранированностью" соответствующих эпитопов, образующихся только после гидролиза белков на протеасоме). В литературе уже описаны предварительные результаты по использованию протеасом in vitro для получения биологически активных эпитопов, однако определенную проблему представляют условия деградации вирусных белков во внеклеточной среде с помощью протеасом без предварительного каскадного убиквитирования. In vitro пока не удается воспроизвести специфическое маркирование белков и это представляет определенную трудность в получении эпитопов. Однако возможно использование природных пептидов в качестве носителя необходимых сигналов для специфической деградации белков, которые исходно имеют участки специфической деградации и поэтому узнаются протеасомой. К числу таковых относится фермент орнитиндекарбоксилаза (ODC), который в настоящее время выделен и клонирован в ряде плазмидных векторов [3]. Использование орнитиндекарбоксилазы в качестве лидерного протеина при получении гибридных белков может позволить транспортировать любой целевой пептид в протеасомный комплекс, что приведет к его протеасомоопосредованной деградации.

На сегодняшний день имеются реальные предпосылки для использования протеасомы в качестве "in vitro машины", эффективно производящей главные детерминанты (эпитопы), ответственные за иммунный ответ при различных вирусных инфекциях.

Необходимо также иметь в виду, что, регулируя работу данной системы, т.е. используя специфические ингибиторы или воздействуя на регуляторные гены, можно ослаблять или усиливать иммунный ответ при вирусных инфекциях.

Создание "in vitro-системы" на основе протеасомного комплекса позволит с небольшими трудовыми и финансовыми затратами получать "идеальные" иммуногены - прототипы вакцин нового поколения, обладающие высокой антигенностью и способствующие формированию специфического иммунитета к вирусным инфекциям.

Для экспрессии in vitro гибридных генов широко используются векторы серии рЕТ фирмы Novagen (США), в частности вектор рЕТ-23b (фиг.1), который позволяет клонировать необходимую рамку считывания под индуцибельным промотором фага Т7. Кроме того, этот вектор сконструирован таким образом, что к клонируемому гену в необходимой рамке считывания добавляется дополнительный олигонуклеотид, соответствующий шести тандемно повторяющимся остаткам гистидина - 6xHis. При этом собственный стоп-кодон заменяется на векторный, расположенный после 6xHis. Наличие на конце рекомбинантного пептида кэпа 6xHis позволяет очень быстро и эффективно выделять в гомогенном состоянии белок на колонках с Ni-агарозой.

В качестве модельного возбудителя инфекционного заболевания, против которого разрабатываются профилактические средства, выбирают хорошо изученный возбудитель.

Вирус Венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ) является одним из наиболее полно изученных как структурно, так и с точки зрения иммуно- и патогенеза возбудителей вирусных инфекций. Структурно возбудитель содержит одну молекулу РНК, ковалентно связанную с белком капсида и окруженную димером гликопротеинов оболочки Е1 и Е2, однако в условиях высокой множественности заражения возможно формирование полиплоидных вирионов, содержащих под одним суперкапсидом несколько нуклеокапсидов. При репликации генома вируса транскрибируется 2 типа мРНК - 42S и 26S, определяющих, соответственно, синтез как неструктурных (nsP), так и только структурных белков.

Оба гликопротеина оболочки (Е1 и Е2) имеют значение для сохранения инфекционности и патогенности вируса, однако, если Е1 в большей степени определяет этап связывания вируса с рецепторами клеточной оболочки и последующий виропексис, то Е2 преимущественно индуцирует иммунный ответ организма на вирусную инфекцию, что показано в исследованиях с сыворотками реконвалесцентов. В этой связи для получения иммуногенных препаратов вируса ВЭЛ был выбран структурный белок возбудителя Е2.

При клонировании фрагментов структурных пептидов вирусов, имеющих антигенные детерминанты, необходимым условием для их иммуногенности является сохранение наиболее актуальных эпитопов. К настоящему времени антигенная структура гликопротеина Е2 достаточно хорошо изучена, а формируемые им эпитопы картированы как зарубежными, так и отечественными специалистами [4]. Иммунодоминантное положение занимает высококонсервативный участок в средней части М-фрагмент белка Е2 вируса ВЭЛ (фиг.2), определенный с использованием иммунохимических методов. Меньшую значимость имеют расчетные конформационные эпитопы, расположенные в концевых областях L и N пептида.

Способ получения иммуногенных препаратов на основе протеасомоопосредованной технологии не имеют аналогов в Российской Федерации.

Целью настоящего изобретения является разработка способа получения иммуногенных препаратов на основе протеасомоопосредованной технологии, предназначенных для разработки защитных препаратов нового поколения против вирусных инфекций на примере модельного вируса Венесуэльского энцефаломиелита лошадей.

Сущность изобретения состоит в том, что разработанный способ получения иммуногенных препаратов, основанный на протеасомоопосредованной технологии, позволяет конструировать пептидные вакцины против вирусных инфекций.

Иммуногенные вирусспецифические пептиды ODC-E2-L-gyd, ODC-E2-M-gyd, ODC-E2-N-gyd были получены в результате специфического гидролиза очищенных, концентрированных рекомбинантных пептидов ODC-E2-L, ODC-E2-M, ODC-E2-N на препарате активированных 26S протеасом, приготовленных из печени крысы. Рекомбинантные пептиды ODC-E2-L, ODC-E2-M, ODC-E2-N, в свою очередь, были выделены из индуцированных изопропил- -тиогалактопиранозидом (ИПТГ) культур Е.coli BL-21(DE3), содержащих плазмиды рЕТ-23b со вставками гибридных генов орнитиндекарбоксилазы - ген-эквивалентов фрагментов L, М, N структурного белка Е2 вируса ВЭЛ - pET-23b-ODC-E2-L, pET-23b-ODC-E2-M, pET-23b-ODC-E2-N. Данные плазмиды были получены в результате клонирования ген-эквивалентов фрагментов L, М, N структурного белка Е2 вируса ВЭЛ, соответственно, в составе орнитиндекарбоксилазы в плазмидном векторе pET-23b (Novagen).

Рекомбинантные плазмиды pET-23b-ODC-E2-L, pET-23b-ODC-E2-M, pET-23b-ODC-E2-N депонированы в Специализированную коллекцию рекомбинантных плазмид Вирусологического центра НИИ микробиологии Министерства обороны Российской Федерации за №№01/1, 01/2 и 01/3 соответственно.

Характеристика и молекулярно-биологические свойства рекомбинантных плазмид pET-23b-ODC-E2-L, pET-23b-ODC-E2-M, pET-23b-ODC-E2-N представлены в таблицах 1, 2.

Полученные иммуногенные пептиды ODC-E2-L-gyd, ODC-E2-M-gyd, ODC-E2-N-gyd (фиг.3) обладают биологическими характеристиками, позволяющими использовать их в качестве иммунобиологических препаратов (вакцин).

Краткое описание рисунков

На фиг.1 изображена физическая карта плазмидного вектора pET-23b.

На фиг.2 показана диаграмма конформационных эпитопов белка Е2 вируса ВЭЛ, проецированных на клонируемые фрагменты L, М и N полипептида в составе векторной плазмиды pET-23b.

На фиг.3 изображена схема получения иммуногенных препаратов к модельному вирусу ВЭЛ.

Пример выполнения

Пробирки с культурами Е.coli BL-21(DE3), содержащими рекомбинантные плазмиды pET-23b-ODC-E2-L, pET-23b-ODC-E2-M, pET-23b-ODC-E2-N извлекают из холодильника, температура хранения минус 20,0±2,0°С. Проводят культивирование на среде LB с добавлением 25 мкг × мл-1 ампициллина. Продолжительность культивирования составляет от 12 до 18 часов при температуре 37,0±0,5°С.

После подращивания ночных культур в 10 мл LB при температуре 37,0±0,5°С до плотности от 0,5 до 0,6 оптических единиц культуры Е.coli BL-21(DE3), содержащие рекомбинантные плазмиды pET-23b-ODC-E2-L, pET-23b-ODC-E2-M и pET-23b-ODC-E2-N, индуцируют 0,4 мМ ИПТГ и подращивают еще 4 часа. Затем клетки осаждают 2 мин при 14000 об/мин.

После добавления ИПТГ 10 мкл образца в буфере - 50 мМ Трис, рН 6,8; 1% -меркаптоэтанол; 2% SDS; 0,1% бромофеноловый синий; 10% глицерин - анализируют на наличие рекомбинантных петидов в 10% ПААГ (буфер Лэммли), окраску геля проводят с помощью Кумасси.

Оставшуюся часть осажденных клеток суспендируют в лизирующем буфере (50 мМ NaH2PO4, рН 8,0; 300 мМ NaCl; 10 мМ имидазол). Добавляют лизоцим до 1 мг/мл и инкубируют 30 минут при легком перемешивании, избегая замораживания. Центрифугируют лизат 10 минут при 15000 об/мин, чтобы удалить клеточный дебрис, и переносят супернатант в новые пробирки. Добавляют 50% взвесь Ni-агарозы в каждую пробирку и перемешивают аккуратно в течение 30 минут при 4°С.

Центрифугируют 10 секунд при 15000 об/мин для осаждения агарозы и переносят супернатант в новую пробирку. Супернатант содержит несвязавшиеся с Ni-агарозой белки. Осадок промывают дважды буфером (50 мМ NaH2PO 4, рН 8,0; 300 мМ NaCl; 20 мМ имидазол) путем центрифугирования при 15000 об/мин в течение 10 секунд.

Поле прохождения суспензии суммарного белка через Ni-агарозу проводят элюцию специфически связавшегося с Ni-агарозой химерного протеина, используя буфер для элюции (50 мМ NaH2PO4, рН 8,0; 300 мМ NaCl; 250 мМ имидазол). Фракции, соответствующие химерным белкам, отбирают согласно регистрируемым Увикордом пикам. Полученные фракции химерных пептидов концентрируют до 1 мг/мл и диализуют против буфера ТЕ. Раствор очищенного химерного белка подвергают фракции химерных пептидов ODC-E2-L, ODC-E2-M и ODC-E2-N, концентрируют до 1 мг/мл и диализуют против буфера ТЕ. Раствор очищенного химерного пептида подвергают гидролизу добавлением препарата активных 26S протеасом, полученных следующим образом.

26S протеасому выделяют из печени крысы. Для одного цикла выделения используют половину гомогената печени. Все процедуры, кроме специально указанных, проводят в холодной комнате при 4°С [5].

Печень крысы промывают несколько раз физиологическим раствором, затем измельчают с помощью пресса. Измельченную ткань гомогенизируют в гомогенизаторе стекло-стекло в 30 мл буфера (30 мМ трис-HCl, рН 7,5; 100 мМ NaCl; 1 мМ ЭДТА; 1 мМ дитиотреитол; 10% глицерин; 5 мМ MgCl 2; 2 мМ АТФ). Полученный гомогенат центрифугируют при 3500 об/мин и 4°С в течение 15 минут для освобождения от грубых элементов соединительной ткани и фракции ядер. Супернатант подвергают ультрацентрифугированию при 15000 об/мин и 2°С в течение 1 часа для осаждения различных мембранных фракций цитоплазмы. "Сборку" 26S протеасомы проводят при добавлении к супернатанту, который содержит АТФ и MgCl2, фосфокреатина (10 мМ) и фосфокреатинкиназы (10 мкг/мл), и инкубируют при 35°С в течение 45 минут. После осаждения 26S протеасомы в присутствии сульфата аммония, взятого до 40% от насыщения, проводят ее очистку с помощью гель-фильтрации на колонке с сефарозой 2В размерами 1,5×72 см, имеющей объем 144 мл. Набивку колонки, промывку ее и элюцию белков осуществляют со скоростью 8 мл в час.

Дальнейшую очистку и концентрирование протеасомы проводят ультрацентрифугированием при 24000 об/мин и 2°С в течение 7 часов. Полученный осадок растворяют в буфере (20 мМ трис-HCl, рН 7,5; 1 мМ ЭДТА; 1 мМ дитиотрейтол; 50% глицерин; 5 мМ MgCl2; 1 мМ АТФ). Полученную фракцию активных 26S протеасом хранят при минус 20,0±2,0°С.

Препаратом химерного белка, обработанного протеасомой, проводят иммунизацию модельных лабораторных животных (кролики породы Шиншилла).

В качестве отрицательного контроля используют препарат орнитиндекарбоксилазы ODC-gyd, обработанный в тех же условиях на протеасомах. В качестве положительных контрольных препаратов используют очищенный белок Е2 вируса ВЭЛ и препарат очищенного и инактивированного 0,05% раствором формальдегида вируса ВЭЛ штамм Тринидад. Препараты в эквимолярных по белку количествах (примерно по 350 мкг) 1:1 с полным адъювантом Фрейнда однократно вводят кроликам внутримышечно. На 12-е, 18-е и 25-е сутки от момента вакцинации проводят забор крови из ушной вены животных. Сыворотку отделяют через 1 ч после инкубации крови при 37°С. Результаты сероконверсии к вирусу ВЭЛ определяют с помощью метода ТФИФА (таблица 3).

Результаты, представленные в таблице 3, показывают наличие сероконверсии у кроликов, иммунизированных гидролизатами пептидов ODC-E2-L-gyd и ODC-E2-M-gyd, процессированных на препарате активированных 26S протеасом, а также препаратами очищенного белка Е2 и инактивированного 0,05% раствором формальдегида вируса ВЭЛ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Voges D., Zwickl P., Baumeister W. The 26S proteasome: a molecular machine designed for controlled proteolysis// Annu. Rev.Biochem. - 1999. - Vol.68. - P.1015-1068.

2. Ciechanover A. The ubiqutin-proteasome pathway: on protein death and cell life// J.EMBO. - 1998. - Vol.17. - P.7151-7160.

3. Murakami Y., Matsufuji S., Kameji Т., Hayashi S., Igarashi K., Tamura Т., Tanaka K., Ichihara A. Ornithine decarboxylase is degraded by the 26S proteasome without ubiquitination// Nature, - 1992. - Vol.360. - P.597-599.

4. Fields Virology. Edited by B.N.Fields, D.M.Knipe, P.M.Howley et al. Philadelphia, Lippincott-Raven Publishers. - 1996. - 480 p.

5. Ben-Shahar S. et al. 26S proteasome-mediated production of an authentic major histocompatibility class I-restricted epitope from an intact protein substrate// J.Biol.Chem. - 1999. - Vol.234, №31. - P.21963-21972.



Таблица 2

Молекулярно-биологические свойства рекомбинантных плазмид pET-23b-ODC-E2-L, pET-23b-ODC-E2-M, pET-23b-ODC-E2-N 
Название Размер, п.о. Маркерный признак Векторная часть Клонированный фрагмент 
Размер, п.о. Структурные элементы Описание Размер, п.о. Суммарный размер фрагмента и ODC Сайт клонирования 
pET-23b-ODC-E2-L 5385 Устойчивость к ампициллину 3666 ori-сайт, промотор фага Т7, ген -лактамазы, ген -галактозидазы, ген устойчивости к ампициллину, множественный сайт клонирования кДНК фрагмента генома вируса ВЭЛ (8624-8986) (E2-L) и кДНК гена ODC 363 1719 ODC по Xhol; кДНК фрагментов генома вируса ВЭЛ по BstXI-сайту, расположенному между двух PEST участков гена ODC 
pET-23b-ODC-E2-M 5445 кДНК фрагмента генома вируса ВЭЛ (8990-9410) (Е2-М) и кДНК гена ODC 423 1779 
pET-23b-ODC-E2-N 5441 кДНК фрагмента генома вируса ВЭЛ (9411-9829) (E2-N) и кДНК гена ODC 419 1775 


Таблица 3 - Оценка сероконверсии у лабораторных животных к вирусу ВЭЛ 
Препарат Количество иммунизированных

кроликов Результаты сероконверсии к вирусу ВЭЛ на...сутки 
12 18 25 
Доля серопозитивных, % Титр Доля серопозитивных, % Титр Доля серопозитивных, % Титр 
ODC-E2-L-gyd 6 33 1:100 33 1:400 33 1:400 
ODC-E2-M-gyd 6 25 1:100 50 1:100

1:400 50 1:100 
ODC-E2-N-gyd 6 - - - - - - 
ODC-gyd 6 - - - - - - 
E2 очищенный 6 33 1:100 50 1:400 33 1:100 
ВЭЛ очищенный 6 33 1:100 100 1:100

1:400 100 1:400

1:1600


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ получения иммуногенного препарата вируса Венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ) с помощью протеасомной системы, включающий получение рекомбинантных пептидов ODC-E2-L, ODC-E2-M, ODC-E2-N путем выделения из индуцированных изопропил- -D-тиогалактопиранозидом (ИПТГ) культур Е.coli BL-21(DE3), содержащих плазмиды рЕТ-23b со вставками гибридных генов орнитиндекарбоксилазы - ген-эквивалентов фрагментов L, М, N структурного белка Е2 вируса ВЭЛ -pET-23b-ODC-E2-L, pET-23b-ODC-E2-M, pET-23b-ODC-E2-N; очистку и последующее концентрирование полученных рекомбинантных пептидов ODC-E2-L, ODC-E2-M, ODC-E2-N; получение, очистку и концентрирование препарата активированных 26S протеасом из печени крысы; получение иммуногенных вирусспецифических пептидов ODC-E2-L-gyd, ODC-E2-M-gyd, ODC-E2-N-gyd путем специфического гидролиза очищенных, концентрированных рекомбинантных пептидов ODC-E2-L, ODC-E2-M, ODC-E2-N на препарате активированных 26S протеасом; характеризующийся тем, что полученные иммуногенные вирусспецифические пептиды ODC-E2-L-gyd, ODC-E2-M-gyd, ODC-E2-N-gyd обладают биологическими характеристиками, позволяющими использовать их в качестве иммунобиологических препаратов (вакцин).