СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ ИММУНОГЕННОСТИ КАПСУЛЬНЫХ АНТИГЕНОВ BURKHOLDERIA MALLEI

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ ИММУНОГЕННОСТИ КАПСУЛЬНЫХ АНТИГЕНОВ BURKHOLDERIA MALLEI


RU (11) 2293993 (13) C1

(51) МПК
G01N 33/53 (2006.01)
C12Q 1/04 (2006.01) 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 29.08.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(14) Дата публикации: 2007.02.20 
(21) Регистрационный номер заявки: 2005122042/13 
(22) Дата подачи заявки: 2005.07.12 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2005.07.12 
(45) Опубликовано: 2007.02.20 
(56) Аналоги изобретения: КАЛАЧЕВ И.Я. с соавт. Иммуногенный потенциал возбудителей сапа и мелиоидоза. Вестник РАМН, 1997, №6, с.32-37. RU 2188035 C1, 27.08.2002. RU 2188036 С1, 27.08.2002. НОВИКОВ Д.К. с соавт., Клеточные методы иммунодиагностики, Минск, "Беларусь", 1979, с.181-182. 
(72) Имя изобретателя: Пивень Николай Николаевич (RU); Авророва Ирина Владимировна (RU); Алексеев Владимир Валерьевич (RU); Ломова Лидия Васильевна (RU); Прошина Ольга Борисовна (RU) 
(73) Имя патентообладателя: Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт (ФГУЗ ВолгоградНИПЧИ Роспотребнадзора) (RU) 
(98) Адрес для переписки: 400131, г.Волгоград, ул. Голубинская, 7, ФГУЗ ВолгоградНИПЧИ Роспотребнадзора 

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ ИММУНОГЕННОСТИ КАПСУЛЬНЫХ АНТИГЕНОВ BURKHOLDERIA MALLEI
Изобретение относится к иммунологии и касается разработки фагоцитарной тест-системы для выявления иммуностимулирующих и иммуносупрессивных капсульных антигенов Burkholderia mallei. Тест-система состоит из неиммунных перитонеальных макрофагов морской свинки, клеток авирулентного бескапсульного варианта B.mallei 10230-11-2 и отдельных антигенных хроматографических фракций капсульного вещества типичного инкапсулированного штамма B.mallei 10230. Показатели фагоцитарной активности служат отправным критерием отбора in vitro иммуногенных капсульных антигенных комплексов возбудителя сапа с протективной функцией, что может быть использовано при разработке средств специфической профилактики сапа. Из типичного вирулентного штамма B.mallei 10230 селекционируют при помощи гипериммунной антисыворотки авирулентный бескапсульный вариант B.mallei 10230-11-2, клетки которого вносят в стеклянные флаконы со средой 199 с сывороткой крупного рогатого скота и стеклом с прикрепившемися к нему неиммунными перитонеальными макрофагами морской свинки, добавляют отдельные антигенные фракции капсулы возбудителя сапа и оценивают фагоцитабельность тест-штамма в динамике от 1 до 3 ч. По показателю фагоцитабельности (ПФ) оценивают уровни иммуностимуляции или супрессии для капсульных антигенных комплексов. Использование способа позволяет достаточно точно оценить степень иммуногенности отдельных капсульных антигенов возбудителя сапа и упростить определение за счет исключения использования иммунных макрофагов морской свинки (нечувствительного к сапу вида). 1 ил., 1 табл.




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Изобретение относится к медицине и касается разработки фагоцитарной тест-системы с целью выявления иммуностимулирующих и иммуносупрессивных капсульных антигенов Burkholderia mallei. Тест-система базируется на использовании в качестве объекта фагоцитоза селекционированного авирулентного бескапсульного варианта B.mallei 10230-11-2 и отдельных антигенных хроматографических фракций капсульного вещества типичного инкапсулированного штамма B.mallei 10230. Показатели фагоцитарной активности могут служить отправным критерием отбора in vitro иммуногенных с протективной функцией капсульных антигенных комплексов возбудителя сапа, а также иммуносупрессивных биополимеров, что может использоваться при подборе антигенных компонентов для разработки средств специфической профилактики сапа и мелиоидоза.

Известны способы определения иммуногенной и протективной активности антигенного материала возбудителя сапа, включающие в себя предварительную иммунизацию лабораторных животных как живыми или инактивированными клетками, так и отдельными антигенными комплексами, с последующим заражением животных вирулентными штаммами B.mallei и B.pseudomallei. Так, описан прием, позволяющий оценить протективность гетерологичных бактериальных живых туляремийной, противочумной и сальмонеллезной вакцин при экспериментальном сапе и мелиоидозе на модели чувствительных к этим инфекциям животных (И.Н.Манзенюк, Е.А.Ганина, В.В.Дорохин, И.Я.Калачев, В.Н.Борзенков, Э.А.Светоч. Burkholderia mallei и Burkholderia pseudomallei. Изучение иммуно- и патогенеза сапа и мелиоидоза. Гетерологичные вакцины // Антибиотики и химиотерапия. - 1999. - №44. - С.21-26). Однако данные приемы тестирования иммуногенности весьма трудоемкие и дорогостоящие. Кроме того, они не позволяют провести дифференциальный анализ воздействия определенных антигенов на звенья иммунной системы макроорганизма.

Известен способ определения иммуногенности различных вакцин при экспериментальной чуме (Г.И.Васильева, Е.П.Дорошенко, А.К.Киселева, И.А.Беспалова. Способ определения иммуногенности препаратов для профилактики чумы // Клин., лаб. диагност. - 1999. - №3. - С.37-39), при котором был применен принцип оценки иммуногенности чумных вакцинных препаратов на основе определения фагоцитарной активности иммунных перитонеальных макрофагов белых мышей в отношении вакцинного штамма Y.pestis. Однако, для достижения поставленной цели лабораторных животных подвергали иммунизации исследуемыми антигенными препаратами, придающих определенную иммунную специфичность макрофагам, которых тестировали клетками вакцинного чумного штамма.

Наиболее близким аналогом является исследование, направленное на изучение фагоцитоза возбудителей сапа и мелиоидоза в присутствии их антигенных фракций-супрессоров. Характер фагоцитоза позволяет судить об иммуносупрессивности данных биополимеров (И.Я.Калачев, А.Н.Байдусь, О.А.Иванова, Е.А.Ганина, И.А.Болдырев, Э.А.Светоч. Иммуногенный потенциал возбудителей сапа и мелиоидоза // Вестник Рос. Акад. Мед. Наук. - 1997. - №6. - С.32-37). Однако для проведения подобных исследований необходима предварительная иммунизация лабораторных животных, что усложняет процесс исследования. Вместе с тем, использование для фагоцитоза типичных вирулентных штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза может привести к интенсивному размножению бактерий и гибели фагоцитов, что не позволяет объективно оценить уровень иммуносупрессивности отдельных антигенных комплексов указанных возбудителей. Кроме того, следует отметить, что данный методический прием не используется авторами для анализа возможной иммуностимулирующей активности исследуемых антигенов.

В связи с изложенным для объективной первичной характеристики уровня иммуногенности отдельных капсульных антигенов возбудителя сапа, являющегося весьма близким по антигенной структуре возбудителю мелиоидоза, необходима такая фагоцитарная система, которая предусматривает использование бескапсульного варианта В.mallei и набор отдельных антигенных комплексов, полученных из капсульного вещества типичного вирулентного штамма возбудителя сапа. При этом можно исключить незавершенность фагоцитоза и гибель фагоцитов в связи с авирулентностью бескапсульного штамма. Вместе с тем, отпадает необходимость использования иммунных макрофагов морской свинки (нечувствительного к сапу вида), так как антигены в "чистом виде" добавляются в фагоцитарную систему вместе с клетками бескапсульного тест-штамма, что позволяет достаточно точно оценить уровень их иммуногенности.

Целью изобретения является разработка фагоцитарной тест-системы, включающей в себя неиммунные перитонеальные макрофаги морской свинки, клетки авирулентного бескапсульного штамма B.mallei и антигенные хроматографические фракции капсульного вещества возбудителя сапа, для первичной оценки уровня иммуногенности с протективным эффектом антигенных комплексов.

Цель достигается тем, что из типичного вирулентного штамма B.mallei 10230 селекционируют при помощи гипериммунной антисыворотки авирулентный бескапсульный вариант B.mallei 10230-11-2, клетки которого вносят в стеклянные флаконы со средой 199 с сывороткой крупного рогатого скота и стеклом с прикрепившемися к нему неиммунными перитонеальными макрофагами морской свинки, добавляют отдельные антигенные фракции капсулы возбудителя сапа и оценивают фагоцитабельность тест-штамма в динамике от 1 до 3 ч. По показателю фагоцитабельности оценивают уровни иммуностимуляции или супрессии капсульных антигенных комплексов.

Пример 1. Селекция и характеристика бескапсульного авирулентного варианта B.mallei. Суточную культуру, выращенную при 37°С на мясо-пептонном агаре (МПА), смывают 0.15 М раствором NaCl pH 7.0 и доводят полученную суспензию до концентрации 1×10 10 м.к./мл. 0.1 мл суспензии вносят в бульонно-сывороточную среду (БСС), состоящую из равных объемов (по 1.0 мл) мясо-пептонного бульона (МПБ) и мелиоидозной гипериммунной кроличьей сыворотки к антигену 8 (Аг8), являющимся основным компонентом капсульного вещества возбудителей сапа и мелиоидоза. Полученную смесь инкубируют при 37°С. Через сутки в пробирке наблюдается рост микроорганизма в виде агглютинативного осадка, пробирку встряхивают и дают осесть агглютинату в течение 1 ч. Переносят 0.1 мл надосадка в свежий БСС и повторяют цикл инкубации не менее трех раз. После каждого цикла проводят высевы надосадка на плотные питательные среды. Отбор колоний, образуемых дефектными по Аг8 микроорганизмами (бескапсульными) проводят на пластинках МПА, на которые высевают по 30-50 м.к. Чашки с посевами инкубируют при 37°С в течение 3-4 сут до формирования крупных колоний, после чего возле каждой изолированной колонии на расстоянии 5 мм пробивают лунки в агаре диаметром 2.5 мм. В них вносят по 5 мкл сыворотки. Чашки инкубируют еще в течение суток, затем просматривают их в проходящем свете и отбирают те колонии, которые не формируют с сывороткой зон преципитата. Контрольное электронно-микроскопическое исследование полученных мутантов подтверждает отсутствие у них капсульного образования в сравнении с исходным штаммом. Бескапсульные варианты В.mallei отличаются резко сниженной вирулентностью для высокочувствительных к сапу золотистых хомячков. ЛД50 исходного штамма B.mallei 10230 составляет 2×101 м.к., в то время как заражение животных B.mallei 10230-11-2 дозой 1×107 м.к. не приводит к летальному исходу.

Пример 2. Получение антигенных фракций капсульного вещества B.mallei. Вирулентный штамм B.mallei 10230 культивируют в течение 48 ч при 37°С на поверхности МПА pH 7.2. Выросшие микробные клетки суспендируют в 0.15 М растворе NaCl и инактивируют охлажденным (-30°С) ацетоном с последующим полным высушиванием клеток. Из сухих клеток методом водно-солевой экстракции при помощи шюттеллирования в 0.15 М растворе NaCl с 0.05% азида натрия со стеклянными бусами диаметром 4.0 мм в течение 6 ч при комнатной температуре и центрифугировании получают капсульный антигенный комплекс В.mallei, который подвергают последовательной гель- и ионообменной хроматографии на TSK HW 65F ("Toyopearl", Япония) и ДЕАЕ-Sephadex A-50 ("Pharmacia") в Cl-форме. Для гель-хроматографии (ГХ) используют стеклянную колонку размером 25×800 мм, элюцию проводят раствором, состоящим из 0.2 М NaCl, 0.05 М фосфатного буфера, 0.02% азида натрия, рН 7,2. Ионообменной хроматографии подвергают I и II пики элюата ГХ, колонку с ДЕАЕ-Sephadex уравновешивают 0,05 М Трис-HCl буфером рН 7,7, применяя для адсорбции линейный градиент NaCl в исходной буферной системе: 0,1-1,0 М. В результате ИОХ содержимого I и II пиков ГХ капсульного вещества B.mallei 10230 получают девять его антигенных фракций. Иммунохимический анализ проводят в аналитическом иммуноэлектрофорезе с использованием гомологичной гипериммунной кроличьей сыворотки к высушенным ацетоном клеткам B.mallei 10230, при этом выявляют различный антигенный состав исследуемых фракций.

Пример 3. Изучение влияния антигенных фракций капсулы возбудителя сапа на фагоцитабельность бескапсульного варианта. Перитонеальные макрофаги (ПМ) получают от морских свинок, предварительно стимулированных внутрибрюшинно за 4-5 сут 3,0 мл 1% раствора казеината натрия. Взятие клеток проводят промыванием брюшной полости животных 20 мл среды 199, содержащей 5% инактивированной сыворотки крови крупного рогатого скота и 10 ед/мл гепарина. Полученный экссудат собирают в стерильный флакон, находящийся в сосуде со льдом. Определяют количество клеток в 1 мл исследуемого раствора путем подсчета в камере Горяева и разводят средой 199 до концентрации 1×10 6 фагоцитов в 1 мл. Затем ПЭ разливают по 2,0 мл в стерильные стеклянные флаконы объемом 20 мл с помещенными в них стеклами (40×8×0.6 мм), закрывают стерильной крышкой и инкубируют в наклонном положении при 37°С в течение 1 ч. После инкубации стекла промывают средой 199 для удаления неприкрепившихся макрофагов и переносят в другие стерильные флаконы со свежей средой 199, содержащей СКР. Затем во флаконы вносят 0,1 мл взвеси B.mallei 10230-11-2 (4×107 м.к.), при этом количественное соотношение фагоцитов к микробам составляет 1:20. Сюда же вносят 0,1 мл исследуемого антигена (50 мкг по сухому весу). Флаконы инкубируют в наклонном положении 1 ч при 37°С. В контрольных флаконах в среде 199 инкубируют или только макрофаги, или только клетки B.mallei. После часовой инкубации стекла промывают в 3-х порциях по 100 мл стерильного физиологического раствора для удаления неприкрепившихся клеток и внеклеточно расположенных микробов. Одно из стекол высушивают, фиксируют и окрашивают по Романовскому-Гимзе, другое после промывания снова помещают во флаконы со свежей средой 199 и дополнительно инкубируют 2 ч. После инкубации препараты промывают, подсушивают, фиксируют и окрашивают. Мазки микроскопируют под иммерсией с увеличением 10×90. В опытах и контрольных мазках подсчитывают фагоцитарные индексы через 1 и 3 ч и рассчитывают показатель фагоцитабельности по предложенной нами формуле:



где ФИ1 и ФИ 3 - фагоцитарные индексы, подсчитанные с добавленными антигенами через 1 и 3 ч, соответственно;

ФИK1 и ФИK3 - фагоцитарные индексы (контрольные), подсчитанные с клетками тест-штамма, через 1 и 3 ч, соответственно.

Отбирают антигенные фракции, имеющие наиболее высокий показатель фагоцитабельности - иммуностимулирующие (С-2, С-4, С-7, С-8, С-9), и фракции иммуносупрессирующие, при добавлении которых в фагоцитарную систему происходят разрушение и гибель макрофагов за счет интенсивного размножения в них бактерий и цитотоксического эффекта (С-6) (см. чертеж).

Пример 4. Протективные свойства антигенных фракций капсулы возбудителя сапа. Изучение протективной активности капсульных антигенных комплексов возбудителя сапа является одним из важных этапов в скрининге препаратов, обладающих способностью защищать от мелиоидозной инфекции. Протективные свойства сапных антигенных комплексов (С-1, С-2, С-3, С-4, С-5, С-6, С-7, С-8, С-9) изучают в эксперименте на белых крысах. Животных иммунизируют антигенными фракциями однократно, подкожно, в смеси с неполным адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1 в дозе 30 мкг по белку. Через 21 сут животных заражают высоковирулентной культурой B.pseudomallei 100. Результаты опыта оценивают по показателям летальности и средней продолжительности жизни (СПЖ) павших животных в течение месяца (см. таблицу).

Таким образом, предложенная фагоцитарная тест-система для первичной оценки иммуногенности капсульных антигенных комплексов возбудителя сапа позволяет достаточно объективно при использовании в качестве объекта фагоцитоза бескапсульного варианта возбудителя сапа выявлять биополимеры, обладающие стимулирующими или супрессирующими свойствами, при этом уровни фагоцитабельности напрямую коррелируют с протективной активностью антигенов при экспериментальном мелиоидозе.


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ определения уровня иммуногенности капсульных антигенов Burkholderia mallei, отличающийся тем, что применяют фагоцитарную тест-систему, состоящую из неиммунных перитонеальных макрофагов морской свинки, клеток авирулентного бескапсульного варианта В.mallei 10230-11-2 и отдельных капсульных антигенов вирулентного штамма B.mallei 10230, для чего взвесь перитонеальных макрофагов с концентрацией 1×106 клеток/мл в среде 199 с 5% инактивированной сыворотки крупного рогатого скота (СКР) и 10% ед/мл гепарина разносят по 2,0 мл в стеклянные флаконы объемом 20,0 мл с помещенными в них стеклами (40×8×0,6 мм), инкубируют в наклонном положении при 37°С в течение 1 ч для прикрепления макрофагов, после чего стекла извлекают, промывают средой 199 и переносят в аналогичные флаконы с 2,0 мл среды 199, содержащей СКР, добавляют по 0,1 мл взвеси клеток (4×107 м.к.) Burkholderia mallei 10230-11-2 и по 0,1 мл исследуемых антигенов (50 мкг по сухому весу), опытные и контрольные (без антигена) флаконы инкубируют в наклонном положении 1 ч при 37°С, после чего стекла промывают физиологическим раствором, высушивают, фиксируют и окрашивают по Романовскому-Гимзе, дубликаты стекол помещают во флаконы со свежей средой 199 с СКР и инкубируют еще 2 ч, промывают физиологическим раствором, фиксируют и окрашивают, микроскопируют опытные и контрольные мазки через 1 и 3 ч инкубации, подсчитывают фагоцитарные индексы (ФИ), уровни иммуногенности определяют по показателям фагоцитабельности (ПФ), имеющих прямую корреляцию с протективностью при экспериментальном мелиоидозе, которые рассчитывают по формуле



где ФИ1 и ФИ 3 - фагоцитарные индексы, подсчитанные с добавленными антигенами через 1 и 3 ч соответственно;

ФИK1 и ФИK3 - фагоцитарные индексы (контрольные), подсчитанные с клетками тест-штамма через 1 и 3 ч соответственно.