СПОСОБ ИНДИКАЦИИ ГОСПИТАЛЬНЫХ ШТАММОВ СТАФИЛОКОККОВ

СПОСОБ ИНДИКАЦИИ ГОСПИТАЛЬНЫХ ШТАММОВ СТАФИЛОКОККОВ


RU (11) 2292398 (13) C2

(51) МПК
C12Q 1/04 (2006.01)
C12Q 1/14 (2006.01)
C12R 1/445 (2006.01) 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 29.08.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(14) Дата публикации: 2007.01.27 
(21) Регистрационный номер заявки: 2004132994/13 
(22) Дата подачи заявки: 2004.11.15 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2004.11.15 
(43) Дата публикации заявки: 2006.04.27 
(45) Опубликовано: 2007.01.27 
(56) Аналоги изобретения: RU 2003101899 А, 27.07.2004. SU 1277966 A1, 23.12.1986. АКАТОВ А.К., ЗУЕВА B.C. Стафилококки. АМН СССР. - М.: Медицина, 1983, с.14. СПРАВОЧНИК ПО МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИМ И ВИРУСОЛОГИЧЕСКИМ МЕТОДАМ ИССЛЕДОВАНИЯ. - Под ред. М.О.Биргера. 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 1982, с.252-253. 
(72) Имя изобретателя: Кашуба Эдуард Алексеевич (RU); Тимохина Татьяна Харитоновна (RU); Курлович Николай Алексеевич (RU); Паромова Яна Игоревна (RU); Варницына Вера Викторовна (RU); Хохлявина Роза Матыгуловна (RU); Козлов Леонид Борисович (RU) 
(73) Имя патентообладателя: Государственное образовательное учреждение Высшего профессионального образования Тюменская государственная медицинская академия (ГОУ ВПО ТюмГМА Минздрава России) (RU) 
(98) Адрес для переписки: 625023, г.Тюмень, ул. Одесская, 54, ТГМА, научный отдел, патентоведу Л.Б. Козлову 

(54) СПОСОБ ИНДИКАЦИИ ГОСПИТАЛЬНЫХ ШТАММОВ СТАФИЛОКОККОВ
Изобретение относится к иммунологии. Предложен способ индикации госпитальных штаммов Staphylococcus aureus, характеризующийся тем, что исследуемый Staphylococcus aureus культивируют 12 часов, доводят концентрацию микробной взвеси Staphylococcus aureus до рабочей концентрации 1 млрд КОЕ/мл. Приготовленную микробную взвесь в количестве 0,1 мл вносят в пробирку с 0,3 мл плазмы, разбавленной 1:5 изотоническим раствором хлорида натрия. Относят штамм Staphylococcus aureus к госпитальному штамму по коагуляции плазмы в сроки до 50 мин. Использование изобретения позволяет сократить время проведения исследований и материальные средства, а также обеспечивает 100% точность исследований. 1 табл.




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологической лабораторной диагностике возбудителей госпитальных стафилококковых инфекций.

В Тюменской области в 2000 г. зарегистрировано 1098 случаев внутрибольничных инфекций: в родовспомогательных учреждениях (51%), хирургических отделениях (22%) и амбулаторно-поликлинических учреждениях (22%). (Марченко А.Н. с соавторами. Научный вестник Тюменской медицинской академии. Медицина и охрана здоровья. Тюмень, 2001. - № 4, - с.85). В хирургических отделениях Тюменской областной клинической больницы преобладают госпитальные инфекции с гнойно-воспалительными процессами, вызванные патогенными стафилококками (Тимохина Т.Х и др. Этиология гнойных инфекций в хирургических стационарах Тюменской областной больницы / Научный вестник Тюменской медицинской академии. Медицина и охрана здоровья. Тюмень, 2002. - С.105).

Известен способ идентификации патогенных стафилококков, который включает посев патологического материала на питательные среды с последующим выделением чистой культуры и изучением биологических свойств. Идентификацию выделенной культуры проводят в течение 6-7 дней по морфологическим, культурально-биохимическим, гемолитическим, плазмокоагулирующим свойствам, лецитиназной активности и наличию энтеротоксина. Внутривидовую идентификацию выделенной культуры бактерий проводят по определению фаготипа, чувствительности к антибиотикам и другим признакам (Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. М.: Медицина. - 1978. - С.164-174).

Описанный выше метод лабораторной диагностики штаммов вида Staphylococcus aureus трудоемок, требует больших материальных затрат на питательные среды и реактивы. Для определения принадлежности выделенного штамма к госпитальному необходимо проводить дополнительные исследования по выделению возбудителей инфекции от больных, бактерионосителей и из окружающей среды с последующей их идентификацией. Лабораторные исследования проводят в течение длительного времени (6 дней и более). Вышеперечисленные недостатки способа лабораторной диагностики госпитальных штаммов S.aureus не позволяют органам практического здравоохранения широко использовать данный способ для лабораторной диагностики госпитальных штаммов.

Яфаев Р.Х и Зуева Л.П. (Эпидемиология внутрибольничной инфекции. Л.: Медицина. - 1989. - С.26-31) к госпитальным штаммам относят культуры бактерий, выделенные от больных в стационаре с ярко выраженной резистентностью "к некоторому количеству антибиотиков".

Шевченко Ю.Л. с соавторами (Шевченко Ю.Л., Гришанин В.А., Матвеев С.А., Мазайшвилли К.В. // Госпитальная инфекция и некоторые аспекты ее иммунопрофилактики / Вестник хирургии. - 1996, № 5. С.104-106) к госпитальным штаммам относят микроорганизмы с одинаковым таксономическим положением по 3-м и более признакам и маркерами устойчивости не менее чем к 5 антибактериальным препаратам в случае выделения бактерий от разных больных за ограниченный период времени.

Известен способ выявления госпитальных штаммов по определению чувствительности штаммов к антибиотикам, составлению антибиотикограмм и сопоставлению антибиотикограмм культур бактерий, выделенных от больных и из окружающей среды (RU 2003101899 А. Козлов Л.Б. С 12 Q 1/04. Опубл. 10.02.2005. Бюл. № 4), выбранный в качестве наиболее близкого аналога заявляемого изобретения. Недостатком предложенного способа является необходимость предварительного проведения идентификации возбудителей, выделенных от больных и с объектов окружающей среды с последующим определением чувствительности выделенных культур к антибиотикам.

Известен способ определения плазмокоагулирующих свойств у патогенных стафилококков, позволяющий в комплексе с другими свойствами определить вид патогенного возбудителя: Staphylococcus aureus. Способ заключается в следующем: в две пробирки наливают по 0,5 мл плазмы, разбавленной 1:5 изотоническим раствором хлорида натрия, затем в каждую пробирку вносят бактериологической петлей 18-20-часовую культуру стафилококка. Одну пробирку (опытную) засевают исследуемой культурой, вторую (первый контроль) - заведомо патогенным, плазмокоагулирующим штаммом стафилококка. Засеянные пробирки выдерживают в условиях термостата (37°С) в течение 3 часов. Если за указанное время коагуляции плазмы не происходит, пробирки оставляют при комнатной температуре еще на 18 ч. Если и через это время свертывание плазмы не произойдет, исследуемая культура является коагулазоотрицательной. Одновременно в термостат ставят несколько пробирок с незасеянной плазмой (второй контроль). Если в одной из пробирок второго контроля наступает коагуляция плазмы, обусловленная микробным загрязнением, результат опыта не учитывают. В общей сложности результат опыта учитывают через 21 час (Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. М.: Медицина. - 1978. - С.167).

Существенный недостаток предложенного способа заключается в том, что способ предназначен для выявления у патогенных стафилококков одного из наиболее часто встречающихся ферментов агрессии, а не для индикации госпитальных штаммов.

Задачей настоящего изобретения является разработка нового, экономичного экспресс-способа индикации госпитальных штаммов Staphylococcus aureus.

Технический результат - простой, не требующий больших материальных затрат экспресс-способ индикации госпитальных штаммов стафилококков, основанный на свойствах госпитальных штаммов обладать более ранней по времени плазмокоагулирующей способностью по сравнению с внебольничными штаммами патогенных стафилококков. В качестве критерия для индикации госпитальных штаммов предложено определение плазмокоагулазы у патогенных стафилококков по времени плазмокоагуляции. Использовано известное свойство патогенных стафилококков по новому назначению, а именно для индикации госпитальных штаммов.

Технический результат достигается тем, что способ индикации госпитальных штаммов S.aureus согласно изобретению проводят по коагуляции плазмы в сроки до 50 минут с 12-часовой культурой стафилококка, стандартизированной любым общепринятым способом до рабочей концентрации микробной взвеси, равной 1 млрд КОЕ/мл.

Сущность способа достигается тем, что согласно изобретению госпитальные штаммы в более короткие сроки вызывают коагуляцию плазмы по сравнению с внебольничными штаммами S.aureus, а использование стандартизированной 12-часовой культуры бактерий по сравнению с 18-20-часовой культурой позволяет получать генетически более однородные популяции бактерий.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

На стандартных питательных средах для культивирования S.aureus выращивают 12-часовую культуру стафилококка при температуре 37°С. Микробную взвесь любым общепринятым способом доводят до рабочей концентрации микробной взвеси, равной 1 млрд КОЕ/мл. Полученную взвесь бактерий в количестве 0,1 мл вносят в пробирку с 0,3 мл плазмы, разбавленной 1:5 изотоническим раствором хлорида натрия. Коагуляция плазмы происходит в условиях термостата при температуре 37°С. Учет результатов реакции наблюдают в течение 85 минут. Время коагуляции плазмы учитывают с помощью секундомера.

Предложенный способ индикации госпитальных штаммов стафилококков по сравнению с аналогами позволяет экономить материальные средства и сокращает время проведения исследований.

Примеры конкретного выполнения предлагаемого способа

Пример 1

От больного В. 26 лет, находящегося на лечении в отделении гнойной хирургии Областной клинической больницы (ОКБ) г.Тюмени, выделена культура S.aureus. Идентификация возбудителя проведена до вида в бактериологической лаборатории ОКБ г.Тюмени по общепринятым тестам для стафилококков: наличие гемолизинов, пигментов, лецитиназы на желточно-солевом агаре, плазмокоагулазы, каталазы, ферментации маннита в аэробных и анаэробных условиях, ферментации глюкозы в аэробных и анаэробных условиях.

После установления принадлежности выделенной культуры к виду S.aureus штамм исследовали на чувствительность к антибиотикам для установления принадлежности штамма к госпитальному варианту. Выделенный штамм S.aureus оказался резистентным к гентамицину, оксациллину, линкомицину, амикацину, норфлоксацину, ципрофлоксацину и поэтому отнесен к госпитальному и ему присвоен порядковый № 2888.

Выделенная культура S.aureus выращена на стандартной питательной среде (питательный агар для культивирования микроорганизмов, сухой. Министерство Здравоохранения РФ НПО "Питательные среды" г.Махачкала). Состав питательной среды, г/л: панкреатического гидролизата кильки - 17,9; агара - 11,2±1,2; натрия хлорида - 7,7±0,3. рН 7,3±0,2.

Посев выделенной культуры проведен штрихом на скошенный агар. Рост бактерий происходил в течение 12 часов при температуре 37°С, что соответствует стационарной фазе максимума роста бактерий (Пяткин К.Ю., Кривошеин Ю.С. Микробиология. М.: Медицина, 1980).

Затем готовили рабочую концентрацию микробной взвеси в физиологическом растворе, используя прибор для определения мутности бактериальной суспензии - денситометр фирмы "Biomerie". Рабочая концентрация микробной взвеси составила 3,3 единиц по MF (MacFarland), что соответствовало 1 млрд КОЕ/мл.

Рабочую концентрацию микробной взвеси в количестве 0,1 мл вносили в пробирку с 0,3 мл плазмы, разбавленной 1:5 изотоническим раствором хлорида натрия. Плазмокоагуляция проходила при температуре 37°С. Учет скорости коагуляции плазмы проводили с помощью секундомера.

Коагуляция плазмы наблюдалась через 44 мин. Выделенный штамм по времени коагуляции плазмы отнесен к госпитальному.

Пример 2

В качестве контроля изучена плазмокоагулирующая активность внебольничного музейного штамма S.aureus американской коллекции типовых культур микроорганизмов (АТСС № 209-М). Для роста бактерий использована стандартная питательная среда (питательный агар для культивирования микроорганизмов, сухой. Министерство Здравоохранения РФ НПО "Питательные среды" г.Махачкала). Состав питательной среды, г/л: панкреатического гидролизата кильки - 17,9; агара - 11,2±1,2; натрия хлорида -7,7±0,3. рН 7,3±0,2.

Посев музейного штамма АТС № 209-М проведен на скошенный агар штрихом. Рост бактерий происходил в течение 12 часов при температуре 37°С. Затем готовили рабочую концентрацию микробной взвеси в физиологическом растворе. Концентрацию микробной взвеси определяли по мутности бактериальной суспензии с помощью денситометра фирмы "Biomerie". Рабочая концентрация микробной взвеси была равна 3,3 единиц по MF (MacFarland), что соответствовало 1 млрд КОЕ/мл.

Рабочую концентрацию микробной взвеси в количестве 0,1 мл вносили в пробирку с 0,3 мл плазмы, разбавленной 1:5 изотоническим раствором хлорида натрия. Плазмокоагуляция проходила в условиях термостата при 37°С. Учет времени коагуляции плазмы проведен с помощью секундомера.

Коагуляция плазмы наблюдалась через 60 мин. Выделенный штамм по времени коагуляции плазмы отнесен к внебольничному.

Пример 3

Больной К. 45 лет, находился на лечении в отделении реанимации и интенсивной терапии ОКБ г.Тюмени. От больного выделена культура S.aureus под № 2891. Идентификация возбудителя проведена до вида в бактериологической лаборатории ОКБ г.Тюмени по общепринятым тестам для стафилококков: наличие гемолизинов, пигментов, лецитиназы на желточно-солевом агаре, плазмокоагулазы, каталазы, ферментации маннита в аэробных и анаэробных условиях, ферментации глюкозы в аэробных и анаэробных условиях.

После установления принадлежности выделенных культур к виду S.aureus штамм исследован на чувствительность к антибиотикам для установления принадлежности штамма к госпитальному варианту. Штамм S.aureus № 2891 был резистентным к гентамицину, оксациллину, линкомицину, амикацину, норфлоксацину, ципрофлоксацину и поэтому он отнесен к госпитальному.

Для роста бактерий использована стандартная питательная среда (питательный агар для культивирования микроорганизмов, сухой. Министерство Здравоохранения РФ НПО "Питательные среды" г.Махачкала). Состав питательной среды, г/л: панкреатического гидролизата кильки - 17,9; агара - 11,2±1,2; натрия хлорида - 7,7±0,3. pH 7,3±0,2.

Посев культуры № 2891 проведен на скошенный агар штрихом. Рост бактерий происходил в течение 12 часов при температуре 37°С. Затем была приготовлена рабочая концентрация микробной взвеси в физиологическом растворе, используя прибор для определения мутности бактериальной суспензии - денситометр фирмы "Biomerie". Рабочая концентрация микробной взвеси составила 3,3 единиц по MF (MacFarland), что соответствовало 1 млрд КОЕ/мл.

Рабочую концентрацию микробной взвеси в количестве 0,1 мл вносили в пробирку с 0,3 мл плазмы, разбавленной 1:5 изотоническим раствором хлорида натрия. Коагуляция плазмы проходила при 37°С. Учет результатов реакции проведен с помощью секундомера.

Коагуляция плазмы наблюдалась через 44 мин. Выделенный штамм по времени коагуляции плазмы отнесен к госпитальному.

Пример 4

Больной Т. 48 лет, находился на лечении в ожоговом отделении ОКБ г.Тюмени. От больного выделена культура S.aureus №2305. Идентификация возбудителя проведена до вида в бактериологической лаборатории ОКБ г.Тюмени по общепринятым тестам для стафилококков: наличие гемолизинов, пигментов, лецитиназы на желточно-солевом агаре, плазмокоагулазы, каталазы, ферментации маннита в аэробных и анаэробных условиях, ферментации глюкозы в аэробных и анаэробных условиях.

Установлено, что выделенная культура обладала свойствами, характерными для вида S.aureus. Штамм исследован на чувствительность к антибиотикам. Штамм S.aureus № 2305 был резистентным к гентамицину, оксациллину, линкомицину, амикацину, норфлоксацину, ципрофлоксацину и поэтому отнесен к госпитальному.

Для роста бактерий использована стандартная питательная среда (питательный агар для культивирования микроорганизмов, сухой. Министерство Здравоохранения РФ НПО "Питательные среды", г.Махачкала).

Посев выделенной культуры проведен штрихом на скошенный агар. Рост бактерий происходил в течение 12 часов при температуре 37°С. Затем была приготовлена рабочая концентрация микробной взвеси в физиологическом растворе. С помощью прибора для определения мутности бактериальной суспензии - денситометра фирмы "Biomerie". Рабочая концентрация микробной взвеси составила 3,3 единиц по MF (MacFarland), что соответствовало 1 млрд КОЕ/мл.

Рабочую концентрацию микробной взвеси в количестве 0,1 мл вносили в пробирку с 0,3 мл плазмы, разбавленной 1:5 изотоническим раствором хлорида натрия. Коагуляция плазмы проходила при 37°С. С помощью секундомера определяли время, в течение которого происходила коагуляция плазмы.

Коагуляция плазмы наблюдалась через 45 мин. Штамм отнесен к госпитальному.

Пример 5

Больной Ц. 29 лет, находился на лечении в ожоговом отделении ОКБ г.Тюмени. От больного выделена культура S.aureus № 1719. Идентификация возбудителя проведена до вида в бактериологической лаборатории ОКБ г.Тюмени по общепринятым тестам для стафилококков: наличие гемолизинов, пигментов, лецитиназы на желточно-солевом агаре, плазмокоагулазы, каталазы, ферментации маннита в аэробных и анаэробных условиях, ферментации глюкозы в аэробных и анаэробных условиях.

Культура бактерий отнесена к виду S.aureus. Штамм исследован на чувствительность к антибиотикам и оказался чувствительным к гентамицину, оксациллину, линкомицину, амикацину, норфлоксацину, ципрофлоксацину и поэтому он был отнесен к внебольничному.

Для роста бактерий использована стандартная питательная среда (питательный агар для культивирования микроорганизмов, сухой. Министерство Здравоохранения РФ НПО "Питательные среды", г.Махачкала).

Посев выделенной культуры проведен штрихом на скошенный агар. Рост бактерий происходил в течение 12 часов при температуре 37°С. Затем была приготовлена рабочая концентрация микробной взвеси в физиологическом растворе. С помощью прибора для определения мутности бактериальной суспензии - денситометра фирмы "Biomerie". Рабочая концентрация микробной взвеси составила 3,3 единиц по MF (MacFarland), что соответствовало 1 млрд КОЕ/мл.

Рабочую концентрацию микробной взвеси в количестве 0,1 мл вносили в пробирку с 0,3 мл плазмы, разбавленной 1:5 изотоническим раствором хлорида натрия. Коагуляция плазмы проходила при 37°С. С помощью секундомера определяли время, в течение которого происходила коагуляция плазмы.

Коагуляция плазмы наблюдалась через 81 мин. Штамм отнесен к внебольничному.

Со штаммами АТСС 209-М, 2888, 2891, 2305, 1719 проведено 10 опытов для определения плазмокоагулирующей активности. Результаты опытов представлены в таблице.

Исследования по идентификации штаммов S.aureus проведены в бактериологической лаборатории ОКБ г.Тюмени по общепринятым методикам.

За 2004 г. исследовано 1233 штаммов бактерий, выделенных от больных, находящихся на лечении в ОКБ г.Тюмени. Заболеваемость, вызванная S.aureus, составила 18%. Чаще всего S.aureus выделяли от больных ожогового отделения (32,4%), гнойной хирургии (26,5%), реанимации и интенсивной терапии (10,3%). Выделенные стафилококки в 32,4% обладали множественной устойчивостью к антибиотикам. На основании устойчивости к оксациллину, гентамицину, амикацину, ципрофлоксацину, линкомицину данные штаммы были отнесены к госпитальным. Итак, наиболее часто госпитальные штаммы выделялись в отделениях хирургии, ожоговом и реанимации и интенсивной терапии. Поэтому для исследования были взяты 3 штамма вида S.aureus, выделенных из этих отделений. Исследования по плазмокоагулирующей активности штаммов проведены на базе бактериологической лаборатории кафедры микробиологии ГОУ ВПО Тюменской государственной медицинской академии Росздрава.

Приведенные примеры иллюстрируют возможность применения предложенного способа для индикации госпитальных штаммов.

Предложенный способ индикации госпитальных штаммов стафилококков не требуют больших материальных затрат, легко воспроизводим, сокращает сроки выявления госпитальных штаммов стафилококков и позволяет проводить индикацию госпитальных штаммов стафилококков, обладающих плазмокоагулирующей активностью, с точностью 100%.

Таблица

Время коагуляции плазмы (в мин) госпитальных и внебольничных штаммов S.aureus 
п/п

№ опыта Штаммы вида S.aureus 
АТСС 209-М 2888 2891 2305 1719 
Время коагуляции плазмы (в мин) 
1 60 44 44 45 81 
2 63 41 43 47 80 
3 61 45 41 46 86 
4 60 43 45 48 83 
5 61 45 44 41 87 
6 64 43 45 45 81 
7 60 44 44 45 81 
8 64 45 46 44 87 
9 64 44 46 46 86 
10 63 43 47 46 81 
Средний показатель времени коагуляции штаммов 62±1,6 43,7±1,06 44,5±1,3 45,3±1,3 83,3±2,5 





ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


Способ индикации госпитальных штаммов Staphylococcus aureus, характеризующийся тем, что исследуемый Staphylococcus aureus культивируют 12 ч, доводят концентрацию микробной взвеси Staphylococcus aureus до рабочей концентрации 1 млрд. КОЕ/мл, приготовленную микробную взвесь в количестве 0,1 мл вносят в пробирку с 0,3 мл плазмы, разбавленной 1:5 изотоническим раствором хлорида натрия, по коагуляции плазмы в сроки до 50 мин относят штамм Staphylococcus aureus к госпитальному штамму.