СПОСОБ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ ТРОМБОФИЛИЧЕСКОЙ ТРОМБОЦИТОПАТИИ ПРИ МЕТАБОЛИЧЕСКОМ СИНДРОМЕ

СПОСОБ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ ТРОМБОФИЛИЧЕСКОЙ ТРОМБОЦИТОПАТИИ ПРИ МЕТАБОЛИЧЕСКОМ СИНДРОМЕ


RU (11) 2275641 (13) C1

(51) МПК
G01N 33/86 (2006.01)
G01N 33/49 (2006.01) 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 26.07.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(14) Дата публикации: 2006.04.27 
(21) Регистрационный номер заявки: 2004128505/15 
(22) Дата подачи заявки: 2004.09.27 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2004.09.27 
(45) Опубликовано: 2006.04.27 
(56) Аналоги изобретения: ЕРМОЛАЕВА Т.А. и др. Программа клинико-лабораторного обследования больных тромбоцитопатиями: Метод. рекоменд. СПб., 1992, 25 с. ЕРМОЛАЕВА Т.А. Функционально-биохимические характеристики кровяных пластинок в норме и при тромбоцитопатиях. Автореф. дисс. докт. мед.н. 1992, с.36-39, 62. ШИТИКОВА А.С. и др. Метод определения внутрисосудистой активации
тромбоцитов и его значение в клинической практике. Клин. лаб. диагностика. 1997, №2, с.23-24. ШИТИКОВА А.С. Тромбоцитарный гемостаз. СПб.: Изд-во СПб ГМУ, 2000, с.136-156. RU 2213976 С2, 10.10.2003. SU 1603309 A1, 30.10.1990. SU 1734020 A1, 15.05.1992. ШИТИКОВА А.С. Визуальный микрометод исследования агрегации тромбоцитов. Гемостаз. Физиологические механизмы, принципы диагностики основных форм геморрагических заболеваний/ Под ред. Н.Н.Петрищева, Л.П.Папаян. СПб., 1999, с.49-52. АКОПОВ С.Э. и др. Об использовании комбинаций индукторов агрегации в оценке изменений тромбоцитарных функций у больных с нарушениями мозгового кровообращения. Кровообращение. 1988, т.21, №4, с.47-49.

(72) Имя изобретателя: Медведев Илья Николаевич (RU); Беспарточный Борис Дмитриевич (RU) 
(73) Имя патентообладателя: Медведев Илья Николаевич (RU); Беспарточный Борис Дмитриевич (RU) 
(98) Адрес для переписки: 305035, г.Курск, ул. Пирогова, 12б, И.Н. Медведеву 

(54) СПОСОБ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ ТРОМБОФИЛИЧЕСКОЙ ТРОМБОЦИТОПАТИИ ПРИ МЕТАБОЛИЧЕСКОМ СИНДРОМЕ
Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии и гематоогии. Сущность способа: у больного метаболическим синдромом определяют длительность кровотечения, адгезивно-агрегационную способность тромбоцитов, агрегацию тромбоцитов на стекле с рядом индукторов и их сочетаний, внутрисосудистую активность тромбоцитов и ретракцию кровяного сгустка. Обрабатывают результаты исследования с помощью системного многофакторного анализа. Рассчитывают значение общего агрегационного потенциала, по значению которого в ранние сроки диагностируют развитие тромбофилической тромбоцитопатии. Значение общего агрегационного потенциала до 0,015 свидетельствует об отсутствии активации первичного гемостаза, что не требует лечебных вмешательств; при значении 0,016-0,049 больные входят в группу риска по развитию тромбофилической тромбоцитопатии и нуждаются в ежемесячном наблюдении врача с обязательным оздоровлением образа жизни; при значении 0,050 и выше имеется тромбофилическая тромбоцитопатия, требующая коррекции тромбоцитарного гемостаза. Использование способа позволяет повысить эффективность диагностики, и соответственно позволит своевременно корригировать тромбофилию. 




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Изобретение относится к медицине, в области кардиологии и гематологии, а именно к гемостазу и может быть использовано для ранней диагностики тромбофиллической тромбоцитопатии при метаболическом синдроме.

Известен способ диагностики тромбоцитопатии (Шитикова А.С. Алгоритм диагностики тромбоцитопатии высвобождения. // Казанский медицинский журнал 1990, №3. - С.206-212), который позволяет диагностировать тромбоцитопатию у различного контингента больных. Имеется способ (Ермолаева Т.А., Головина О.Г., Морозова Т.В., Пономаренко В.М., Лубо-Лесинченко И.Ф. Программа клинико-лабораторного обследования больных тромбоцитопатиями. // Методические рекомендации. СПб.: 1992. - 25 с.), позволяющий выявлять нарушения тромбоцитарных функций при различных патологических состояниях. Однако в данных способах не предусматривается ранняя диагностика предтромботической тромбоцитопатии путем статистической обработки полученных данных с выражением общего агрегационного процесса одним числом, по величине которого можно судить о степени выраженности нарушения тромбоцитарного гемостаза у больных метаболическим синдромом. На сегодняшний день аналогов способа дифференциального подхода к коррекции тромбоцитопатии у больных метаболическим синдромом не существует.

Целью изобретения является повышение эффективности диагностики тромбоцитопатии у больных метаболическим синдромом.

Сущность заявляемого способа заключается в том, что для исследования тромбоцитарного гемостаза у больных с метаболическим синдромом из локтевой вены берется кровь в несколько пробирок для исследования адгезивно-агрегационной активности тромбоцитов, агрегации тромбоцитов (AT) на стекле с АДФ, коллагеном, тромбином, ристомицином, перекисью водорода, адреналином и различными их сочетаниями и определением внутрисосудистой активности тромбоцитов (ВАТ) с последующей обработкой полученных данных системный многофакторным анализом.

Способ отличается тем, что с применением нескольких технически простых и не требующих дорогостоящих реактивов, оборудования, затрат сил и времени методов возможна постановка больным метаболическим синдромом диагноза тромбофиллической тромбоцитопатии с последующим вычислением общего агрегационного потенциала, по значению которого определяют попадание больного в группу риска развития тромбоцитопатии ( от 0,016 до 0,049), требующей нормализации образа жизни, или группу начинающейся тромбоцитопатии ( от 0,050 и выше), требующей коррекции тромбоцитарного гемостаза.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом. Взятие крови производят в утренние часы после 14 часового голодания. Кровь берут из локтевой вены через толстую иглу самотеком в три пробирки. В первую 2 мл крови в 8 мл забуференного 0,125% раствора глутаральдегида с последующим исследованием ВАТ. Во вторую пробирку с цитратом натрия в соотношении 9:1 берут 5 мл крови для оценки агрегации тромбоцитов. В последней пробирке сразу же определяется количество тромбоцитов в венозной крови. Одновременно с определением длительности кровотечения по Шитиковой А.С. (1975) производится подсчет числа тромбоцитов в капиллярной крови. Для этого точно на 20-й секунде после укола пальца до его погружения в физиологический раствор набирают одну мерную пипетку для подсчета тромбоцитов. Определяя процент задержавшихся на ранке тромбоцитов по сравнению с венозной кровью, судят об адгезивно-агрегационной активности тромбоцитов.

Оценка ВАТ осуществляется следующим способом (Шитикова А.С. и соавт. Метод определения внутрисосудистой активности тромбоцитов и его значение в клинической практике. // Клиническая лабораторная диагностика, 1997, №2. - С.23-35). Из иглы, введенной в локтевую вену, сливают 2-3 мл крови на вату и следующие 2 мл наливают в силиконированную центрифужную пробирку с 8 мл раствора 0,125% глутаральдегида. Эту пробирку заполняют в первую очередь до всех других проб, набираемых для исследования системы гемостаза. Полученную кровь сразу же центрифугируют 6 мин при 1000 об/мин. В случае неполного осаждения эритроцитов (супернатант розового цвета) отбирают 2 мл надосадочной жидкости в другую пробирку и центрифугируют в том же режиме в течение 1 минуты. Супернатант разводят раствором глутаральдегида в четыре раза (0,1 мл + 0,3 мл раствора), перемешивают пипеткой 5 раз и заполняют камеру Горяева, которую помещают на 20 мин в увлажненную чашку Петри.

С целью определения абсолютного содержания тромбоцитов в 10 9/л крови в заполненной камере Горяева в пяти больших квадратах подсчитывают число всех единичных кровяных пластинок вне зависимости от их формы. Полученную величину для вычисления содержания тромбоцитов в 109/л крови нужно умножить на 5×4×10×5×10 6=1×109, где первые две цифры - поправки на произведенные в ходе исследования разведения крови, вторые две цифры - поправки, связанные с высотой камеры Горяева (0,1 мм) и с площадью, на которой подсчитывались кровяные пластинки (5 больших квадратов = 1/5 мм2), 106 - коэффициент пересчета 1 мм3 в 1 л. Определив абсолютное содержание тромбоцитов в исследуемой крови, переводят относительные величины отдельных форм тромбоцитов (в %) в абсолютное их содержание в 109/л. крови. Абсолютные величины при патологии могут более адекватно отражать изменения в определяемом распределении форм.

В этом же препарате подсчитывают число агрегатов разного размера (т.е. содержащих по 2, 3, 4, 5 и т.д. кровяных пластинок), приходящихся на 500 свободных тромбоцитов. Результат оценивают по распределению агрегатов разного размера, приходящихся на 100 свободных тромбоцитов. Для облегчения анализа распределительной агрегатограммы полученные результаты могут быть суммированы в виде двух величин: 1) числа агрегатов малого размера, содержащих по 2-3 тромбоцита, и 2) числа агрегатов среднего и большого размера, содержащих по 4 и более тромбоцитов. Изменение этих величин в патологических условиях более наглядно выявляет повышение процесса внутрисосудистой активации кровяных пластинок.

Оценка степени агрегации осуществляется также и по относительному числу всех тромбоцитов, вовлеченных в агрегационную реакцию. Последнее может быть выявлено по процентному отношению числа агрегировавших тромбоцитов к общему их числу в препарате (т.е. к сумме свободно лежащих клеток и вовлеченных в агрегацию) по формуле:



где х, y, z и т.д. - число агрегатов соответствующего размера, приходящееся на 500 свободных тромбоцитов. Эта формула не может быть применена в том случае, когда в препарате имеются необратимые, оптически гомогенные агрегаты или настолько большие, что в них невозможно подсчитать число клеток. В этом случае ограничиваются данными распределения агрегатов разного размера.

Оценка AT осуществляется следующим способом (Шитикова А.С.В кн.: Гемостаз. Физиологические механизмы, принципы диагностики основных форм геморрагических заболеваний. Под ред. Н.Н.Петрищева, Л.П.Папаян. СПб., 1999. С.49-52).

Кровь забирают с цитратом натрия 3,8% в соотношении 9:1, центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин, для получения богатой тромбоцитами плазмы (БТП). Часть плазмы отбирают, а оставшуюся центрифугируют при 3000 об/мин, в течение 20 мин, получая бедную тромбоцитами плазму (БеТП). БТП стандартизируют по числу тромбоцитов путем разбавления исходной БТП аутологичным образцом БеТП (до 200·109/л.). Концентрация кровяных пластинок в исходной БТП подсчитывается в камере Горяева (в 50 больших квадратах). Объемы смешиваемых БТП и БеТП определяют по формуле:

VБеТП=VБТП·[(N/200000)-1],

VБеТП - объем бедной тромбоцитами плазмы,

VБТП - объем богатой тромбоцитами плазмы,

N - счетная концентрация тромбоцитов в исходной БТП (клеток/мкл).

Из отобранного объема стандартизированной плазмы на предметное стекло наносят 0,02 мл плазмы и разными пипетками по 0,02 мл р-ра индуктора. В качестве агонистов возможно применение АДФ, коллагена, тромбина, адреналина, ристомицина, перекиси водорода в общепринятых концентрациях и сочетаний индукторов (АДФ + коллаген, АДФ + тромбин, коллаген + тромбин, АДФ + адреналин, АДФ + коллаген + адреналин и т.д.) в концентрациях ниже общепринятых (АДФ 10 -6 М, коллаген - разведение основной суспензией 1:4, тромбин 0,09 ед/мл., адреналин 2,5×10-7 М), но достаточных для возникновения агрегации тромбоцитов при взаимопотенциирующем их влиянии. Стеклянной палочкой смешивают плазму с индукторами и включают секундомер. Смесь перемешивают так, чтобы жидкость занимала окружность диаметром около 2 см.

Покачивая стекло круговыми движениями в проходящем свете осветителя, на черном фоне следят через лупу за возникновением агрегатов. При появлении отчетливых агрегатов, просветлении раствора и прилипании части агрегатов к стеклу секундомер отключают, фиксируя время агрегации тромбоцитов.

Реакцию повторяют 2-3 раза с каждым индуктором, находя среднее арифметическое значение.

Длительность кровотечения оценивают по (Шитикова А.С. // Лабор. дело. - 1975. - №10. - С.597-602). В две пластиковые бакпечатки разового пользования наливают по 5 мл стерильного физиологического раствора пипеткой, предназначенной только для этой цели.

Предплечье обследуемого свободно лежит на столе. На плечо накладывают манжетку тонометра и нагнетают воздух до 40 мм рт.ст. Это давление сохраняется в течение всего времени исследования.

Обрабатывают спиртом концевую фалангу IV пальца и общепринятым способом с помощью скарификатора разового пользования производят укол в подушечку концевой фаланги точно на глубину 3,5 мм и одновременно включают секундомер.

Кончик пальца с нанесенной ранкой погружают в верхнюю часть раствора, наблюдают в проходящем свете за вытекающим столбиком крови, и в момент полного прекращения кровотечения выключают секундомер. В случае большой кровопотери и сильного окрашивания кровью раствора палец перед концом кровотечения переносят в другой стаканчик для точного установления момента его завершения.

С помощью пипеток на 5 и 0,2 мл (маркированных "для крови" и не используемых для другой цели) оценивают интенсивность кровотечения путем измерения добавочного объема жидкости сверх налитых 5 мл.

Определение времени кровотечения необходимо повторить два раза, но одномоментно не более двух раз, т.к. после третьего укола длительность начинает увеличиваться. Диагностическое значение имеет наибольшая из установленных величин. При значительном увеличении времени кровотечения исследование следует прекратить на 10-15 минут, а при большой кровопотере - и раньше.

Пределы нормальных колебаний длительности кровотечения составляют у взрослых мужчин 70-196 с (X=118 с), у женщин 87-208 с (X=135 с). Объем кровопотери - 0,01-0,40 мл.

Адгезивно-агрегационная активность тромбоцитов оценивается по Шитиковой А.С. (В кн.: Гемостаз. Физиологические механизмы, принципы диагностики основных форм геморрагических заболеваний. Под ред. Н.Н.Петрищева, Л.П.Папаян. СПб., 1999. - С.40-41).

Подсчет числа тромбоцитов в капиллярной крови проводится одновременно с определением длительности кровотечения. Для этого точно на 20 секунде после укола в палец до его погружения в физиологический раствор хлорида натрия набирают одну мерную пипетку для подсчета количества тромбоцитов. Поскольку длительность кровотечения определяют дважды, то и при нанесении второй ранки указанную процедуру повторяют. На 20-й секунде капля должна выступать самостоятельно, и только, если этого не происходит, допускается легкое надавливание на концевую фалангу пальца.

Определение процента тромбоцитов, задержавшихся на раневой поверхности за счет их адгезивно-агрегационной активности, проводится по формуле: (А-Б)/А×100%, где А - число тромбоцитов в венозной крови ×109/л, Б - число тромбоцитов в капиллярной крови ×109/л.

Пределы нормальных колебаний адгезивно-агрегационной активности тромбоцитов у взрослых здоровых людей составляют 28-48% (Х=37%).

Для определения весомости отдельных исследуемых параметров у больных метаболическим синдромом и вычисления их агрегационного потенциала применялся системный многофакторный анализ, позволяющий перевести многомерные количественные характеристики исследуемого процесса с несопоставимыми абсолютными значениями в сопоставимые относительные величины. Расчет производился по формулам:



- исследуемый параметр, - нормативный параметр, - относительная разность.



Pi - весовой коэффициент (коэффициент влияния), а - постоянный множитель (в наших исследованиях а=0,1), j - среднеквадротическое отклонение значения в относительных единицах.



- дисперсия исследуемого параметра Xi, ni - количество наблюдений при определении Xi , - дисперсия нормативного параметра Х0, n0 - количество наблюдений при определении Х0 .



- величина, интегрально характеризующая исследуемый процесс (в данном случае тромбоцитарный гемостаз) в заданный срок (в относительных единицах) является общим агрегационным потенциалом.

Таким образом, общий агрегационный потенциал ( ) - это интегрально характеризующая тромбоцитарный гемостаз вычисляемая величина, позволяющая перевести исследуемые многомерные количественные характеристики с несопоставимыми абсолютными значениями (длительность кровотечения, адгезивно-агрегационная способность тромбоцитов, их агрегационная функция на стекле с рядом индукторов и их сочетаний и внутрисосудистая активность кровяных пластинок) в сопоставимые относительные величины. На основании их, с учетом весового коэффициента, определяемого для каждого показателя на основании среднеквадратического отклонения для данного показателя и постоянного множителя, равного 0,1, рассчитывают значение общего агрегационного потенциала.

Сочетанное применение описанных методов с последующей обработкой полученных результатов системным многофакторным анализом с определением общего агрегационного потенциала ( ) позволяет выявлять у пациентов риск развития тромбофиллической тромбоцитопатии ( от 0,016 до 0,049), что требует нормализации образа жизни, стабильной нормализации артериального давления и ежемесячного контроля состояния тромбоцитарного гемостаза, а при значении от 0,050 и выше - необходимо проведение лечения пациентов.

Внедрение данного способа ранней диагностики тромбофиллической тромбоцитопатии у больных метаболическим синдромом в практику лечебных учреждений позволит решить ряд насущных социально-экономических проблем современности.

Ранняя диагностика тромбофиллической тромбоцитопатии у больных метаболическим синдромом позволит своевременно начинать лечение тромбофиллии, что сократит у этих пациентов сроки временной нетрудоспособности, профилактирует инсульты и инфаркты, уменьшит число выходов на инвалидность и снизит смертность среди данного контингента больных.

Пример 1. Больная С. 46 лет, страдающая артериальной гипертонией с метаболическим синдромом на протяжении 5 лет, ведущая здоровый образ жизни, обследована во время диспансерного осмотра по поводу артериальной гипертонии. У больной была взята кровь в три пробирки и исследована по изложенной выше схеме с оценкой ВАТ, агрегационной активности тромбоцитов с рядом индукторов и ретракции кровяного сгустка с оценкой адгезивной способности тромбоцитов и вычислением общего агрегационного потенциала.

У пациентки не было выявлено признаков активации тромбоцитарного гемостаза. Адгезивно-агрегационная активность составляла (40,0%), агрегация тромбоцитов с рядом индукторов была близка к норме (АДФ 38,2 с, коллаген 42,6 с, H2O2 44,8 с, адреналин 88,6 с, АДФ + адреналин 31,2 с, АДФ + коллаген 24,3 с, адреналин + коллаген 25,4 с, АДФ + тромбин 22,3 с, коллаген + тромбин 20,1 с, АДФ + коллаген + адреналин 17,4 с), ВАТ была не нарушена (дискоциты 81%, диско-эхиноциты 13%, сфероциты 2%, сферо-эхиноциты 3%, биополярные формы 1%). Общий агрегационный потенциал составил . Больной было рекомендовано и далее контролировать артериальное давление и вести здоровый образ жизни. Так, исследование тромбоцитарного гемостаза через 12 нед. не выявило отрицательных изменений значения общего агрегационного потенциала .

Пример 2. Больной А., 47 лет, страдающий артериальной гипертонией с метаболическим синдромом на протяжении 12 лет. При обследовании у больного была взята кровь в три пробирки и исследована по изложенной выше схеме с оценкой ВАТ, агрегационной активности тромбоцитов с рядом индукторов и ретракции кровяного сгустка с оценкой адгезивной способности тромбоцитов и вычислением общего агрегационного потенциала.

У больного была выявлена возможность развития тромбофиллической тромбоцитопатии с повышением адгезивно-агрегационной активности тромбоцитов (45,3%), агрегации кровяных пластинок под влиянием ряда индукторов (АДФ 33,4 с, коллаген 36,1 с, H2O2 38,8 с, адреналин 81,0 с, АДФ + адреналин 27,6 с, АДФ + коллаген 21,6 с, адреналин + коллаген 23,7 с, АДФ + тромбин 20,6 с, коллаген + тромбин 19,4 с, АДФ + коллаген + адреналин 16,0 с) и усилением ВАТ (дискоциты 75%, диско-эхиноциты 16%, сфероциты 5%, сферо-эхиноциты 5%, биополярные формы 1%). Общий агрегационный потенциал составил .

Больному с целью выведения его из группы риска был рекомендован здоровый образ жизни с отказом от курения, приема алкоголя, нормализации режимов труда и отдыха, сна и бодрствования и введения в рацион продуктов, богатых витаминами при стабильной нормализации артериального давления с обязательным повторным осмотром через 1 мес. Назначенные мероприятия позволили нормализовать исследуемые параметры через 1 мес, устранив риск развития тромбофиллической тромбоцитопатии и обеспечив снижение общего агрегационного потенциала до 0,004. Дальнейшее соблюдение пациентом данных ему рекомендаций исключило возможность возникновения тромбофиллической тромбоцитопатии.

Пример 3. Больная М. 59 лет, страдающая артериальной гипертонией с метаболическим синдромом на протяжении 9 лет обследована во время профилактического осмотра по месту жительства. У больной была взята кровь в три пробирки и исследована по изложенной схеме, что выявило усиление адгезивно-агрегационной активности тромбоцитов (49,7%), повышение агрегационной активности тромбоцитов с рядом индукторов (АДФ 30,2 с, коллаген 30,2 с, Н2О2 35,2 с, адреналин 76,3 с, АДФ + адреналин 23,4 с, АДФ + коллаген 19,0 с, адреналин + коллаген 19,4 с, АДФ + тромбин 17,6 с, коллаген + тромбин 18,3 с, АДФ + коллаген + адреналин 14,6 с), активацию ВАТ (дискоциты 70%, диско-эхиноциты 20%, сфероциты 4%, сферо-эхиноциты 5%, биополярные формы 1%). Общий агрегационный потенциал составил . Больной на фоне стабильной гипотензивной терапии была назначена гипокалорийная диета (1786,3 ккал), способствовавшая нормализации оцениваемых параметров в течение 4 мес с приближением к нормальным показателям общего агрегационного потенциала 

Больной было рекомендовано соблюдать диету и далее, что позволило поддержать в последующем исследуемые параметры тромбоцитарного гемостаза в нормальных границах.




ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


Способ ранней диагностики тромбофилической тромбоцитопатии при метаболическом синдроме, отличающийся тем, что определяют длительность кровотечения, адгезивно-агрегационную способность тромбоцитов, их агрегационную функцию на стекле с рядом индукторов и их сочетаний, внутрисосудистую активность кровяных пластинок и ретракцию кровяного сгустка и обрабатывают результаты исследования с помощью системного многофакторного анализа, переводя каждый из определяемых показателей в сопоставимые относительные величины, на основании которых с учетом весового коэффициента, определяемого для каждого показателя на основании среднеквадратичного отклонения для данного показателя и постоянного множителя, равного 0,1, рассчитывают значение общего агрегационного потенциала - , по значению которого в ранние сроки диагносцируют развитие тромбофилической тромбоцитопатии: при значении до 0,015 отсутствует активация первичного гемостаза, что не требует лечебных вмешательств; при значении в интервале 0,16-0,049 больные с метаболическим синдромом входят в группу риска по развитию тромбофилической тромбоцитопатии и нуждаются в ежемесячном наблюдении врача с обязательным оздоровлением образа жизни; при значении 0,050 и выше имеется тромбофилическая тромбоцитопатия, требующая коррекции тромбоцитарного гемостаза.