ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГЕРПЕСА

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГЕРПЕСА


RU (11) 2165264 (13) C2

(51) 7 A61K35/56 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 17.09.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2001.04.20 
(21) Регистрационный номер заявки: 98113555/14 
(22) Дата подачи заявки: 1998.07.10 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 1998.07.10 
(43) Дата публикации заявки: 2000.04.10 
(45) Опубликовано: 2001.04.20 
(56) Аналоги изобретения: 1. ИСАКОВ В.А. и др. Терапия герпетических инфекций. - С.- Петербург: Гиппократ, 1993, с.7-13. 2. RU 2108797 C1, 20.04.98. 3. WO 96/03978 A1, 15.02.96. 
(71) Имя заявителя: Бичурина Маина Александровна; Тарос Людмила Юлисовна; Никитина Лилия Евгеньевна; Бойков Юрий Алексеевич; Кубарь Ольга Иосифовна; Зачек Леонид Георгиевич 
(72) Имя изобретателя: Бичурина М.А.; Тарос Л.Ю.; Никитина Л.Е.; Бойков Ю.А.; Кубарь О.И.; Зачек Л.Г. 
(73) Имя патентообладателя: Бичурина Маина Александровна; Тарос Людмила Юлисовна; Никитина Лилия Евгеньевна; Бойков Юрий Алексеевич; Кубарь Ольга Иосифовна; Зачек Леонид Георгиевич 
(98) Адрес для переписки: 198096, Санкт-Петербург, пр. Стачек 79, кв.104, Бичуриной М.А. 

(54) ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГЕРПЕСА 

Изобретение относится к медицине, а именно к лекарственным препаратам. Фармацевтическая композиция включает средство, обладающее антивирусной активностью в отношении вирусов герпеса 1 и 2 типов, - мидийный гидролизат из мяса морских моллюсков мидий семейства Mytilidae, взятое в количестве 8,4-25,2 мг (по сухому остатку) на 1 г композиции и фармацевтически приемлемый носитель. Технический результат: композиция не обладает местным побочным действием и не вызывает формирования резистентных штаммов вируса герпеса. 7 табл. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к медицине, в частности к лекарственным препаратам, а именно к антивирусным средствам для лечения герпеса.

Герпес занимает одно из ведущих мест среди вирусных инфекций. Вирус простого герпеса (ВПГ) повсеместно распространен, клинические проявления его многообразны, течение болезни хроническое. ВПГ вызывает у людей кератиты и конъюнктивиты, невриты и энцефалиты, стоматиты и гингивиты, поражения слизистых оболочек - афтозные язвы и поражения гениталий, - и кожных покровов (экзема, везикулярные высыпания). Ежегодно с различными формами офтальмо-герпеса обращаются к офтальмологам до 300000 человек только в России. Генитальный герпес является одним из распространенных заболеваний и входит в специальную программу исследований, проводимых Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ). По данным ВОЗ заболевания, обусловленные ВПГ, вызывают 15,5% смертей (от гриппа умирает 35,8%) [Баринский И.Ф., Шубладзе А.К., Каспаров А. А. , Гребенюк В. Н. Герпес. Этиология, диагностика, лечение. "Медицина", М. , 1986] . Разработка средств лечения герпеса и профилактики рецидивов этого заболевания весьма актуальна.

Известна фармацевтическая композиция для лечения герпеса - оксолиновая мазь, содержащая 0,25; 0,5; 1; 2 и 3% 1,2,3,4- тетраоксо-1,2,3,4-тетрагидронафталиндигидрата [Машковский М.Д. Лекарственные средства. Вильнюс, 1993, ч.11, с. 335-340].

Также известно средство для лечения простого пузырькового и рецидивирующего герпеса теброфен - мазь, содержащая 0,25; 2 или 5% 3,5,3',5'-тетрабром-2,4,2',4';-тетраоксидифенила [там же].

Также известно средство для лечения вирусных заболеваний глаз флореналь в виде мази, содержащей 0,5% бисульфитного соединения 2-флуоренонилглиоксала [там же].

Также известно средство для лечения вирусного поражения слизистых риодоксол в виде мази, содержащей 0,25, 0,5 и 1% 2,4,6- трийодрезорцина [там же].

Также известна фармацевтическая композиция госсипол - мазь, содержащая 3% 2,2'-ди-(1,6,7-триокси-3-метил-5-изопропил-8-нафтальдегида) [там же].

Также известно средство для лечения множественного герпеса бонафтон в виде мази, содержащей 0,05 (глазная форма), 0,25; 0,5 и 1% 6-бром-1,2-нафтахинона [там же].

Как указано у Машковского, все эти мази вызывают жжение и гиперемию, как побочное действие препаратов. В практике их использования выявлены сравнительно невысокие показатели ингибирующей противогерпетической активности, требующие для усиления лечебного эффекта сочетанного применения с интерфероном и противогерпетической вакциной. Для получения лечебного эффекта требуется длительное применение указанных препаратов. Кроме того, все перечисленные препараты оказывают ингибирующее действие только на ВПГ-1 и не действуют на вирусы герпеса 2 серотипа, который является этиологическим фактором генитального герпеса.

Наиболее близкой по достигаемому терапевтическому эффекту является фармацевтическая композиция ацикловир (аналоги зовиракс, вералекс), включающая в качестве антивирусного средства соединения из класса аномальных нуклеотидов 9-(2-гидроксиэтоксиметил)-гуанин. Ацикловир (зовиракс, веролекс) выпускается в форме мазей и эффективен при лечении заболеваний, вызванных вирусами герпеса 1 и 2 серотипов [Исаков В.А, Ермоленко Д.К., Черных М.Д. Терапия герпетических инфекций. "Гиппократ" Спб, 1993, с. 7-13].

Однако ацикловир (зовиракс, веролекс) вызывает местное побочное действие в виде жжения, боли, шелушения, эритемы. Его невозможно использовать при поражении слизистых оболочек. Противопоказано его применение во время беременности и кормления. Кроме того, было показано [Брязжикова Т.С., Исаков В.А, и др. в кн. "Новые подходы к целенаправленному конструированию противовирусных препаратов" СПб, 1994, с. 17], что популяции ВПГ имеют различную чувствительность к ацикловиру. Были выделены штаммы ВПГ, резистентные к ацикловиру, подобные по антигенной характеристике прототипному штамму.

Результат, достигаемый в заявляемом изобретении, заключается в создании фармацевтической композиции, обладающей выраженной антивирусной активностью против вирусов герпеса 1 и 2 серотипов, не вызывающей формирования резистентных штаммов вируса герпеса и не обладающей побочным действием.

Указанный терапевтический результат достигается тем, что в фармацевтической композиции, включающей средство, обладающее антивирусной А активностью в отношении вирусов герпеса 1 и 2 серотипов, и фармацевтический носитель, в качестве средства, обладающего антивирусной активностью, содержится мидийный гидролизат из мяса морских моллюсков-мидий семейства Mytilidae, взятый в количестве 8,4-25,2 мг (по сухому остатку) на 1 г композиции.

Мидийный гидролизат из мяса морских моллюсков - мидий семейства Mytilidae выпускается по ТУ-15-1089-90 и представляет собой темно-коричневую жидкость, содержащую 30-38 мас.% сухого остатка. Гидролизат содержит аминокислоты, низкомолекулярные гептиды, полиеновые жирные кислоты, фосфатиды, гуминовые кислоты, мелансидины и микроэлементы. Гидролизат легко усваивается; он применяется в качестве пищевой добавки для лиц, ослабленных хроническими заболеваниями. Известно также применение мидийного гидролизата в качестве средства для лечения гриппа [патент РФ N 2043109, МКИ6 A 61 K 35/56, опубл. 10.09.95, Бюл. N 25] . Вирусингибирующая активность мидийного гидролизата против вируса герпеса, лекарственные формы и лечебные дозы до сих пор исследованы не были.

Ингибирующая активность мидийного гидролизата была изучена на двух тест-системах:

а) на культуре клеток перевиваемой линии почек кролика с размножающимся в ней вирусом простого герпеса (ВПГ) 1 типа штамм Л-2;

б) на культуре клеток перевиваемой линии VERO с размножающимся в ней вирусом герпеса 2 типа (ВГ-2) штамм Внуково-2.

Ингибирующая активность мидийного гидролизата оценивается по профилактическому, лечебному и вирулицидному действию. Критерием ингибирующего действия считали снижение инфекционной активности испытуемых вирусов (ВПГ-2 и ВГ-2) в присутствии не токсичного для культуры клеток разведения препарата 1:64.

ПРИМЕР 1.

ПРОФИЛАКТИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ МИДИЙНОГО ГИДРОЛИЗАТА НА ВПГ-1.

Из пробирок с монослоем перевиваемой культуры клеток РК-13 (почки кролика) удаляли ростовую среду и вносили по 0,8 мл поддерживающей среды (среда 199 с добавлением 1 об.% эмбриональной сыворотки и 4 об.% сыворотки крупного рогатого скота), содержащей не токсичную для культуры клеток дозу мидийного гидролизата - 1:64 (опытный ряд), в контрольные пробирки - по 0,8 мл только поддерживающей среды. Через 2 часа контакта при 361oC в опытные и контрольные пробирки вносили по 0,2 мл вируса простого герпеса (ВПГ-1), разведенного в поддерживающей среде в дозах 1, 10 и 100 ИТД50 (инфицирующая тканевая доза). На каждое разведение вируса в опытном и контрольном рядах использовали по 12 пробирок. Пробирки встряхивали и помещали в термостат при 361oC. Кроме того, в опыте были поставлены дополнительные контроли: контроль тканевой культуры и контроль рабочей дозы препарата на токсичность.

Срок наблюдения (микроскопия) за тканевой культурой - 7 дней. На 3, 5 и 7 сутки после заражения из контрольных и опытных культур, инфицированных различными дозами вируса, изымали по 4 пробирки опытных и контрольных культур. Вируссодержащую жидкость из каждых четырех пробирок объединяли и титровали на тканевой культуре клеток РК-13 с коэффициентом 10 (с 10-1 до 10-7).

Учет инфекционной активности проводили на 5-е сутки по цитопатотогенному действию (ЦПД) вируса на тканевые культуры.

По разнице титров вируса в опытных и контрольных пробах судили о степени ингибции ВПГ-1 под влиянием мидийного гидролизата на различных сроках постановки опыта. Профилактическая эффективность препарата отмечена на всех сроках наблюдения (табл. 1). Наиболее выраженное ингибирующее действие препарата на ранних сроках (снижение титра вируса на 3,0-4,0 лог.) наблюдали при ИТД50=100. На более поздних сроках (7 суток) при ИТД50=10 снижение титра вируса в опытных по сравнению с контрольными пробами составило 5,0 лог., при ИТД50=1,0 - 3,5 лог.

Таким образом, на основании полученных результатов этого опыта, испытанный мидийный гидролизат может быть отнесен к высокоактивным препаратам профилактического противогерпетического действия, то есть препарат в рабочей дозе 1:64 снижает титр вируса на 3,0-4,0-5,0 лог., то есть в 1000 - 100.000 раз.

ПРИМЕР 2.

ЛЕЧЕБНОЕ ДЕЙСТВИЕ МИДИЙНОГО ГИДРОЛИЗАТА НА ВПГ-1.

Из пробирок с монослоем перевиваемой культуры клеток РК-13 (почки кролика) удаляли ростовую среду и вносили по 0,2 мл ВПГ-1, разведенного в поддерживающей среде, содержащих 1,10 и 100 ИТД. Контакт вируса с клетками (штатив в наклонном положении) - 2 часа при 37oC. Через 2 часа после инфицирования культуры клеток вирус из пробирок удаляли, инфицированные культуры 3-х кратно тщательно отмывали раствором Хенкса, а затем в опытные ряды пробирок добавляли по 1 мл поддерживающей среды, содержащей не токсичную для культуры клеток дозу мидийного гидролизата - 1:64, в контроле - по 1 мл поддерживающей среды. На каждое разведение вируса в опыте и контроле использовали по 12 пробирок. Пробирки встряхивали и помещали в термостат при 37oC. Дополнительные контроли - контроль культуры и контроль препарата (на токсичность).

Все последующие процедуры проводили, как в примере 1.

Оказалось, что при различной множественности инфицирования последующее введение препарата в рабочей дозе 1:64 оказывало выраженное ингибирующее воздействие на ВПГ-1 на всех сроках наблюдения (таблица 2). Снижение титра вируса в опытных культурах по сравнению с контрольными достигало 4,0-5,0 лог., то есть в 10.000 - 100.000 раз.

При всех использованных в опыте дозах вируса максимальный ингибирующий эффект (снижение титра вируса на 5,0-5,5 лог ТЦД50) был получен на 3-и сутки.

Таким образом, на основании полученных результатов этого опыта мидийный гидролизат может быть отнесен к высокоактивным препаратам лечебного противогерпетического действия, то есть препарат при лечебной схеме применения снижает титр вируса на 5,0-5,5 лог. ТЦД50., то есть в 100.000 - 300.000 раз.

ПРИМЕР 3.

ВИРУЛИЦИДНОЕ ДЕЙСТВИЕ МИДИЙНОГО ГИДРОЛИЗАТА НА ВПГ-1 (РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ).

Из пробирок с монослоем клеток РК-13 (почки кролика) удаляли ростовую среду и вносили в каждую по 0,8 мл поддерживающей среды. Затем к 1 мл разведений ВПГ-1, равных 1-10.000 ИТД50, добавляли 1 мл мидийного гидролизита, разведенного 1: 32 (конечное разведение 1:64). Параллельно в пробирках соединяли равные объемы вируса с поддерживающей средой (контроль). Смеси выдерживали в течение 2-х часов при температуре 37oC, после чего вносили каждый образец по 0,2 мл в 6 пробирок культуры клеток РК-13. Контрольные и опытные культуры инкубировали при 361oC в течение 5 суток при ежедневном микроскопировании для выявления цитопатогенного действия (ЦПД).

Пробы для проведения титрования отбирали на 3 и 5 сутки.

Все последующие процедуры проводили, как в примере 1.

Интенсивное вирулицидное действие мидийного гидролизата, определяемое по разнице инфекционной активности вируса в опытных и контрольных пробах, выявлено на 3 и 5 сутки при использовании различных доз ВПГ-1, взятого для нейтрализации (таблица 3). Наиболее интенсивные показатели нейтрализации (2,5-5,0 лог.) выявлены на 5 сутки.

Таким образом, предлагаемый препарат в результате его вирулицидного действия снижает инфекционный титр ВПГ-1 в 300 - 100.000 раз, что позволяет отнести его к высокоэффективным препаратам противогерпетического действия.

ПРИМЕР 4.

ПРОФИЛАКТИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ МИДИЙНОГО ГИДРОЛИЗАТА НА ВГ-2.

Из пробирок с монослоем перевиваемой культуры клеток Vero удаляли ростовую среду и вносили в каждую по 0,8 мл поддерживающей среды (среда Игла-МЕМ с добавлением 2 об.% эмбриональной сыворотки), содержащей не токсичную для культуры клеток дозу мидийного гидролизата в разведении - 1:64 (опытный ряд), в контрольные пробирки - по 0,8 мл только поддерживающей среды. Через 2 часа контакта при 361oC в опытные и контрольные пробирки вносили по 0,2 мл вируса герпеса тип 2 (ВГ-2, штамм Внуково-2), разведенного в поддерживающей среде в дозах 10, 100, 1000 и 10.000 ИТД50 (инфицирующая тканевая доза). На каждое разведение вируса в опытном и контрольном рядах использовали по 6 пробирок. Пробирки встряхивали и помещали в термостат при температуре 37oC. Кроме того, в опыте ставили контроли культуры клеток и рабочей дозы препарата (токсичность). За опытными и контрольными пробирками наблюдали (микроскопирование, цитопатогенный эффект) в течение 5 суток.

Все последующие процедуры проводили, как в примере 1.

Оказалось, что при множественности инфицирования, соответствующей 10, 100, 1000 и 10.000 ИТД50 ингибиция вируса под влиянием рабочей дозы препарата на 3 сутки составила 2,0; 1,5; 2,5 и 2,0 лог. соответственно (табл. 4).

Ингибирующая активность препарата была значительно выше на 5 сутки и составила при вышеуказанных дозах 3,0; 3,0; 3,5; и 3,0 лог. ИТД50 соответственно.

По степени ингибиции инфекционной активности ВГ-2, мидийный гидролизат относится к высокоактивным препаратам профилактического противогерпетического действия, то есть препарат в рабочей дозе 1:64 снижает титр вируса на 3,0-3,5 лог. , то есть в 1000-10.000 раз. Это наблюдается даже при высокой множественности инфицирования (ИТД = 10.000).

ПРИМЕР 5.

ЛЕЧЕБНОЕ ДЕЙСТВИЕ МИДИЙНОГО ГИДРОЛИЗАТА НА ВГ-2.

Из пробирок с монослоем перевиваемой культуры клеток Vero удаляли ростовую среду и вносили в каждую по 0,2 мл ВГ-2 (штамм Внуково-2), разведенного в поддерживающей среде в дозах 10, 100, 1000 и 10.000. Контакт вируса с клетками - 2 часа при 361oC. Через 2 часа после инфицирования культуры клеток вирус из пробирок удаляли; 3-х кратно тщательно отмывали раствором Хенкса, а затем в опытные ряды пробирок добавляли по 1 мл поддерживающей среды, содержащей рабочую дозу мидийного гидролизата в разведении 1:64, в контрольные - по 1,0 мл поддерживающей среды. На каждую дозу вируса в опыте и контроле использовали по 6 пробирок. Пробирки встряхивали и помещали в термостат при температуре 361oC.

Дополнительные контроли и все доследующие процедуры проводили, как в примере 1.

За опытными и контрольными пробирками наблюдали (микроскопирование, цитопатогенный эффект) в течение 5 суток.

Как видно из таблицы 5, при различной множественности инфицирования ингибиция вируса под влиянием рабочей дозы препарата, введенного после инфицирования культуры, на 3 сутки колебалась от 1,5 до 2,0 лог.; на 5 сутки составила - 2,5-3,5 лог.

Ингибиция вируса была высокой даже при множественности инфицирования ИТД = 10.000.

Таким образом, мидийный гидролизат, испытанный по лечебной схеме, снижает инфекционный титр вируса герпеса 2 типа на 2,5-3,5 лог., то есть в 300-3000 раз.

На основе мидийного гидролизата были изготовлены фармацевтические композиции в виде мазей, линиментов или гелей. В качестве фармацевтических носителей фармацевтические композиции содержат водорастворимые полимеры, также как поливинилпирролидон с молекулярной массой (ММ) 10000-12000 или с ММ выше 100000, полиэтиленоксид с ММ 400, блоксополимеры этиленоксида с пропиленоксидом, такие как лутрол F127 фирмы BASF или проксанол 268, а также вазелин, глицерин, пропиленгликоль, касторовое масло и др. Композиции включают эмульгаторы, такие как смесь спиртов фракции (C16-C20) и натриевых солей сульфоэфиров этих же спиртов, взятых в соотношении 25:1, или смесь эфиров полиглицирина и стеариновой кислоты, а также метилцеллюлозу или натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы. В состав композиций может входить консервант, например метиловый эфир пара-гидроксибензойной кислоты.

Получение композиций описано в примерах 6-12.

ПРИМЕР 6.

80 г мидийного гидролизата помещают в стакан и нагревают на водяной бане до 70oC. При перемешивании в нем растворяют 0,1 г метилового эфира пара-гидроксибензойной кислоты и 1,5 г поливинилпирролидона с ММ 10000-12000. Затем при перемешивании постепенно вводят 4,5 г натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы, смесь охлаждают на водяной бане. В полученный раствор при перемешивании вводят 10 г глицерина и 3,9 г пропиленгликоля. Смесь гомогенизируют в течение 5 мин в лабораторном турбосмесителе. Полученный слаботекучий гель расфасовывают в тубы.

ПРИМЕРЫ 7-9.

Гель готовят как в примере 6, меняя составляющие фармацевтического носителя и количество используемого мидийного гидролизата. Состав композиций приведен в табл. 6.

ПРИМЕР 10.

В 70 г мидийного гидролизата растворяют 3 г натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы. К полученному раствору добавляют 20 г касторового масла, 6,9 г измельченного эмульгатора-смеси жирных спиртов фракции C16-C20 с натриевыми солями сульфоэфиров этих же кислот, - и 0,1 г метилового эфира пара-гидроксибензойной кислоты. Смесь при перемешивании нагревают на водяной бане до 65oC и перемешивают при этой температуре до полного расплавления эмульгатора. Смесь эмульгируют с помощью лабораторного смесителя. Полученный линимент охлаждают и расфасовывают.

ПРИМЕРЫ 11 И 12.

Мази готовятся как в примере 10, меняя составляющие фармацевтических носителей и количество мидийного гидролизата.

Состав композиций приведен в табл. 6.

Фармацевтическую активность заявляемой композиции сравнили с фармацевтической активностью композиции-прототипа (препарата веролекс). Данные представлены в таблице 7.

Из таблицы 7 видно, что заявляемая композиция обладает сопоставимой с ацикловиром (веролекс) ингибирующей активностью в отношении вирусов герпеса 1 и 2 серотипов. Кроме того, заявляемая композиция обладает интерфероногенной активностью, что свидетельствует о более широком спектре применимости заявляемой композиции.

Ацикловир (веролекс) интерферогенной активностью не обладает.

Композиции на основе мидийного гидролизата не обладают местным побочным действием и могут быть использованы при поражении слизистых. Не отмечалось формирования резистентных штаммов вируса герпеса при использовании композиции на основе мидийного гидролизата. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



Фармацевтическая композиция для лечения герпеса, включающая средство, обладающее антивирусной активностью в отношении вирусов герпеса 1-го и 2-го типов, и фармацевтический носитель, отличающаяся тем, что в качестве средства, обладающего антивирусной активностью, композиция содержит мидийный гидролизат из мяса морских моллюсков-мидий семейства Mytilidae, взятый в количестве 8,4 - 25,2 мг (по сухому остатку) на 1 г композиции.