СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МИЕЛОПИДА

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МИЕЛОПИДА


--- Закажите полную версию данного патента ---
RU (11) 2041716 (13) C1

(51) 6 A61K35/28 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 17.09.2007 - прекратил действие 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 1995.08.20 
(21) Регистрационный номер заявки: 93001102/14 
(22) Дата подачи заявки: 1993.01.05 
(45) Опубликовано: 1995.08.20 
(56) Аналоги изобретения: Авторское свидетельство СССР N 1005790, кл. A 61K 39/00, 1982. 
(71) Имя заявителя: Петров Рэм Викторович; Михайлова Августа Алексеевна; Захарова Людмила Алексеевна; Степаненко Родион Николаевич; Сорокин Сергей Викторович; Красильников Игорь Викторович; Буданов Михаил Валентинович 
(72) Имя изобретателя: Петров Рэм Викторович; Михайлова Августа Алексеевна; Захарова Людмила Алексеевна; Степаненко Родион Николаевич; Сорокин Сергей Викторович; Красильников Игорь Викторович; Буданов Михаил Валентинович 
(73) Имя патентообладателя: Петров Рэм Викторович; Михайлова Августа Алексеевна; Захарова Людмила Алексеевна; Степаненко Родион Николаевич; Сорокин Сергей Викторович; Красильников Игорь Викторович; Буданов Михаил Валентинович 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МИЕЛОПИДА 

Изобретение относится к медицине, а именно, к способу получения иммуномодулятора миелопида. Предложенный способ заключается в том, что клетки костного мозга свиньи культивируют в питательной среде, отделяют супернатант центрифугированием, последний подвергают ультрафильтрации на мембранах с порогом проницаемости 10.000 Да при температуре от +4°С до комнатной, затем концентрируют лиофилизацией, проводят гель-хроматографию на сефадексе G 25, отобранные фракции с молекулярной массой 600 3000 Д повторно концентрируют лиофилизацией. Предложенный способ по сравнению с известным, позволяет получить миелопид с большей иммуностимулирующей активностью, что влечет за собой снижение лечебной дозы препарата и увеличение числа доз, получаемых из одного и того же количества клеток костного мозга. 2 табл. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии и может быть использовано в производстве иммунологически активного препарата миелопида.

Описан способ получения миелопида, ранее известного как стимулятор антителопродуцентов, путем выделения клеток из костного мозга свиньи, их культивирования в питательной среде, отделения супернатанта центрифугированием, концентрирования и выделения целевого продукта гельхроматографией на колонке, заполненной сефадексом G-50. Фракции, элюированные в области выхода цитохрома G с молекулярной массой около 13000 Da, концентрируют лиофилизацией.

Известен также способ получения миелопида путем культивирования клеток костного мозга в питательной среде, отделения супернатанта центрифугированием, концентрирования, гельфильтрации концентрированного супернатанта на колонке с сефадексом G-25, отбора фракций с мол.массой 1000-2000 и обессоливание на колонке с сефадексом С-10. Готовый продукт высушивают лиофилизацией.

Недостатком известных способов является небольшой выход препарата (из 1 кг незачищенных костей, 1,0.1010 клеток костного мозга получают 25-30 доз препарата) и его низкая удельная активность. Миелопид стандартизировали так, чтобы 1 доза препарата содержала 3 мг белка, определенного методом Лоури. Индекс стимуляции составлял не менее 1,6 при концентрации препарата 50 мкг/мл.

Цель изобретения повышение иммуностимулирующей активности миелопида.

Поставленная цель достигается тем, что клетки костного мозга свиней культивируют в питательной среде, супернатант отделяют центрифугированием, подвергают ультрафильтрации на мембранах с порогом проницаемости 10.000 Da при температуре от +4оС до комнатной, затем концентрируют лиофилизацией, проводят гель-хроматографию на сефадексе G-25, отобранные фракции с молекулярной массой 600-3000 Da повторно концентрируют лиофилизацией.

Отличительным приреалом способа является то, что выделение целевого продукта проводят ультрафильтрацией на мембранах с порогом проницаемости 10.000 Da при температуре от +4оС до комнатной.

Более подробно способ осуществляют следующим путем.

Костный мозг из реберных костей свиней после их измельчения вымывают встряхиванием в термостатируемом шейкере при 37оС в течение 1 ч в бессывороточной питательной среде 199. Далее клетки отмывают двукратным центрифугированием и помещают в среду для культивирования. Среда для культивирования готовится на основе 199 среды. Культивирование осуществляют в термостатируемом шейкере или в роллерной установке при 37оС в течение 20 ч. Супернатант отделяют от клеточной массы центрифугированием при температуре +4оС со скоростью 8000 об/мин в течение 20 мин.

Полученный супернатант культуры клеток костного мозга подвергают ультрафильтрации на кассетах фирмы "Миллипор" с порогом проницаемости 10000 Da при температуре от +4оС до комнатной и избыточном давлении на входе системы 0,5 атм. Полученный на выходе стерильный ультрафильтрат лиофилизируют при температуре (-30)-0оС. Сухой лиофилизированный продукт растворяют в стерильной апирогенной воде, центрифугируют, осветленный концентрат подвергают микрофильтрации, а затем гель-хроматографии на колонке, заполненной сефадексом G-25, отобранные фракции с молекулярной массой 600-3000 Da повторно подвергают лиофилизации. Из 1 кг сырья (1,0х1010 клеток) получают 250-300 доз препарата.

Проверка заявленного технического решения на соответствие его критерию "Изобретательский уровень" показала, что ни в патентной ни в научно-технический литературе не обнаружено совокупности признаков, приведенной в формуле изобретения.

Ниже приводятся конкретные примеры исполнения способа и анализа биологических свойств миелопида.

П р и м е р 1. 25 кг зачищенных реберных костей свиней измельчают в стерильных условиях. К гомогенизату добавляют 3 литра стерильной 199 среды. Суспензию встряхивают на шейкере при 37оС в течение 1 ч для вымывания клеток костного мозга. Фильтрацией отделяют содержащий клетки супернатант объемом 3 л. Клетки дважды отмывают центрифугированием 199 средой при температуре +4оС. Полученные клетки объемом 50 мл (15-25.1010) заливают 25 л и 199 среды, доводя концентрацию клеток до 1010 клеток/литр и инкубируют в течение 20 ч при 37оС. Клетки отделяют центрифугированием при 5000 об/мин при температуре +4оС. Супернатант объемом 25 л подвергают ультрафильтрации на мембранах фирмы "Millipor" проницаемостью 10.000 дальтон при давлении не более 0,5 атм и температуре +4оС. Полученный фильтрат объемом 23 л лиофильно высушивают при температуре (-30оС)-0оС. Сухой продукт растворяют при +4оС в 350 мл апирогенной стерильной воды в течение 30 мин при интенсивном перемешивании. Нерастворившийся осадок отделяют центрифугированием при 8000 об/мин при +4оС в течение 20 мин. Супернатант объемом 300 мл стерильно фильтруют на фильтре с диаметром пор 0,2 мкм и наносят на колонку с сефадексом G-25 размером 10х100 см. Гель-хроматографию проводят в стерильных условиях при +4оС, используя в качестве элюата 10 mМ фосфатный буфер рН 7,00, отбирая фракцию с мол. массой, соответствующей 2000 Da. Концентрацию миелопида в полученном элюате доводят до 0,1-0,2 мг/мл добавлением стерильного 10 mМ фосфатного буфера рН 7,0. Раствор миелопида стерильно фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм, разливают во флаконы по 3 мл и лиофильно высушивают при температуре (-30)-0оС.

Выход продукта составляет 300 доз препарата с содержанием белка по Лоури 0,3-0,6 мг/дозу. Коэффициент стимуляции составляет при этом 1,9.

П р и м е р 2. Способ осуществляют аналогично описанному в примере 1, но проводят ультрафильтрацию на мембранах с порогом проницаемости 10000 Da при комнатной температуре.

Выход миелопида 350 доз (из 1010 клеток костного мозга) с коэффициентом стимуляции 1,8.

П р и м е р 3. Эффект стимуляции антителообразования оценивают на пике иммунного ответа к эритроцитам барана in vitro, добавляя тестируемый материал в культуру клеток лимфатических узлов, полученных от мышей на четвертые сутки после иммунизации.

Коэффициент стимуляции рассчитывают как отношение количества антителообразующих клеток (АОК) в культуре с тестируемым образцом к количеству АОК в контрольной культуре.

Антителостимулирующий эффект миелопида, полученного известным и предложенным способами, приведен в табл.1.

Из данных табл.1 следует, что миелопид, полученный предложенным способом, имеет в 100 раз большую удельную активность.

Антителостимулирующий эффект миелопида при разных температурах процесса ультрафильтрации приведен в табл.2.

Проведение процесса ультрафильтрации при температуре выше комнатной или ниже +4оС приводит к снижению выхода и потере активности препарата.

Миелопид, полученный по предлагаемому способу, имеет в 100 раз большую удельную иммуностимулирующую активность, что позволяет снизить дозу вводимого препарата при лечении и из одного и того же количества клеток костного мозга получать в 10 раз больше доз. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МИЕЛОПИДА путем приготовления суспензии клеток костного мозга свиньи, их инкубирования в питательной среде, отделения супернатанта с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что целевой продукт дополнительно очищают ультрафильтрацией на мембранах с порогом проницаемости 10 000 D а при температуре от +4oС до комнатной и гельфильтрацией на сефадексе G 25, и отбирают фракцию с молекулярной массой 600 3 000 Dа.




ПРОЧИТАТЬ НУЖНО ВСЕМ !
Судьба пионерских изобретений и научных разработок, которым нет и не будет аналогов на планете еще лет сорок, разве что у инопланетян



Независимый научно технический портал

Подборка патентов изобретений и технологий относящихся к медицине, а именно:
  • Все от зачатия и до рождения ребенка. Акушерство, гинекология, сексология и сексопатология

  • Гастроэнтерология, гепатология и панкреатология

  • Дерматология и дерматовенерология

  • Иммунология. Способы диагностики и лечения (ВИЧ) и приобретенного иммунодефицита (СПИД)

  • Кардиология и кардиохирургия

  • Фармацевтика. Лекарственные и косметические средства и композиции

  • Медицинская техника

  • Наркология. Средства выявления и профилактики различного вида зависимостей

  • Неврология, невропатология и неонатология

  • Онкология и радиология

  • Оториноларингология

  • Офтальмология

  • Вирусология, паразитология и инфектология

  • Педиатрия и неонатология

  • Психиатрия, психотерапия

  • Пульмонология и фтизиатрия

  • Стоматология

  • Способы диагностики функционального состояния организма человека

  • Травматология, артрология и ортопедия

  • Терапия. Мануальная терапия. Физиотерапия. Рефлексотерапия. Биотерапия и фитотерапия

  • Урология, нефрология и андрология

  • Физиотерапия

  • Хирургия

  • Эндокринология

  • Косметология. Санитария и гигиена


Медицина






СОВЕРШЕННО БЕСПЛАТНО!
Вам нужна ПОЛНАЯ ВЕРСИЯ данного патента? Сообщите об этом администрации портала. В сообщении обязательно укажите ссылку на данную страницу.


ПОИСК ИНФОРМАЦИИ В БАЗЕ ДАННЫХ


Режим поиска:"и" "или"

Инструкция. Ключевые слова в поле ввода разделяются пробелом или запятой. Регистр не имеет значения.

Режим поиска "и" означает, что будут найдены только те страницы, где встречается каждое из ключевых слов. Например, при запросе "лечение бесплодия" будет найдено словосочетание "лечение бесплодия". При использовании режима "или" результатом поиска будут все страницы, где встречается хотя бы одно ключевое слово ("лечение" или "бесплодия").

В любом режиме знак "+" перед ключевым словом означает, что данное ключевое слово должно присутствовать в найденных файлах. Если вы хотите исключить какое-либо слово из поиска, поставьте перед ним знак "-". Например: "+лечение -бесплодия".

Поиск выдает все данные, где встречается введенное Вами слово. Например, при запросе "бесплодие" будут найдены слова "бесплодия", "бесплодию" и другие. Восклицательный знак после ключевого слова означает, что будут найдены только слова точно соответствующие запросу "бесплодие!".

Акушерство, гинекология, сексология и сексопатология | Гастроэнтерология, гепатология и панкреатология | Дерматология и дерматовенерология | Иммунология. Вирусология. Способы лечения синдрома приобретенного иммунного дефицита (спид) | Кардиология и кардиохирургия | Лекарственные и косметические средства и композиции | Медицинская техника | Наркология. Средства выявления и профилактики различного вида зависимостей | Неврология, невропатология и неонатология | Онкология и радиология | Оториноларингология | Офтальмология | Вирусология, паразитология и инфектология | Педиатрия и неонатология | Психиатрия, психотерапия и психофизиология | Пульмонология и фтизиатрия | Стоматология | Травматология. Артрология и ортопедия | Терапия. Мануальная терапия. Физиотерапия. Рефлексотерапия. Биотерапия и фитотерапия. Диагностика заболеваний и функционального состояния организма человека | Урология, нефрология, андрология | Хирургия | Эндокринология | Косметология


Rambler's Top100 Webalta Уровень доверия Цитирование