СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАРНОЗИНА

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАРНОЗИНА


RU (11) 2030422 (13) C1

(51) 6 C07K5/06, A61K38/05 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 29.08.2007 - прекратил действие 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 1995.03.10 
(21) Регистрационный номер заявки: 4817453/04 
(22) Дата подачи заявки: 1990.04.27 
(45) Опубликовано: 1995.03.10 
(56) Аналоги изобретения: Baumann L., Th.Ingvaldsen. - J.Biol.Chem., 1918, v.35, p.263-275. Reinrich H., Rebane T., Ma V., - J.Org.Chem., 1964, v.29, p.1968-1971. Turner R.a. - J.Am.Chem.Soc., 1953, v.75, p.2388-2390. Vinick F.J. Jung S. - J. Org.Chem., 1983, v.48, p.392-393. Глемжа А.А., Северин С.Е., Изв.акад.наук хим., 1966, N 5, с.861-864 (прототип). Davis N.C., Smith E.L., Biochem.prepar., 1955, v.4, p.38. Позднев В.Ф., Подгорнова Н.Н., Зенцова Н.И., Ауконе Г.И., Калей У.О. Химия природных соединений, 1979, N 1, с.543- 545. Конелевич В.М., Лысенкова А.В., Позднев В.Ф. Биоорган. химия, 1979, т.5, N 12, с.254-258. 
(71) Имя заявителя: Московское производственное объединение "Мосмедпрепараты" им.Л.Я.Карпова; Московский институт тонкой химической технологии им.М.В.Ломоносова 
(72) Имя изобретателя: Скоблик Т.И.; Маркин А.Ю.; Заборина Т.Г.; Филиппович Е.И.; Желтухина Г.А.; Евстигнеева Р.П.; Бабижаев М.А.; Шарков В.Я. 
(73) Имя патентообладателя: Фармацевтическое акционерное общество "Феррейн" 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАРНОЗИНА 

Изобретение касается пептидов, в частности получения карнозина - антикатарактивного средства для офтальмологии. Цель - повышение активности и качества целевого продукта при экологической чистоте процесса и его упрощении. Синтез ведут из - аланина, который защищают введением в аминогруппу трет-бутилоксикарбонильной группы с последующим активированием полученного производного алкилхлорформиатом и N-оксисукцинимидом. Полученный при этом N-оксисукцинимидный эфир N - трет-бутоксикарбонил - b - аланина используют для ацилирования L - гистидина в нейтральной водно-органической среде при 18 - 25°С. Затем ведут отщепление N-защитной группы в кислой среде с последующим выделением целевого продукта при нейтрализации с достижением изоэлектрической точки. Эти условия повышают выход целевого продукта с 40 до 50% с достижением более высокой т. пл. 259 - 263°С, удельного вращения []2D0 22°, а также увеличенного просветляющего эффекта при помутнении хрусталика человека. Кроме того, исключается в процессе применения сильных оснований, вызывающих побочные реакции, и сокращение числа стадий процесса. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к усовершенствованному способу получения карнозина - биологически активного соединения, которое находит применение в медицине.

Известны различные способы синтеза карнозина, которые можно условно разделить на 2 группы: с использованием незащищенного по карбоксилу гистидина в водной среде; с применением метилового эфира гистидина в органических растворителях.

К первой группе относится способ синтеза карнозина путем N -ацилирования свободного гистидина в воде действием -иодпропионилхлорида в петролейном эфире с последующим аминированием. Он имеет ряд недостатков (1). В частности, весьма низок выход целевого продукта в расчете на исходный гистидин, способ многостадиен, в ходе синтеза применяют AgNO3; H2S, аминирование проводится в жестких условиях при 100о, Т.пл. полученного по данному способу карнозина ниже, чем у лучших образцов карнозина (250-251оС против 260оС).

Известен способ получения карнозина путем взаимодействия смешанного ангидрида, полученного из N-фталил- -аланина и этилхлорформиата в присутствии Et3N, с L-гистидином в воде при рН 9,6 (2). Выход N - защищенного производного карнозина - 60% . После удаления N - защиты гидразинолизом (выход 96% ) получают карнозин с несколько растянутой т.пл. (255-260оС). Общий выход 50% . Недостатками способа являются: необходимость получения фталил-защищенного -аланина при нагревании до высокой температуры (170-190оС); необходимость тщательного высушивания над гидридом кальция растворителя - диметилового эфира этиленгликоля для получения смешанного ангидрида; необходимость тщательного соблюдения условий реакций, пониженной температуры, времени образования смешанного ангидрида, интенсивности перемешивания, точного значения рН водного раствора гистидина; возможность частичной рацемизации остатка гистидина при выдерживании в сильно-щелочной среде (рН 9), возможность ацилирования имидазола гистидина в этих условиях. При несоблюдении условий 2 и 3 может произойти быстрое разрушение смешанного ангидрида как на стадии его образования, так и на стадии ацилирования.

Все это снижает технологическую ценность способа, так же как и длительность процесса отщепления N-фталильной защиты в щелочной среде гидразин-гидратом (2 сут) (3), что может приводить к рацемизации остатка L-гистидина.

Известен способ получения карнозина действием 2 экв. N-тиокарбоксиангидрида (NTA) -аланина на L-гистидин в воде в присутствии тетраалкиламмоний гидроксида при рН 9,2 (4). Выход неперекристаллизованного карнозина колеблется от 50 до 79%. NTA получают из соответствующего тионоуретана действием PBr3 с выходом 72%. Т.пл. перекристаллизованного карнозина, полученного по этому способу, наиболее высокая - 262оС, однако выход продукта такого качества не указан. Недостатками способа являются: невозможность регенерации избыточного -аланина; применение агрессивных соединений - PBr3; выделение в результате реакции NTA с гистидином газов (H2S, CO2); необходимость поддержания точного значения рН в реакционной массе при интенсивном перемешивании (в противоположном случае возможна невоспроизводимость результатов реакции; проведение реакции в водно-щелочной среде (1 ч при рН 9,2), что в принципе может приводить к рацемизации остатка гистидина.

Известны способы синтеза карнозина путем ацилирования метилового эфира гистидина в органической среде N-защищенными производными -аланина, активированными по карбоксильной функции п-нитрофенильной (5) или азидной (6) группой. Преимуществом и отличием этих методов является принципиальное отсутствие ацилирования имидазольного кольца гистидина, проведение реакции конденсации в органической среде. Существенным общим недостатком является многостадийность, связанная с необходимостью получения метилового эфира гистидина, получения из него свободного основания - метилового эфира гистидина, а после проведения реакции конденсации - омыления производного карнозина. Недостатками способа (6), кроме того, являются: необходимость проведения каталитического гидрирования (H2/Pd) для отщепления N-Z-защиты, неустойчивость и небезопасность обращения с азидом Z--аланина.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является способ получения карнозина путем ацилирования метилового эфира гистидина п-нитрофениловым эфиром N-фталил- -аланина в органической среде (выход на этой стадии составляет 76%), последующее омыление действием едкого натра в ацетоне (81% выход) и отщепление фталильной защиты гидразинолизом (выход 88%) приводит к целевому карнозину. После перекристаллизации получается продукт со сравнительно низкой т.пл. 250оС. Общий выход карнозина, считая на исходный метиловый эфир гистидина - 50%, а на свободный гистидин - еще меньше (40%).

Однако известный способ имеет следующие недостатки: многостадийность, необходимость введения фталильной защиты при высокой температуре, длительность отщепления фталильной защиты в щелочной среде гидразинолизом, трудности выделения продукта после отщепления фталильной защиты; недостаточная активность п-нитрофенилового эфира -аланина по сравнению с другими активированными эфирами; возможность рацемизации при омылении метилового эфира дипептида в водно-щелочной среде и отщепления N-защиты; трудность отделения п-нитрофенола.

Целью изобретения является упрощение процесса, повышение его экологической чистоты и технологичности, повышение качества и биологической активности целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что в предлагаемом способе получения карнозина, заключающемся во введении N-защиты, получении активированного эфира N-защищенного -аланина, отщеплении N-защиты и перекристаллизации целевого продукта из спирта, отличительными особенностями являются введение N-трет-бутилоксикарбонильной защиты в -аланин и активация полученного N-трет-бутилоксикарбонил- -аланина методом смешанных ангидридов с применением алкилхлорформиата и N-оксисукцинимида с получением N-оксисукцинимидного эфира N-трет-бутилоксикарбонил- -аланина.

Свободный L-гистидин ацилируют обычно 3-кратным избытком Вос- -Ala-ONSu и в нейтральной водно-органической среде при 8-25оС. Непрореагировавший избыток Вос--Ala-ONSu может быть регенерирован путем экстракции органическими растворителями из реакционной смеси, после чего отщепляют Вос-защиту L-карнозина в кислой среде с последующим выделением путем нейтрализации до достижения изоэлектрической точки. Сопоставительный анализ описываемого решения с прототипом показывает, что заявляемый способ отличается от известного тем, что проводят ацилирование свободного гистидина, а не соответствующего метилового эфира, что сокращает общее число стадий, причем ацилирование ведут в нейтральной среде без применения агрессивных и токсических веществ; для защиты аминофункции -аланина применяется трет-бутилоксикарбонильная защита, отщепление которой протекает быстро (1 ч) и удобно, с количественным выходом в кислой среде, с последующим выделением свободного основания путем нейтрализации трифторацетата карнозина Et3N до рН около 8. Кроме того, в описываемом способе с целью исключения BCC, Вос--Ala-ONSu получают неописанным ранее для этого соединения методом смешанных ангидридов, из которых наилучшие результаты дает этилхлорформиат.

Описываемый способ позволяет проводить практически полностью N-ацилирование гистидина в водно-органической среде при отсутствии какого-либо основания.

Более высокое качество продукта, получаемого по описываемому способу, по-видимому, обусловлено полным исключением сильных оснований в ходе синтеза N-защищенного карнозина (в прототипе - водная NaOH, а аналогах - LiOH, NaOH). Замена N-фталильной защиты -аланина в прототипе на N-Вос - защиту также позволила исключить из процесса синтеза щелочное воздействие гидразина в течение 2 сут. Применение сильных оснований связано с риском рацемизации остатка L-гистидина и возможностью протекания побочных реакций по незамещенному его имидазолу. Использование описываемого способа позволяет свести рацемизацию гистидина до минимума.

Введение Вос-защиты в -аланин осуществляется действием Вос2О с высоким выходом (7). Отщепление Вос-защиты протекает гладко в кислой среде в течение 0,5-1,5 ч. Как при введении, так и при отщеплении в качестве побочного продукта образуются безвредные продукты - трет-бутанол и СО2. Замена ONp-эфира (в прототипе) в процессе создания пептидной связи на HONSu позволяет сократить время реакции конденсации более, чем в 2 раза, и кроме того, позволяет облегчить выделение целевого продукта. Выделяющийся в процессе синтеза карнозина в прототипе HONp частично растворим и в воде и в органических растворителях, что затрудняет очистку целевого продукта.

Этилхлорформиат, примененный для синтеза Вос--Ala-ONSu является более доступным, дешевым, менее токсичным и аллергенным реагентом по сравнению с традиционно используемым для получения активированных эфиров N,N'-дициклогексилкарбодиимидом - сильным аллергеном.

Выход карнозина после перекристаллизации, считая на гистидин - 50%, а в условиях способа - прототипа - 40%. Т.пл. карнозина, полученного в условиях описываемого способа, находится в пределах лучших значений, приведенных в литературе: 259-263оС.

Осуществление описываемого способа поясняется с помощью следующих примеров.

Индивидуальность полученных соединений подтверждалась хроматографией на силуфоле "SiIufol UV-254" в системах растворителей: бутанол-уксусная кислота - вода, 4:1:5 (1), изопропанол-вода-25%-й водный аммиак 6:1:3 (2); хроматографией на бумаге "FN-11" в системе растворителей: вода-метанол-пиридин 20: 80: 4 (3). Хроматограммы (1) проявляли раствором нингидрина, хроматограммы (2) - раствором нингидрина и хлор-толидиновым реактивом, хроматограммы (3) проявляли реактивом Паули и раствором соды. ЯМР-спектр снят на приборе "IEOL IТД" (Япония) FX 90Q.

П р и м е р 1. Трет-бутилоксикарбонил- -аланин (1).

К раствору водного изопропилового спирта (60 мл воды и 30 мл изопропанола) в присутствии 10,8 г (0,0781 моль) карбоната калия добавляют 6,9 (0,092 моль) ди-трет-бутилпирокарбоната. Перемешивают 2 ч при 20 - 25оС. Прибавляют 20 мл воды и 20 г лимонной кислоты (0,104 моль) до рН 4,0. Вос--Ala-ОН экстрагируют этилацетатом (5х50 мл). Объединенный этилацетатный экстракт промывают водой 2х 50 мл) и насыщенным раствором хлорида натрия (30 мл), сушат безводным сульфатом натрия (40 г) 1 ч при перемешивании. Фильтруют, на фильтре NaSO4 промывают 30 мл этилацетата. Растворитель удаляют в вакууме при 40оС. К маслянистому остатку прибавляют 20 мл гексана и упаривают в вакууме. К образовавшимся белым кристаллам добавляют 20 мл гексана, растирают, фильтруют. Промывают гексаном (2х20 мл). Получают белый, мелкокристаллический порошок. Выход 13,25 г (76,2%), т.пл. +75 - +76оС, Rf 0,84 (I). Лит. (7). Т.пл. 75-76оС.

П р и м е р 2. N-оксисукцинимидный эфир N -трет-бутилоксикарбонил--аланина (II).

К раствору 0,5 г (2,65 ммоль) Boc--Ala-OH в 6 мл безводного хлористого метилена добавляют 0,367 мл (2,62 ммоль) триэтиламина, охлаждают до -15оС и при перемешивании добавляют 0,255 мл этилхлорформиата. Через 15-20 мин к реакционной смеси прибавляют 0,36 г (2,69 ммоль) N-оксисукцинимида; еще через 15 - 20 мин добавляют 1,5 мл безводного пиридина. Реакционную смесь перемешивают еще 1 ч при постепенном повышении температуры до 20оС и промывают водой, 5%-ным раствором NaHCO3, 5%-ным раствором HCl и водой. Сушат над NaSO4, растворитель удаляют в вакууме. Остаток перекристаллизовывают из изопропанола. Выход 0,65 г (84,1%), т.пл. 96-100оС, Rf 0,73 (1). Лит. (10), т.пл. 90-92оС.

Найдено,%: С 50,32; Н 6,36; N 9,58.

C12H18N2O6.

Вычислено,%: C 50,35; H 6,29; N 9,79.

П р и м е р 3. N-трет-бутилоксикарбонил- -аланин-L-гистидин (III).

3 г (0,019 моль) L-гистидина растворяют в 90 мл воды, медленно прибавляют 20 мл диоксана, затем небольшими порциями (по 0,5 г) добавляют Вос--Ala-ONS и (II), всего 15,6 (0,054 моль). После добавления первых трех порций постепенно (по 5 мл) прибавляют диоксан, достигая соотношения диоксан - вода 1:1. Вос--Ala-ONS и (II) прибавляют в течение 3 ч. Реакционную смесь перемешивают до полного исчезновения исходного гистидина (8-24 ч). Контроль осуществляют с помощью ТСХ: Вос-L-карнозин (III) Rf 0,33 (I); 0,7 (3). После окончания выдержки реакционную смесь промывают этилацетатом (3х100 мл), хлороформом (2х100 мл). Водный концентрат лиофильно высушивают. Получают 7,55 г сырого продукта Вос-L-карнозина.

П р и м е р 4. L-карнозин (IV).

7,55 г Вос - L-карнозина растворяют в 9 мл концентрированной трифторуксусной кислоты, перемешивают в течение 1,5 ч при 22 - 25оС. Растворитель удаляют в вакууме. К маслянистому остатку дважды прибавляют 50 мл этилового спирта и упаривают под вакуумом. Остаток растворяют в 50 мл абс.этанола и прибавляют 14 мл триэтиламина до рН 8,1. При достижении изоэлектрической точки раствор замучивается и его оставляют при 5оС на 24 ч. Образовавшиеся кристаллы отфильтровывают, промывают 2х100 мл холодным этиловым спиртом (абс. ), сушат на воздухе 24 ч. Получают 3,65 г (83,5%, считая на L-гистидин) белого с кремовым оттенком порошка, который растворяют в 15 мл воды, добавляют 300 мл этанола и оставляют при 5оС на 3 сут. Кристаллы L-карнозина фильтруют, промывают (2х50 мл) диэтиловым эфиром. Сушат в присутствии Р2О5. Получают 2 г белого порошка. Выход в расчете на L - HiS - 50%. Т.пл.= = 259-263оС, Rf 0,44 (2), ()D20 + 22,0о (с 1, вода). Лит. (4) т.пл. 262оС (разл.), ()D25 +21,0о (с 1, вода).

ИК-(КBr) 3180, 1646, 1582 см-1.

1Н ЯМР (D2O) : 2,48 (т, 2Н), 2,88, 3,0 (м. 4Н), 4,24 (м, 1Н), 6,74 (с, 1Н), 7,52 (с, 1Н).

Биологические испытания показали, что полученный по описываемому способу карнозин эффективен как антикатарактальное средство.

Биоиспытания на изменение оптических свойств помутневших хрусталиков человека проводились методом денситометрического анализа, который осуществлялся с помощью сканирующей приставки (модель ISC-260) к спектрофотометру Shimadzu UV-260 (Япония). Регистрировались профили оптической плотности различных участков хрусталика при 700 нм. Результаты измерений обрабатывали методами планиметрии. Показано, что образец карнозина, полученного описываемым способом, повышает светопропускание на 28 2,2% по сравнению с исходными величинами. В аналогичных условиях образец карнозина пpоизводства фирмы "Sigma" (США) и выделенный из природного сырья карнозин производства Ленинградского мясокомбината увеличивали светопропускания лишь на 18,04,0% и 6,02,0% соответственно.

Таким образом, карнозин полученный описываемым методом, оказывает значительный просветляющий эффект на помутневшие хрусталики человека. Использование описываемого способа получения карнозина обеспечивает по сравнению с существующими способами следующие преимущества: доступность исходных продуктов, повышение экологической чистоты процесса, упрощение процесса, большая его технологичность (уменьшение общего числа стадий, возможность регенерации), улучшение качества продукта.

N-ацилирование гистидина в нейтральной среде обусловливает полное исключение сильных оснований в ходе синтеза и высокое качество продукта; (в прототипе - водная NaOH, гидразин, в аналогах - LiOH, NaOH). Применение сильных оснований связано с риском рацемизации остатка L-гистидина и возможностью протекания побочных реакций по незащищенному его имидазолу. Проведение N-ацилирования свободного гистидина ведет также к сокращению общего числа стадий процесса.

Введение для защиты аминофункции -аланина трет-бутилоксикарбонильной защиты в отщепление ее в кислой среде позволяет исключить щелочь (гидразин) при отщеплении Вос-защиты, облегчает выделение конечного продукта, обеспечивает экологическую чистоту способа (в качестве побочного продукта образуются безвредные продукты трет-бутанол и СО2).

Замена ONp - эфира (п-нитрофенилового эфира) на N-оксисукцинимидный обусловлена хорошей растворимостью в воде, выделяющегося в процессе создания пептидной связи HONSu, что определяет легкость его отделения от целевого продукта.

Замена аллергенного и канцерогенного N,N'-дициклогексилкарбодиимида на этилхлорформиат при получении N-оксисукцинимидного эфира Вос--аланина повышает экологическую чистоту и безопасность способа, удешевляет процесс вследствие большей доступности и более низкой стоимости в этилхлорформиата. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАРНОЗИНА путем введения N - защиты в - аланин, получения активированного эфира N - защищенного b - аланина с последующим ацилированием, отщепления N - защиты и перекристаллизации целевого продукта из спирта, отличающийся тем, что, с целью упрощения и повышения экологической чистоты процесса, повышения качества и биологической активности продукта, b - аланин защищают путем введения N - трет-бутилоксикарбонильной группы, полученный N-трет-бутилоксикарбонил - b - аланин активируют методом смешанных ангидридов алкилхлорформиатом и N - оксисукцинимидом с получением N - оксисукцинимидного эфира N - трет-бутилоксикарбонил - b - аланина, избытком которого проводят ацилирование L-гистидина в нейтральной водно-органической среде при 18 - 25oС, после чего отщепляют N-трет-бутилоксикарбонильную защиту в кислой среде с последующим выделением путем нейтрализации до достижения изоэлектрической точки.