СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИММУНОДЕФИЦИТНЫХ СОСТОЯНИЙ

СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИММУНОДЕФИЦИТНЫХ СОСТОЯНИЙ


--- Закажите полную версию данного патента ---
RU (11) 2157235 (13) C1

(51) 7 A61K38/08 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 29.08.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2000.10.10 
(21) Регистрационный номер заявки: 99121021/14 
(22) Дата подачи заявки: 1999.10.08 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 1999.10.08 
(45) Опубликовано: 2000.10.10 
(56) Аналоги изобретения: US 4584284, Apr.22.1986. RU 2062096 C1, 20.06.1996. RU 2036930 C1, 09.06.1995. Goldstein G et al. Thymopoetin to Thymopoetin: Experimental Studies - Sur V immunol. Res. 4: Suppl.1, 1985, p. 1- 10. 
(71) Имя заявителя: Лебедев Василий Вячеславович 
(72) Имя изобретателя: Лебедев В.В.; Тутельян А.В.; Данилина А.В.; Шелепова Т.М.; Степанов О.Г.; Зюзина Е.Л. 
(73) Имя патентообладателя: Лебедев Василий Вячеславович 
(98) Адрес для переписки: 105023, Москва, ул.Б.Семеновская 49, оф. 404, Центр "ИННОТЭК", Вахниной Т.А. 

(54) СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИММУНОДЕФИЦИТНЫХ СОСТОЯНИЙ 

Средство может быть использовано в медицине и фармакологии для лечения иммунодефицитных состояний. В качестве средства для лечения предложен циклогексапептид структурной формулы цикло-лизил-гистидил-глицил-лизил-гистидил-глицин. Дополнительно средство содержит стабилизатор (наполнитель) глицин. Средство обладает высокой эффективностью действия в отношении стимуляции гуморального иммунитета, силы иммунного ответа и молекул межклеточного взаимодействия для терапии иммунодефицитных состояний. 2 з.п.ф-лы, 2 табл. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии, и может быть использовано для профилактики и лечения иммунодефицитных состояний различной этиологии.

В современной иммунофармакологии имеется определенный арсенал лекарственных средств, содержащих пептиды и используемых при лечении иммунодефицитных состояний у больных с врожденной (синдром Луи- Барр) и приобретенной иммунной патологией, вызванной инфекцией и злокачественными новообразованиями.

Известно применение комплекса пептидов тимуса - Тактивина при врожденных нарушениях иммунитета (синдром Louis-Bar) и у больных лимфогранулематозом [(Lopukhin J.M., Petrov R.V. et al., Pat. 4377511 (USA) // C.A. - 1983]. Тактивин вызывает значительное улучшение состояние Т-клеточного иммунитета, улучшение нервно-мышечной проводимости у лиц с синдромом Louis-Bar, сокращение явлений интоксикации у больных лимфогранулематозом. Однако известный препарат не оказывает выраженного действия на показатели силы иммунного ответа и продукцию антител, что ограничивает область его применения. Кроме того, Тактивин представляет собой неразделенную смесь пептидов и не подлежит надежной стандартизации.

Наиболее близким аналогом предложенного средства является препарат бурсопоэтин, полученный на основе синтетического трипептида Lys-His-Gly-NH2 (лизил-гистидил-глицил-амид) [Audhya Т., Kroon D.J., Heavner G., Goldstein G. Bursopoietin. Pat. 4584284 (USA) //C.A. - 1986. - Vol. 105. - 173063n.]. Препарат стимулирует дифференцировку В-лимфоцитов и может быть использован для лечения больных с нарушениями гуморального звена иммунитета.

Предложенное изобретение направлено на создание лекарственного средства с более высокой эффективностью действия в отношении стимуляции гуморального иммунитета (антителогенеза), силы иммунного ответа и молекул межклеточного взаимодействия для терапии врожденных и приобретенных иммунодефицитных состояний.

Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что в качестве средства для лечения иммунодефицитных состояний различной этиологии используется циклогексапептид структурной формулы: цикло-лизил-гистидил-глицил-лизил-гистидил-глицин. Брутто-формула: C28H44O6N12.

Предложенное средство содержит в качестве действующего вещества синтетический гексапептид, молекулярная масса 644,7 Д.

Действующее вещество представляет собой белый порошок без запаха, легко растворимый в воде и изотоническом растворе хлорида натрия. Вещество не растворимо в спирте и хлороформе.

Предложенное средство для лечения иммунодефицитных состояний содержит 0,001-1% (0,00001-0,01 г) циклогексапептида. В качестве стабилизатора (наполнителя) средство содержит 0,05-5% (0,0005-0,05 г) глицина. Лекарственное средство выпускают в виде 0,005% раствора циклогексапептида для подкожных или внутримышечных инъекций в ампулах по 1,0 мл. В качестве стабилизатора предложенное средство содержит 0,5%-ный раствор глицина. Срок хранения 2 года при 4-8oC.

Лекарственное средство разработано в научно-производственном предприятии "Бионокс" и из его структурной формулы с очевидностью не следуют свойства стимулировать гуморальный иммунитет, усиливать силу иммунного ответа (экспрессия HLA-DR на поверхности гемопоэтических клеток), а также активировать Т-звено иммунитета с достижением лечебного эффекта.

Результаты доклинического и клинического изучения предложенного средства показывают, что оно не вызывает побочных действий.

Экспериментальные и клинические данные показывают, что:

1. Циклогексапептид стимулирует образование антителообразующих клеток в 2 раза эффективнее по сравнению с веществом по прототипу (см. табл. 1), предупреждает возникновение бактерионосительства и активирует продукцию секреторного lgA (Sig A).

2. Заявленное средство стимулирует силу иммунного ответа по критерию экспрессии антигенов HLA DR лимфоцитов человека; активирует межклеточные взаимодействия по показателю экспрессии антигена CD2. Напротив, вещество по прототипу подавляет экспрессию антигенов силы иммунного ответа (HLA DR) и межклеточного взаимодействия (CD2) (см. табл. 2).

3. Циклогексапептид обладает исключительно низкой токсичностью и обеспечивает широкий резерв безопасности. Разовая доза, в тысячу раз превышающая среднюю терапевтическую, не вызывает гибели экспериментальных животных.

4. Определение хронической токсичности лекарственного средства демонстрирует его безвредность. Выявленные колебания гематологических и биохимических показателей при назначении животным лекарственного средства ежедневно, в течение одного месяца, в терапевтической или 10-ти кратно превышающей терапевтическую дозе, после отмены лекарственного средства возвращается к исходному уровню.

5. Введение лекарственного средства больным не вызывает местно раздражающего действия, лекарственное средство не обладает аллергенностью и мутагенной активностью.

Лекарственное средство показало хорошие клинические результаты при лечении инфекционных больных со сниженной функцией гуморального звена иммунитета.

Клиническое применение лекарственного средства у больных с гипопродукцией секреторного иммуноглобулина А проводят с учетом клинико-иммунологического состояния пациентов. Так, в популяции населения наличие секреторного иммуноглобулина А (Sig А) отмечается в 60,910,4% случаев. У инфекционных больных после традиционного лечения соответственно в 69,07,1% случаев. Нарушение продукции Sig А является причиной бактерионосительства и низкой эффективности терапии бактериальных инфекций. Применение лекарственного средства вызывает активацию местного иммунитета и появление Sig А в 100,0% случаев.

В связи с этим перед назначением лекарственного средства определяют состояние гуморального иммунитета и количество Sig А в слюне больных.

Эффективность терапии оценивают по положительной динамике количества секреторного иммуноглобулина А, устранению бактерионосительства и снижению явлений интоксикации. Назначение лекарственного средства больным проводят в комплексной терапии с антибиотиками и средствами патогенетической терапии. Лекарственное средство назначают курсами для подкожного или внутримышечного введения в дозе 0,5 - 5 мкг/кг массы тела однократно, ежедневно или с интервалом 1-3 дня в течение 7-15 дней. При необходимости по клинико-иммунологическим показателям проводят повторные курсы в течение 1-3 недель.

Конкретные примеры получения предложенного средства, описания биологических и лечебных свойств лекарственного средства.

Пример 1. Циклогексапептид синтезируют по методу твердофазного синтеза на автоматизированном синтезаторе "Beckman-990".

Аминометилполимеразе (1.8 г, 1 ммоль) дают набухнуть в хлороформе в течение 30 минут, затем присоединяют Boc Gly-OCH2C6H4CH2COOH (0,65 г, 2 ммоль) с помощью N,N-дициклогексилкарбодиимид (ДЦГК) (0,4 г, 2 ммоль в 15 мл хлороформа в течение 2 часов). После промывки диметилформамидом полимер обрабатывают 20 мл смеси диизопропилэтиламин-уксусный ангидрид, 2:1 в течение 30 минут. После промывки диметилформамидом и хлороформом полимер обрабатывают 30 мл смеси трифторуксуная кислота - хлороформ 1:1 20 минут, промывают хлороформом и нейтрализуют 7% раствором диизопропилэтиламина в диметилформамиде в течение 10 минут, затем аминоацилполимер промывают диметилформамидом. Присоединения Boc-аминокислоты проводят с помощью симметричного ангидрида Boc-аминокислоты: 4 ммоль Boc-аминокислоты растворяют в 5 мл хлороформа, охлаждают до 0oC, добавляют раствор 2 ммоль ДЦГК в 5 мл хлороформа. После перемешивания в течение 10 минут при 0oС смесь добавляют к пептидилполимеру, приливают 10 мл диметилформамида и перемешивают с пептидилполимером 30 минут при 28oC.

После присоединения очередной аминокислоты пептидилполимер промывают диметилформамидом, хлороформом, затем удаляют защитную Boc-группу.

Удаление динитрофенильной группы: 2 г пептидилполимера перемешивают в течение 1,5 часов при комнатной температуре в 40 мл 20% раствора тиофенола в диметилформамиде. Затем пептидилполимер промывают диметилфорамидом, хлороформом и сушат в вакууме.

Снятие пептида со смолы: 2 г пептидилполимера помещают в реакционный сосуд прибора для работы с фтористым водородом, добавляют 1 г n-крезола, охлаждают жидким азотом и после вакуумирования сосуда перегоняют в него 10 мл жидкого безводного фтористого водорода. Доводят температуру реакционного сосуда до -20oC и перемешивают полимер в течении 30 минут поддерживая температуру смеси CCl4-твердый CO2, затем помещают реакционный сосуд в ледяную баню и выдерживают при перемешивании еще 30 минут. После этого фтористый водород упаривают на водоструйном насосе, полимер промывают на фильтре диэтиловым эфиром. Затем пептид экстрагируют 20% уксусной кислотой и лиофилизируют.

Циклизация пептида: снятый со смолы пептид очищают с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Затем пептид (50 мг) растворяют в 25 мл диметилформамида и добавляют по каплям при перемешивании и охлаждении до 0oC к раствору диметилфосфорилазида (10 экв) в 25 мл диметилформамида, в котором суспендирован кристаллический карбонат калия. Суспензию перемешивают в течение 2 суток, после чего отфильтровывают карбонат калия и упаривают диметилформамид.

Удаление трифторацетильной группы. Снятый со смолы пептид обрабатывают 60 мл одномолярного водного раствора пиперидина при 0oC в течение 2 часов. Затем реакционную смесь лиофилизируют и обессоливают гельфильтрацией на колонке Sephadex G-25 в 5% уксусной кислоте.

Пример 2. Исследование влияния предложенного лекарственного средства и бурсопоэтина (вещества по прототипу) на продукцию антителообразущих клеток в селезенке мышей.

Используют мышей-самцов линии CBA/CaLacSto, которых иммунизируют внутривенно эритроцитами барана в дозе 2106. Через 10-15 минут после иммунизации мышам внутрибрюшинно вводят заявленное вещество и вещество по прототипу в объеме 0,5 мл в концентрациях 0,02; 0,1; 0,5 и 2,5 мкг/мл (7-8 животных в группе). Мышам контрольной группы (7-8 животных в группе) внутрибрюшинно вводят аналогичный объем физиологического раствора. На четвертые сутки после иммунизации определяют число антителообразующих клеток в селезенке мыши путем подсчета зон локального гемолиза эритроцитов барана в агарозном геле. Результаты исследования представлены в таблице 1.

Полученные данные демонстрируют, что циклогексапептид (заявленное средство) вызывает двукратное превышение образования антителообразующик клеток в селезенке мыши по сравнению с действием вещества по прототипу. Таким образом, заявленное средство обладает более высокой активностью по признаку стимуляции антителогенеза, чем вещество по прототипу.

Пример 3. Исследование влияния циклогексапептида и вещества по прототипу (бурсопоэтина) на экспрессию маркера силы иммунного ответа (HLA-DR), маркеров Т-лимфоцитов (CD2, CD4) и B-лимфоцитов (CD22) клетками практически здоровых доноров.

В работе используют клетки периферической крови человека. Для получения фракции мононуклеарных клеток из гепаринизированной (25 ЕД/мл) крови применяют одноступенчатый градиент фиколл-верографина с плотностью 1,077 г/см3.

Уровень экспрессии мембраноассоциированных структур CD2, CD4, CD22, HLA-DR на мононуклеарных клетках определяют клеточным твердофазным иммунопероксидазным методом, с использованием моноклональных антител к структурам CD2, CD4, CD22, HLA-DR ("Seromed, Великобритания) и антимышиных F(ab')-фрагментов иммуноглобулинов, конъюгированных с пероксидазой хрена ("Seromed, Великобритания). Анализ проводят после часовой инкубации клеток в присутствии 0,02: 0,1; 0,5; 2,5 мкг/мл изучаемого вещества и вещества по прототипу. В контрольных опытах мононуклеарные клетки инкубируют в аналогичных условиях в культуральной среде без добавления веществ. Культивирование клеток проводят в среде RPMI- 1640 с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки, в конечном объеме 3 мл и концентрацией 2106/мл.

Иммуноферментный анализ проводят на плоскодонных планшетах ("Nunc", Дания), предварительно обработанных 0,001% раствором поли-L-лизина ("Sigma", США) на фосфатно-солевом буфере, рН 7,3. Изучаемые клетки вносят в концентрации 4106/мл, по 50 мкл на лунку. После центрифугирования клетки фиксируют с помощью 50 мкл 0,5% раствора глутарового альдегида ("Sigma", США) на фосфатно-солевом буфере в течение 15 минут. Планшеты трижды промывают фосфатно-солевым буфером и затем обрабатываются М раствором глицина ("Sigma", США), после чего в лунки вносят 1% раствор бычьего сывороточного альбумина на фосфатно-солевом буфере и инкубируют в течение 12-14 часов при +4oC. При постановке реакции в лунки вносят по 100 мкл соответствующих моноклональных антител, разведенных на фосфатно-солевом буфере с 0,5% раствором бычьего сывороточного альбумина, инкубируют в течение 1 часа при +37oC. После отмывок 0,01% раствором Твина 20 ("Merck", Германия) на фосфатно-солевом буфере, наносят конъюгат ("Sigma", США) в объеме 100 мкл на лунку, инкубируют, отмывают и добавляют раствор субстрата - ортофенилендиамин ("Sigma", США) в 0,1 М цитрат-фосфатном буфере, pH 4,5 и 0,004% перекиси водорода. После инкубации в течение 30 минут реакцию останавливают IN серной кислотой и оценивают спектрофотометрически, определяя уровни поглощения при длине волны 492 нм. Результаты выражают в проценте изменения значений оптической плотности в опыте, по отношению к значению оптической плотности в контроле (клетки, не обработанные веществом), с учетом контроля реакции, в качестве которого используют систему без моноклональных антител, позволяющую выявить фон естественной пероксидазной активности и неспецифической сорбции конъюгата на клетках. Каждую опытную группу клеток исследуют в триплете.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводят с определением достоверности разности по критерию Стьюдента-Фишера. Определяют достоверность различий выборочных средних опыта и контроля. По вычисленному значению t и количеству сравниваемых вариант определяют достоверность различий, используя таблицу Стьюдента-Фишера. Разницу считают достоверной при уровне значимости не более 5% (p<0,05).

Полученные данные демонстрируют, что циклогексапептид (заявленное вещество) вызывает достоверное превышение экспрессии HLA-DR и CD2 на поверхности гемопоэтических клеток человека. Напротив, вещество по прототипу вызывает снижение экспрессии указанных поверхностных структур. Таким образом, заявленное вещество в отличие от прототипа обладает свойством увеличивать экспрессию генов иммунного ответа (HLA-DR) и созревание Т-лимфоцитов (CD2).

Пример 4. Больной Г., 25 лет. Клинический диагноз: сальмонеллез, гастроинтестинальная форма, среднетяжелое течение.

Заболел остро: сильные боли в животе схваткообразного характера, жидкий стул со слизью, многократная рвота, температура тела повысилась до 39oC.

При лабораторном обследовании пациента отмечено: РПГА с сальмонеллезным антигеном: сыворотка крови 1:20; слюна 1:4. Иммуноглобулины сыворотки крови: lgA - 2,97 мг/мл, lgG - 12,45 мг/мл, lgM - 0,43 мг/мл; слюны lgA - 0,19 мг/мл, Sig А - отс. , lgG - 0,25 мг/мл, lgM - следы. Бактериологическое исследование испражнений: S. Typhimurium (гр. В).

Лечение. Трисоль, глюкоза 5% в/в кап., сульгин 1,0 х 4 раза в сутки. Циклогексапептид 1,0 мл. 0,005% раствора 1 раз в день в/м в течение 7 дней.

На десятый день болезни бактериологическое исследование испражнений на сальмонеллы отрицательно, РПГА с сальмонеллезным антигеном: сыворотка крови 1:1280, слюна 1:64. Иммуноглобулины сыворотки крови: lgA - 5,70 мг/мл, lgG - 13,40 мг/мл, lgM - 0,88 мг/мл; слюны: lgA - 0,16 мг/мл, Sig А - 0,42 мг/мл, lgG - 0,22 мг/мл, lgM - следы. На 12 день болезни с выздоровлением больной выписан из стационара. Побочных реакций на введение препарата не отмечено.

Таким образом, заявленное средство обладает выраженным терапевтическим действием, предупреждает появление бактерионосительства и стимулирует продукцию секреторного lgA. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



1. Средство для лечения иммунодефицитных состояний, содержащее пептид, отличающееся тем, что в качестве пептида оно содержит циклогексапептид структурной формулы цикло-лизил-гистидил-глицил-лизил-гистидил-глицин.

2. Средство по п. 1, отличающееся тем, что оно дополнительно содержит стабилизатор.

3. Средство по п.2, отличающееся тем, что в качестве стабилизатора оно содержит глицин.




ПРОЧИТАТЬ НУЖНО ВСЕМ !
Судьба пионерских изобретений и научных разработок, которым нет и не будет аналогов на планете еще лет сорок, разве что у инопланетян



Независимый научно технический портал

Подборка патентов изобретений и технологий относящихся к медицине, а именно:
  • Все от зачатия и до рождения ребенка. Акушерство, гинекология, сексология и сексопатология

  • Гастроэнтерология, гепатология и панкреатология

  • Дерматология и дерматовенерология

  • Иммунология. Способы диагностики и лечения (ВИЧ) и приобретенного иммунодефицита (СПИД)

  • Кардиология и кардиохирургия

  • Фармацевтика. Лекарственные и косметические средства и композиции

  • Медицинская техника

  • Наркология. Средства выявления и профилактики различного вида зависимостей

  • Неврология, невропатология и неонатология

  • Онкология и радиология

  • Оториноларингология

  • Офтальмология

  • Вирусология, паразитология и инфектология

  • Педиатрия и неонатология

  • Психиатрия, психотерапия

  • Пульмонология и фтизиатрия

  • Стоматология

  • Способы диагностики функционального состояния организма человека

  • Травматология, артрология и ортопедия

  • Терапия. Мануальная терапия. Физиотерапия. Рефлексотерапия. Биотерапия и фитотерапия

  • Урология, нефрология и андрология

  • Физиотерапия

  • Хирургия

  • Эндокринология

  • Косметология. Санитария и гигиена


Медицина






СОВЕРШЕННО БЕСПЛАТНО!
Вам нужна ПОЛНАЯ ВЕРСИЯ данного патента? Сообщите об этом администрации портала. В сообщении обязательно укажите ссылку на данную страницу.


ПОИСК ИНФОРМАЦИИ В БАЗЕ ДАННЫХ


Режим поиска:"и" "или"

Инструкция. Ключевые слова в поле ввода разделяются пробелом или запятой. Регистр не имеет значения.

Режим поиска "и" означает, что будут найдены только те страницы, где встречается каждое из ключевых слов. Например, при запросе "лечение бесплодия" будет найдено словосочетание "лечение бесплодия". При использовании режима "или" результатом поиска будут все страницы, где встречается хотя бы одно ключевое слово ("лечение" или "бесплодия").

В любом режиме знак "+" перед ключевым словом означает, что данное ключевое слово должно присутствовать в найденных файлах. Если вы хотите исключить какое-либо слово из поиска, поставьте перед ним знак "-". Например: "+лечение -бесплодия".

Поиск выдает все данные, где встречается введенное Вами слово. Например, при запросе "бесплодие" будут найдены слова "бесплодия", "бесплодию" и другие. Восклицательный знак после ключевого слова означает, что будут найдены только слова точно соответствующие запросу "бесплодие!".

Акушерство, гинекология, сексология и сексопатология | Гастроэнтерология, гепатология и панкреатология | Дерматология и дерматовенерология | Иммунология. Вирусология. Способы лечения синдрома приобретенного иммунного дефицита (спид) | Кардиология и кардиохирургия | Лекарственные и косметические средства и композиции | Медицинская техника | Наркология. Средства выявления и профилактики различного вида зависимостей | Неврология, невропатология и неонатология | Онкология и радиология | Оториноларингология | Офтальмология | Вирусология, паразитология и инфектология | Педиатрия и неонатология | Психиатрия, психотерапия и психофизиология | Пульмонология и фтизиатрия | Стоматология | Травматология. Артрология и ортопедия | Терапия. Мануальная терапия. Физиотерапия. Рефлексотерапия. Биотерапия и фитотерапия. Диагностика заболеваний и функционального состояния организма человека | Урология, нефрология, андрология | Хирургия | Эндокринология | Косметология


Rambler's Top100 Webalta Уровень доверия Цитирование