РЕКОМБИНАНТНЫЕ АНТИТЕЛА И КОМПОЗИЦИИ, А ТАКЖЕ СПОСОБЫ ИХ СОЗДАНИЯ И ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

РЕКОМБИНАНТНЫЕ АНТИТЕЛА И КОМПОЗИЦИИ, А ТАКЖЕ СПОСОБЫ ИХ СОЗДАНИЯ И ИСПОЛЬЗОВАНИЯ


RU (11) 2292353 (13) C2

(51) МПК
C07K 16/08 (2006.01)
C12N 15/13 (2006.01)
C12N 15/63 (2006.01)
A61K 39/12 (2006.01) 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 29.08.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(14) Дата публикации: 2007.01.27 
(21) Регистрационный номер заявки: 2004108115/13 
(22) Дата подачи заявки: 2002.08.21 
(30) Приоритетные данные: 60/314,023 2001.08.21 US 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2002.08.21 
(43) Дата публикации заявки: 2005.09.27 
(45) Опубликовано: 2007.01.27 
(56) Аналоги изобретения: RU 2130187 C1, 10.05.1999. WO 8909789 A, 19.10.1989. CHEUNG et al. A recombinant human Fab expressed in Escherichia coli neutralizes rabies virus. Journal of virology. Nov. 1992, с.6714-6720. 
(72) Имя изобретателя: ХУПЕР Дуглас К. (US); ДИТЦШОЛЬД Бернхард (US) 
(73) Имя патентообладателя: ТОМАС ДЖЕФФЕРСОН ЮНИВЕРСИТИ (US) 
(85) Дата соответствия ст.22/39 PCT: 2004.03.22 
(86) Номер и дата международной или региональной заявки: US 02/26584 (21.08.2002) 
(87) Номер и дата международной или региональной публикации: WO 03/016501 (27.02.2003) 
(98) Адрес для переписки: 129010, Москва, ул. Б.Спасская, 25, стр.3, ООО "Юридическая фирма Городисский и Партнеры", пат.пов. Г.Б. Егоровой, рег.№ 513 

(54) РЕКОМБИНАНТНЫЕ АНТИТЕЛА И КОМПОЗИЦИИ, А ТАКЖЕ СПОСОБЫ ИХ СОЗДАНИЯ И ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. В изобретении описывается антитело и его фрагменты, нейтрализующие вирус бешенства; способ лечения субъекта, подвергшегося воздействию вируса бешенства с использованием указанного антитела и его фрагмента. Раскрыты варианты выделенных нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды, несущих соответственно легкую и/или тяжелую цепь антитела. Описан экспрессирующий вектор, несущий по меньшей мере одну из указанных нуклеиновых кислот. Использование изобретения повышает длительность выживания субъектов после воздействия на них вируса бешенства и может найти применение в соответствующей профилактической терапии таких субъектов. 6 н. и 8 з.п. ф-лы, 1 табл.




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка имеет приоритет в соответствии Предварительной Заявкой США №60/314023, поданной 21 августа 20 г., которая включена здесь в качестве ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ НАСТОЯЩЕЕ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к рекомбинантным антителам, в том числе к последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислотной последовательности моноклональных антител человека, нейтрализующих вирус бешенства.

ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗВЕСТНОГО УРОВНЯ ТЕХНИКИ

Бешенство представляет собой острое неврологическое заболевание, вызываемое инфицированием центральной нервной системы вирусом бешенства, представителем рода Lyssavirus семейства Rhabdovirldae. Из-за большой исторической значимости, связанной с его древностью и устрашающей природой данного заболевания, вирус бешенства продолжает представлять собой опасную инфекцию для человека и в ветеринарии из-за обширного распространения среди различных видов диких животных. Почти по всему миру для определенных видов наземных животных эндемичны разные варианты вируса бешенства, которые имеют мало общего между собой, особенно у. Несмотря на то, что в некоторых регионах, включая Великобританию, Австралии, Японию и многие острова, бешенство наземных животных отсутствует, вирус бешенства и вирусы, связанные с бешенством, ассоциированные с летучими мышами, в последнее время идентифицированы в Великобритании и Австралии.

Вирус бешенства представляет собой типичную оболочечную частицу пулевидной формы, в среднем, от 75 до 180 нанометров. Вирион состоит из одноцепочечного обратносмыслового РНК-генома и пяти структурных белков: нуклеопротеиновых (N) молекул, фосфопротеина (NS), полимеразы (L), матриксного белка (М) и вирусного гликопротеина (G).

Белки N и G несут антигенные детерминанты, которые позволяют серотипически характеризовать разные штаммы вируса бешенства. Детерминанты N высококонсервативны у разных вирусных изолятов и являются поэтому очень удобными мишенями для иммуногистологического определения инфекции вируса бешенства с использованием специфичных антител. С другой стороны, антигенные детерминанты, содержащиеся в белке G, существенно варьируют среди штаммов вируса бешенства. Нейтрализующие вирус антитела, индуцируемые при вакцинации инактивированным вирусом, направлены против G. Хотя ясно, что Т-клеточные ответы на G, N, и NS, принимают участие в иммунных ответах на данный вирус в экспериментальных условиях, оценка иммунитета к вирусу бешенства обычно ограничивается серологическими исследованиями, особенно что касается антител, нейтрализующих вирус.

В тех областях по всему миру, в которых все еще распространено заболевание человека бешенством, собака является основным резервуаром данного вируса, который поражает людей. Поскольку бешенство собак было в большинстве своем ликвидировано путем вакцинации, лисы, койоты, скунсы, еноты, летучие мыши, и ряд других млекопитающих дали убежище вариантам данного вируса. Во многих областях резервуары вируса, благодаря диким животным, продолжают расширяться. Кроме того, вирус бешенства может быть передан от видов-резервуаров людям или другим конечным хозяевам животными, обычно не ассоциируемыми с бешенством, такими, например, как кошки, кролики и т.п.

Будучи почти неотвратимо смертельным при проявлении клинических симптомов, бешенство может быть предотвращено путем неотложного лечения инфицированного индивида сочетанием пассивной и активной иммунизации. Пассивная иммунизация состоит из введения уже готовых антител, нейтрализующих вирус бешенства, полученных из объединенной сыворотки индивидов, обладающих иммунитетом к бешенству (иммуноглобулин человека против бешенства; HRIG), или гипериммунизированных лошадей (иммуноглобулин лошадей против бешенства; ERIG). Оба вида реагентов представляют определенный риск для реципиентов, в том числе из-за переменной антигенной специфичности и, следовательно, разного действия на разные изоляты вируса бешенства.

HRIG получают из объединенной человеческой сыворотки, поэтому существует вероятность того, что препараты HRIG могут быть контаминированы известными или неизвестными патогенами человека. С другой стороны, будучи препаратом чужеродного антигена, ERIG связан с тяжелыми анафилактическими реакциями. Мышиные моноклональные антитела, специфичные к вирусу бешенства, предполагается использовать для послеэкспозиционной профилактики, но, подобно ERIG, они антигенно чужеродны для людей. Это может привести к их быстрому выведению из организма человека, а также вызвать возможную анафилактическую реакцию.

Использование человеческих моноклональных антител ограничено, поскольку гибридомные клеточные линии человека трудны в получении, как правило, нестабильны, и не образуют моноклональных антител соответствующей специфичности в достаточных количествах, а также довольно дорогие. Себестоимость моноклональных антител заставляет искать более экономичные альтернативы получению моноклональных антител из гибридом.

Четко установлено, что области Fab и Fab2, которые содержат зариабельные и шарнирные участки тяжелой и легкой цепей, не защищают от инфекции вирусом бешенства. Эффективность антител in vivo зависит от полной последовательности, то есть антирабическую активность проявляют только определенные антитела. За иммунореактивность ответственна константная область антитела. Поэтому она является свойством константной области(ей), которая необходима для защиты против вируса бешенства. Вариабельные области, сплайсированные с константной областью другого антитела, т.е. антитела против вируса бешенства, полученного искусственно, неэффективны.

Существует потребность в рекомбинантных антителах, применимых для диагностики, профилактики и лечения инфекции бешенства, содержащих их фармацевтических композициях и предусматривающих их использование способах. Существует потребность в композициях и способах получения таких рекомбинантных антител.

Существует потребность в рекомбинантных антителах, применимых для диагностики, профилактики и лечения инфекции патогенов, воздействующих на нервную ткань, содержащих их фармацевтических композициях и предусматривающих их использование способах. Существует потребность в композициях и способах получения рекомбинантных антител.

Для создания наилучшего реагента были созданы человеческие моноклональные антитела путем слияния трансформированных вирусом Эпштейна-Барр (EBV) специфичных к вирусу бешенства В-клеток человека и мышиных-человеческих гетерогибридных доноров. Клоны кДНК, кодирующие тяжелую и легкую цепи антител в этих клетках, конструировали так, чтобы данные антитела экспрессировались в гетерологичных экспрессирующих системах. Эти конструкции делают возможным получение в контролируемых системах нейтрализующих вирус бешенства человеческих антител определенной специфичности, не содержащих возможных вредных примесей. Настоящее изобретение относится к данным моноклональным антителам человека, нейтрализующим вирус бешенства, последовательностям нуклеиновых кислот их тяжелых и легких цепей и аминокислотным последовательностям данных кодируемых белков. Настоящее изобретение также относится к способам использования указанных моноклональных антител в качестве терапевтически эффективного послеэкспозиционного профилактического лечения индивидов, подвергшихся воздействию вируса бешенства.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩЕСТВА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к рекомбинантным антителам, композициям и способам получения таких антител. В соответствии с некоторыми аспектами настоящего изобретения, настоящее изобретение относится к рекомбинантным антирабическим антителам, а также композициям и способам получения таких антител. В соответствии с некоторыми аспектами настоящего изобретения, настоящее изобретение относится к рекомбинантным антителам со специфичной константной областью, которая делает их особенно эффективными в борьбе с патогенами, которые поражают нервную систему.

Кроме того, настоящее изобретение относится к выделенным последовательностям ДНК, к рекомбинантным векторам, содержащим такие последовательности, к клеткам-хозяевам, содержащим такие векторы, и к способам получения рекомбинантных антител с использованием таких клеток-хозяев.

Настоящее изобретение дополнительно относится к использованию рекомбинантных антител для диагностики, профилактики и лечения патогенных инфекций нервной ткани, особенно бешенства.

Настоящее изобретение относится к молекулам выделенной нуклеиновой кислоты, обладающим последовательностью нуклеиновой кислоты тяжелой цепи и легкой цепи, кодирующим аминокислотную последовательность тяжелой и легкой цепи. Аминокислотные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи представляют собой аминокислотные последовательности нейтрализующего вирус бешенства моноклонального антитела, которое специфически связывается с белком вируса бешенства.

Настоящее изобретение относится к молекулам выделенной нуклеиновой кислоты, которые кодируют нейтрализующее вирус бешенства моноклональное антитело, которые являются производными последовательностей кДНК тяжелой цепи SEQ ID NO:1 и легкой цепи SEQ ID NO:2.

Настоящее изобретение относится к выделенному нейтрализующему вирус бешенства моноклональному антителу человека, кодируемому клонами кДНК, кодирующими тяжелую и легкую цепи антитела, экспрессируемые в гетерологичных экспрессирующих системах и не содержащие вредных примесей. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения аминокислотная последовательность выделенного моноклонального антитела человека, нейтрализующего вирус бешенства, представляет собой, соответственно, SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4.

Настоящее изобретение относится к слитому гену, кодирующему химерную легкую цепь иммуноглобулина. Данная химерная легкая цепь содержит первую последовательность ДНК, кодирующую вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина моноклонального антитела, нейтрализующего вирус бешенства, полученную с помощью гетерогибридомной клеточной линии; и вторую последовательность ДНК, кодирующую константную область легкой цепи человека. Настоящее изобретение относится к экспрессирующему вектору, который экспрессирует данный слитый ген. Следующим объектом является клетка-хозяин для экспрессирующего вектора.

Настоящее изобретение относится к слитому гену, кодирующему химерную тяжелую цепь иммуноглобулина. Данная химерная тяжелая цепь содержит первую последовательность ДНК, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина моноклонального антитела, нейтрализующего вирус бешенства, полученного с помощью гетерогибридомной клеточной линии; и вторую последовательность ДНК, кодирующую константную область тяжелой цепи человека. Настоящее изобретение относится к экспрессирующему вектору, который экспрессирует данный слитый ген. Дополнительная цель заключается в создании клетки-хозяина для созданного экспрессирующего вектора.

Настоящее изобретение относится к выделенному моноклональному антителу, нейтрализующему вирус бешенства, производное слитого гена, кодирующего химерную легкую цепь иммуноглобулина, и слитого гена, кодирующего химерную тяжелую цепь иммуноглобулина.

Настоящее изобретение относится к способу лечения индивида, подвергшегося воздействию вируса бешенства, путем введения данному индивиду терапевтически эффективного количества моноклонального антитела человека, нейтрализующего вирус бешенства, который кодируется клонами кДНК, кодирующими тяжелую и легкую цепи данного антитела, экспрессируемые в гетерологичных экспрессирующих системах и не содержащих вредных примесей, предотвращая тем самым проникновение вируса бешенства в центральную нервную систему.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к моноклональным антителам, которые специфически связываются с гликопротеином вируса бешенства разных штаммов. Послеэкспозиционное лечение с помощью моноклонального антитела, или смесью разных моноклональных антител, будет нейтрализовать вирус бешенства на уровне ворот инфекции и препятствовать распространению данного вируса в центральную нервную систему (ЦНС). Поэтому, при чрескожном или мукозальном контакте с вирусом бешенства в место укуса вкапывают, а также вводят системно, специфичные к вирусу бешенства моноклональные антитела. Поскольку репликация вируса ограничивается почти исключительно нервными клетками, нейтрализация и клиренс данного вируса с помощью моноклональных антител настоящего изобретения перед его проникновением в ЦНС представляет собой эффективную послеэкспозиционную профилактику.

Первый аспект настоящего изобретения заключается в создании последовательностей моноклональных антител против вируса бешенства. Хотя большая часть вариабельной области Mab 57 хорошо известна (Cheung и соавт., J. Virol. 66:6714-6720, 1992, которые включены здесь в качестве ссылки), константная область остается неизвестной. Было клонировано и секвенировано полное моноклональное антитело, и константная, и вариабельная области. Настоящее изобретение относится к новой нуклеотидной последовательности константной области Mab 57, нуклеотиды 476-1431, которая включает константный домен 1 (CH1) и шарнирную область. Данная последовательность может использоваться в рекомбинантных антителах, включая антирабические антитела, или в рекомбинантных антителах, нацеленных против других патогенов, которые поражают нервную ткань, таких как энцефалит и герпес.

Настоящее изобретение относится к рекомбинантным антителам, к клонам генов, которые кодируют их, к векторам, которые включают клонируемые гены, и к клеткам-хозяевам, которые включают данные векторы. Настоящим изобретением разработаны также способы получения и использования данных рекомбинантных антител.

Настоящее изобретение относится к рекомбинантным антителам, полученным из Mab 57. Получаемые из гибридом Mab 57 представляют собой антитела IgG2; рекомбинантные антитела, получаемые из Mab 57, представляют собой антитела IgGI. Настоящее изобретение относится к рекомбинантным антителам, полученным из Mab 57, к клонам генов, которые кодируют их, к векторам, которые включают клонируемые гены и к клеткам-хозяевам, которые включают данные векторы. Настоящее изобретение относится также к способам создания и использования данных рекомбинантных антител.

Настоящее изобретение относится также к полной последовательности тяжелой и легкой цепей антирабического моноклонального антитела Mab JA. Настоящее изобретение относится к рекомбинантным антителам, полученным из Mab JA, к клонам генов, которые кодируют их, к векторам, которые включают клонируемые гены, и к клеткам-хозяевам, которые включают данные векторы. Настоящее изобретение относится также к способам создания и использования рекомбинантных антител.

Настоящее изобретение относится также к полной последовательности тяжелой и легкой цепей антирабического моноклонального антитела Mab JB.1. Настоящее изобретение относится к рекомбинантным антителам, полученным из Mab JB.1, к клонам генов, которые кодируют их, к векторам, которые включают клонируемые гены, и к клеткам-хозяевам, которые включают данные зекторы. Настоящим изобретением разработаны также способы создания и использования рекомбинантных антител.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения рекомбинантное антитело настоящего изобретения представляет собой одноцепочечное антитело, в котором тяжелая цепь вариабельного домена и легкая цепь вариабельного домена соединены с помощью спейсерной группы, предпочтительно пептида. Наиболее предпочтительным является одноцепочечное антитело, в котором вариабельный домен тяжелой цепи локализован на N-конце данного рекомбинантного антитела. Данное одноцепочечное рекомбинантное антитело может дополнительно включать эффекторную молекулу и/или сигнальные последовательности, облегчающие процессинг данного антитела в клетке-хозяине, в которой его получают.

Рекомбинантные антитела настоящего изобретения могут использоваться для идентификации вируса бешенства, например, с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания инфицированных клеток, с помощью иммуноблоттинга непосредственно или путем иммунопреципитации и переноса белка из иммунокомплексов, либо с помощью иного иммуноанализа, например связывания, перекрестного ингибирования или конкурентного радио- либо иммуноферментного анализа.

Кроме того, в настоящем изобретении рассматривается способ производства рекомбинантных антител настоящего изобретения. рекомбинантные антитела настоящего изобретения можно получить с помощью методов рекомбинантной ДНК, предусматривающих культивирование трансформированного хозяина в условиях, обеспечивающих его экспрессию и выделение указанного антитела.

Более конкретно, настоящее изобретение относится также к способу получения рекомбинантного антитела, предусматривающему культивирование хозяина, трансформированного гибридным вектором, содержащим экспрессирующую кассету, включающую промотор и ДНК, кодирующую указанное рекомбинантное антитело, причем ДНК контролируется указанным промотором, и выделения указанного рекомбинантного антитела.

Производство in vitro позволяет получать относительно чистые препараты антител и масштабировать процесс для получения больших количества желаемых антител. Методы культивирования бактериальных клеток, дрожжей или клеток млекопитающих хорошо известны в данной области техники и включают в себя гомогенную суспензионную культуру, например, в эрлифтном реакторе или в реакторе непрерывного действия с механическим перемешиванием, либо иммобилизованную клеточную культуру или клеточную культуру с включением, например, в полые волокна, в микрокапсулы, в агарозные микрошарики или в керамические картриджи.

Вырожденные последовательности являются вырожденными в смысле генетического кода, в соответствии с которым неограниченное количество нуклеотидов заменяется другими нуклеотидами без изменения исходно кодируемых аминокислотных последовательностей. Такие вырожденные последовательности могут находить применение благодаря различию их сайтов рестрикции и/или частоты отдельных кодонов, которые являются предпочтительными у конкретного хозяина, в частности E.coli, для достижения оптимальной экспрессии данного рекомбинантного антитела.

Кроме того, в настоящем изобретении рассматривается рекомбинантная ДНК, которая представляет собой гибридный вектор, включающий вставку, кодирующую рекомбинантное антитело, описанное выше, и, необязательно, точку начала репликации или автономно реплицирующуюся последовательность, одну или несколько доминантных маркерных последовательностей, контролирующие экспрессию последовательности, сигнальные последовательности и дополнительные сайты рестрикции.

Векторы обычно выполняют две функции во взаимодействии с совместимыми клетками-хозяевами. Первая функция заключается в обеспечении клонирования нуклеиновой кислоты, которая кодирует иммуноглобулиновые домены, т.е. в получении используемых количеств данной нуклеиновой кислоты (клонирующие векторы). Другая функция заключается в обеспечении репликации и экспрессии рекомбинантных генных конструкций в подходящем хозяине, либо путем сохранения в качестве внехромосомного элемента, либо путем интеграции в хромосому данного хозяина (экспрессирующие векторы). Клонирующий вектор включает описанные выше рекомбинантные генные конструкции, точку начала репликации или автономно реплицирующуюся последовательность, доминантные маркерные последовательности и, необязательно, сигнальные последовательности и дополнительные сайты рестрикции. Экспрессирующий вектор дополнительно включает контролирующие экспрессию последовательности, необходимые для транскрипции и трансляции рекомбинантных генов.

Точка начала репликации или автономно реплицирующаяся последовательность обеспечивается либо путем конструирования вектора, который включает экзогенную точку начала, такой как полученный из вируса 40 иммунодефицита обезьян (SV 40), или из другого вирусного источника, либо с помощью хромосомных механизмов клетки-хозяина.

Указанные маркеры обеспечивают возможность отбора клеток-хозяев, которые содержат данный вектор. Маркеры отбора включают гены, которые придают резистентность к тяжелым металлам, таким как медь, или к антибиотикам, таким как генитицин (G-418) или гигромицин, или гены, которые комплементируют с генетическим повреждением клетки-хозяина, таким, например, как отсутствие тимидинкиназы, гипоксанитинфосфорилтрансферазы, дигидрофолатредуктазы и тому подобное.

Сигнальные последовательности могут представлять собой, например, последовательности-предшественники или секреторные лидерные последовательности, управляющие секрецией данного рекомбинантного антитела, сигналы сплайсинга и тому подобное. Примеры сигнальных последовательностей, управляющих секрецией данного рекомбинантного антитела, представляют собой последовательности, полученные из гена ompA, гена pelB (пектатлиазы) или гена phoA.

В качестве контролирующих экспрессию последовательностей векторная ДНК включает промотор, последовательности, необходимые для инициации и терминации транскрипции и для стабилизации мРНК, и, необязательно, энхансеры и дополнительные регуляторные последовательности.

Можно использовать широкий ряд промотирующих последовательностей, в зависимости от природы клетки-хозяина. Промоторы, которые являются сильными и, в то же время, хорошо регулируемыми, являются наиболее пригодными. Последовательности для инициации трансляции представляют собой, например, последовательности Шайн-Дальгарно. Последовательности, необходимые для инициации и терминации транскрипции и для стабилизации мРНК, обычно находятся, соответственно, в некодирующих 5'-областях и 3'-областях вирусной или эукариотической кДНК, например, из данного экспрессирующего хозяина. Энхансеры и стимулирующие транскрипцию последовательности ДНК вирусного происхождения, например, полученные из вируса иммунодефицита обезьян, полиомного вируса, вируса папилломы крупного рогатого скота или вируса саркомы Молони, или геномного происхождения, особенно мыши.

Разные сегменты ДНК векторной ДНК соединены путем сшивки, т.е. они являются непрерывными и находятся в функциональной взаимосвязи друг с другом. Примерами векторов, которые применимы для репликации и экспрессии в штамме E.coli, являются бактериофаги, например, производные лямбда-бактериофагов, или плазмиды, такие, например, в частности, как плазмида ColE1 и ее производные, например, рМВ9, pSF2124, pBR317 или pBR322, а также ллазмиды, полученные из pBR322, такие как pUC9, pUCKO, pHRi148 и рLc24. Подходящие векторы содержат полный репликон, маркерный ген, последовательности, узнающие рестрикционные эндонуклеазы, так что чужеродную ДНК и, при необходимости, экспрессирующую контрольную последовательность можно встроить в эти сайты, а также необязательно сигнальные последовательности и энхансеры.

Промоторы микроорганизмов представляют собой, например, сильный левый промотор РL бактериофага X, который контролируется температурно-чувствительным репрессором. Подходящими также являются промоторы E.coli, такие как lac (лактозный)-промотор, регулируемый lac-репрессором и индуцируемый изопропил-бета-D-тиогалактозидом, trp (триптофановый)-промотор, регулируемый trp-репрессором и индуцируемый, например, при триптофановом голодании, а также tac (гибридный trp-lac-промотор), регулируемый lac-репрессором.

Векторы, применимые для репликации и экспрессии в дрожжах, содержат дрожжевую точку начала репликации и генетический маркер отбора для дрожжей. Одна группа таких векторов включает так называемые ars-последовательности (автономные репликационные последовательности) в качестве точки начала репликации. Данные векторы сохраняются внехромосомно в дрожжевой клетке после трансформации и реплицируются автономно. Кроме того, можно использовать векторы, которые содержат всю или часть 2 мкм - плазмидной ДНК Saccharomyces cerevisiae. Такие векторы будут интегрироваться путем рекомбинации в уже существующие в данной клетке 2 мкм плазмиды или реплицироваться автономно. 2 мкм последовательности особенно пригодны для достижения высокой частоты трансформации и большого числа копий.

Контролирующие экспрессию последовательности, которые применимы для экспрессии в дрожжах, представляют собой, например, контрольные последовательности высокоэкспрессируемых дрожжевых генов. Поэтому, можно использовать промоторы генов ТRP1, ADHI или ADHII, гена кислой фосфатазы (РНО3 или РНО5), изоцитохромного гена или промотор, вовлеченный в гликолитический путь, такой как промотор генов енолазы, глицеральдегид-3-фосфаткиназы (PGK), гексокиназы, пируватдекарбоксилазы, фосфофруктокиназы, глюкозо-6-фосфатизомеразы, 3-фосфоглицератмутазы, пируваткиназы, триозофосфатизомеразы, фосфоглюкозизомеразы, и глюкокиназы.

Векторы, применимые для репликации и экспрессии в клетках млекопитающих, предпочтительно содержат промотирующие последовательности, полученные из ДНК вирусного происхождения, например из вируса 40 иммунодефицита обезьян (SV40), вируса саркомы Рауса (RSV), аденовируса 2, вируса папилломы крупного рогатого скота (BPV), BK-мутанта паповавируса (BKV) или цитомегаловируса (CMV) мыши или человека. Альтернативно, векторы могут включать промоторы из продуктов экспрессии млекопитающих, таких как актин, коллаген, миозин и т.п., или нативный промотор и контрольные последовательности, которые обычно ассоциированы с желаемой генной последовательностью, т.е. промотор Н-цепи или L-цепи иммуноглобулина.

Некоторые предпочтительные векторы применимы как для прокариотических, так и для эукариотических хозяев и основываются на вирусных репликационных системах. Особенно предпочтительны векторы, включающие промоторы вируса иммунодефицита обезьян, например pSVgpt или pSVneo, дополнительно включающие энхансер, например, энхансер обычно ассоциированный с последовательностями иммуноглобулинового гена, s частности, энхансер Н- или L-цепи Ig мыши.

Рекомбинантную ДНК, кодирующую рекомбинантное антитело настоящего изобретения, можно получить, например, путем культивирования трансформированной клетки-хозяина и необязательного выделения полученной ДНК.

Кроме того, настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, трансформированным с помощью описанных выше рекомбинантных ДНК, а именно клеткам-хозяевам, трансформированным ДНК, кодирующей тяжелую цепь и/или ДНК, кодирующей легкую цепь рекомбинантного антитела, в особенности, к клеткам-хозяевам, трансформируемым с помощью ДНК, кодирующей одноцепочечное рекомбинантное антитело.

В частности, в настоящем изобретении рассматривается клетка-хозяин, трансформированная гибридным вектором, содержащим экспрессирующую кассету, включающую промотор и ДНК, кодирующую рекомбинантное антитело.

Кроме того, настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, трансформированной гибридным вектором, содержащим экспрессирующую кассету, включающую промотор, функционально связаны с первой последовательностью ДНК, кодирующей сигнальный пептид, присоединенный в открытой рамке считывания ко второй последовательности ДНК, кодирующей рекомбинантное антитело.

Примеры подходящих хозяев представлены микроорганизмами, которые не содержат или содержат мало ферментов рестрикции или модифицирующих ферментов, таких как бактерии, в частности штаммами Escherichia coli, например E.coli X1776, E.coli Y1090, Е.coli HB 101, E.coli W3110, E.coli HB 101/LM1055, E.coli JA 221, E.coli DH5.alpha., E.coli K12, или E.coli штамм СС118, Bacillus subtilis. Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas, Haemophilus, Streptococcus и другими, а также дрожжами, например Saccharomyces cerevisiae, такими как S.cerevisiae 3RF 18. Кроме того, подходящие клетки-хозяева представлены клетками высших организмов, в особенности стабильными непрерывными клеточными линиями человека или животных, например легочными фибробластами L132 эмбриона человека, клетками Bowes злокачественной меланомы человека, клетками HeLa, трансформированными вирусом SV40 почечными клетками африканской зеленой мартышки COS-7 или клетками яичников китайского хомячка (СНО) или клетками лимфоидного происхождения, такими как лимфомные, миеломные, гибридомные, триомные или квадромные клетки, например, PAI, Sр2/0 или Х63-Аg8.653.

Настоящее изобретение относится также к способам получения трансформированных клеток-хозяев, в которых подходящие реципиентные клетки-хозяева, как описано выше, трансформируются с помощью гибридного вектора в соответствии с настоящим, изобретением, и полученные трансформированные клетки отбирают. Трансформацию микроорганизмов осуществляют, как описано в соответствующих печатных трудах, например для S.cerevisiae (A.Hinnen и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978), для В. subtilis (Anagnostopoulos и соавт., J. Bacteriol. 81:741, 1961), и для E.coli (М.Mandel и соавт., J. Mol. Biol. 53:159, 1970).

В соответствии с этим, способ трансформации клеток E.coli включает, например, предобработку клеток ионами Са2+ для того, чтобы сделать возможным захват ДНК, и инкубацию с данным гибридным вектором. Затем можно осуществить селекцию трансформированных клеток, например, путем переноса клеток на селективную ростовую среду, что позволяет отделить трансформированные клетки от родительских клеток, в зависимости от природы маркерной последовательности векторной ДНК. Предпочтительно использовать ростовую среду, которая не позволяет расти клеткам, которые не содержат данный вектор. Трансформация дрожжей включает, например, стадии ферментативного удаления оболочки дрожжевой клетки с помощью глюкозидаз, обработку полученных сферопластов данным вектором в присутствии полиэтиленгликоля и ионов Ca2+, и регенерацию удаленной клеточной оболочки путем заключения обработанных сферопластов в агар. Предпочтительно, агар для регенерации получают способом, который делает возможными регенерацию и селекцию трансформированных клеток, как описано выше, в одно и то же время.

Трансформацию клеток высших эукариот, таких как клеточные линии млекопитающих, предпочтительно успешно выполняют путем трансфекции. Трансфекцию осуществляют традиционными методами, такими как кальций-фосфатное осаждение, микроинъекция, слияние протопластов, электропорация, т.е. интродукция ДНК с помощью электрического импульса, который временно повышает проницаемость клеточной мембраны, или в присутствии вспомогательных соединений, таких как диэтиламиноэтилдекстран, диметилсульфоксид, глицерин или полиэтиленгликоль, и им подобные. После операции трансфекции трансфицированные клетки идентифицируют и селектируют, например, путем культивирования в селективной среде, выбранной в зависимости от природы селективного маркера, например в стандартной культуральной среде, такой как модифицированная Дюльбекко среда Игла (DMEM), минимальная незаменимая среда, среда RPMI 1640 и им подобные, содержащие, например, соответствующий антибиотик.

Рекомбинантные антитела, в соответствии с настоящим изобретением, можно использовать для качественного и количественного определения присутствия вируса бешенства. Вообще, рекомбинантные антитела, в соответствии с настоящим изобретением, можно использовать в любом известном иммуноферментом анализе, который зависит от связывающего взаимодействия между антителами и антигенами бешенства. Примеры таких анализов представляют собой радио-, ферментный, флуоресцентный, хемилюминисцентный, иммунопреципитационный, латексноагглютинационный, и гемагглютинационный иммунный анализ, а также, в частности, способы иммунного окрашивания.

В соответствии с настоящим изобретением антитела могут использоваться как таковые или в виде конъюгированных с ферментом производных в иммуноферментном анализе. Можно использовать любую известную модификацию иммуноферментного анализа, например, жидкофазный (гомогенный) иммуноферментный анализ, твердофазный (гетерогенный) иммуноферментный анализ, одностадийный иммуноферментный анализ или двухстадийный (сэндвич) иммуноферментный анализ с прямым или непрямым (конкурентным) определением присутствия вируса бешенства.

Примером такого иммуноферментного анализа является сэндвич-иммуноферментный анализ, в котором подходящий носитель, например пластиковую поверхность микротитровальной плашки или пробирки, например полистироловую, полипропиленовую или поливинилхлоридную, стеклянные или пластиковые шарики, фильтровальную бумагу, декстрановые и ему подобные ацетатцеллюлозные или нитроцеллюлозные листы, намагниченные частицы или им подобные, покрывают моноклональным антителом настоящего изобретения простой адсорбцией или необязательно после активации данного носителя, например с помощью глутаральдегида или бромциана. Затем добавляют испытуемые растворы, содержащие вирус бешенства, и, наконец, рекомбинантные антитела настоящего изобретения, включающие детектируемый фермент, например щелочную фосфатазу. Количество вируса бешенства в испытуемом растворе прямо пропорционально количеству связанного рекомбинантного антитела и определяется путем добавления фермент-субстратного раствора. Фермент-субстратная реакция дает, например, изменение в окраске, которое можно наблюдать невооруженным глазом или с помощью оптических измеряющих устройств.

В соответствии с настоящим изобретением антитела можно использовать как таковые или в виде радиоактивно меченых производных в радиоиммунном анализе (РИА). Как указано выше для лммуноферментных анализов, можно использовать любую модификацию радиоиммунного анализа.

Тестирование осуществляют способом, аналогичным вышеописанным иммуноанализам с использованием радиоактивной метки, например 125I, вместо ферментной метки. Количество иммунного комплекса, образованного с соответствующим количеством вируса бешенства, присутствующего в тестируемых растворах, определяют путем измерения радиоактивности иммунного комплекса.

Для иммунноокрашивания срезы замороженного или хранимого при криогенной температуре биопсийного материала или заключенные в парафин тканевые срезы обрабатывают раствором, содержащим рекомбинантное антитело настоящего изобретения, включающего поддающийся обнаружению фермент. Связанное рекомбинантное антитело детектируется путем обработки подходящим ферментным субстратом, предпочтительно ферментным субстратом, который дает осадок твердых частиц (краситель) на участке присутствующего рекомбинантного антитела настоящего изобретения. Вместо рекомбинантных антител, включающих фермент, можно использовать рекомбинантное антитело, включающее стрептавидин и раствор биотин-фермент-конъюгата, что ведет к повышенной ферментной концентрации на участке данного антитела и, следовательно, повышает чувствительность способа иммунного окрашивания. Осадок твердых частиц ферментного субстрата детектируется просмотром под микроскопом, например с помощью флуоресцентного микроскопа, или путем сканирования оптической плотности при определенной длине волны данного красителя.

Использование, в соответствии с настоящим изобретением, рекомбинантных антител, как описано выше, для определения вируса бешенства включает также другие иммунные анализы, известные per se, например иммунофлуоресцентные анализы, латексную агглютинацию с частицами латекса, покрытыми антителом или антигеном, гемагглютинацию красных кровяных телец, покрытых антителом или антигеном, анализ затухающих волн света с использованием покрытого антителом оптоволокна или другими иммуносенсорами прямого действия, которые преобразуют событие связывания в электрический или оптический сигнал, или им подобные.

В настоящем изобретении рассматриваются также тест-наборы для качественного и количественного определения присутствия вируса бешенства, включающие рекомбинантные антитела настоящего изобретения и необязательно вспомогательные вещества, положительные и/или отрицательные контроли, буферы, инструкции и описания примерных результатов.

Кроме того, рекомбинантные антитела настоящего изобретения используют для предупреждения заболевания бешенством у пациентов, подозреваемых в возможном контакте с вирусом бешенства, или для лечения пациентов, которые заражены бешенством.

Поэтому настоящее изобретение относится также к фармацевтическим композициям, включающим терапевтически эффективное количество рекомбинантного антитела, в соответствии с настоящим изобретением, и фармацевтически приемлемый носитель. Предпочтительными являются фармацевтические композиции для парентерального использования. Композиции для внутримышечного, подкожного или внутривенного использования представляют собой, например, изотонические водные растворы или суспензии, факультативно получаемые незадолго перед использованием из лиофилизированных или концентрированных препаратов. Суспензии в масле содержат в качестве масляного компонента растительные, синтетические или полусинтетические масла, обычные для инъекционных целей. Данные фармацевтические композиции могут бать стерилизованными и содержать вспомогательные вещества, например для консервирования, стабилизации, увлажнения, "эмульгирования или солюбилизации данных ингредиентов, соли для регуляции осмотического давления, буфер и/или соединения, регулирующие вязкость, например натрийкарбоксицеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, натрийкарбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливинилпирролидин или желатину.

Фармацевтические композиции настоящего изобретения содержат от, приблизительно, 0,01% до, приблизительно, 50% активных ингредиентов. Они могут находиться в виде дозированной единицы, такой как готовые для употребления ампулы и флаконы, или же в виде лиофилизированных твердых частиц.

Вообще, профилактически и терапевтически эффективные дозы для млекопитающих составляют, приблизительно 0,5-250 мкг рекомбинантного антитела настоящего изобретения на кг массы тела в зависимости от типа антитела, статуса пациента и схемы применения. Конкретную схему введения и подходящую дозу следует выбирать лечащему врачу, принимая во внимание индивидуальные особенности данного пациента, статус данного заболевания, тип обрабатываемой опухоли, и тому подобное. Фармацевтические композиции настоящего изобретения получают способами, известными в данной области техники, например традиционным смешиванием, растворением, способами приготовления лекарств или лиофилизирования. Фармацевтические композиции для инъекций обрабатывают, наполняют ампулы и флаконы и герметизируют в асептических условиях в соответствии со способами, известными в данной области техники.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения композиции и/или способы имеют отношение к антительным смесям, в которых объединены одно или несколько антител. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения

Данные смеси содержат два и больше антител настоящего изобретения.

ПРИМЕР

Пример 1

Клетки

Используемые для гибридизации В-клетки человека получают из периферической крови 5 доноров в период между 7-21 днями после третьей дозы первичной антирабической вакцинации и 5 доноров, иммунных к бешенству, в 10-21-дневный период после повторного введения вакцины. Во всех случаях используют вакцину Rabivac , вакцина диплоидных клеток человека (вирусный штамм Pitman Moore 1503-3М, Behringwerke, Marburg, ФРГ). Все доноры оказались отрицательными в тестах на ВИЧ и гепатит В. Гибридные гетеромиеломные клетки SHM-D33 мышь-человек, используемые в качестве партнеров для слияния в гибридоме (Teng, N.N. и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 7308, 1983), и лейкоциты мартышки, трансформированные вирусом В95-8 Эпштейна-Барр (EBV), используемые в качестве источника EBV (Henderson и соавт., J. Exp. Med. Vol.76, р.152, 1977), были получены из АТСС (Rockville, MD).

Вирусы бешенства

Чтобы оценить способность препаратов антител нейтрализовать разные штаммы вируса бешенства, используют антигенно четко выраженные фиксированные лабораторные штаммы, а также два представительных вируса уличного бешенства. Фиксированные штаммы Evelyn-Rjkitnicki-Abelseth (ERA), стандартный штамм заражения вирусом, адаптированные либо к мышиному мозгу (CVS-24), либо к клеточной культуре (CVS-11) и Pitman-Moore (PM), получены из вирусной коллекции Университета Thomas Jefferson. Вирус бешенства серебристых летучих мышей (SHBRV), которые ассоциируются с большинством недавних случаев бешенства в Соединенных Штатах Америки, а также вирус уличного бешенства койотов/вирус бешенства собак Мексики (COSRV), который является представителем вирусов бешенства собак, получены как описано (Morimoto и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.93, p.5653, 1996). Выделенный очисткой вирус и препарат гликопротеина (G), а также нуклеопротеина (N), описаны в другом месте (Dietzschold и соавт., World Health Organization, Geneva, p.175, 1996).

EBV - трансформация человеческих PBL

Моноядерные клетки периферической крови (РМВС) выделяют из цельной крови центрифугированием в градиенте плотности Ficoll-Paque (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), что подробно изложено в другом месте (Plebanski и соавт., Immunology Vol.75, р.86, 1992). Затем Т-клетки истощают негативной селекцией с использованием намагничиваемых шариков, покрытых моноклональным антителом против CD2 (Dynal Inc., Lake Success NY), и концентратора намагниченных частиц (Dynal). CD-2-негативные клетки, первичные В-клетки, собирают и иммортализуют, как описано раньше (Swaminathan, 1992). Вкратце, клетки В95-8, культивируемые до слияния в RPMI1640 (Gibco BRL Life Technologies, Grand Island NY) с добавлением 10% сыворотки плода коровы (FBS; Gibco), лизируют замораживанием-оттаиванием в сухом льду для высвобождения внутриклеточного EBV. Супернатант, содержащий EBV, осветляют центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин и фильтруют через 0,45 мкм фильтр. Вирус концентрируют центрифугированием при 8000 об/мин в течение 2 ч при 4°С. 7×10 6 В-клеток (суспендированных в 1 мл культуральной среды для В95-8) инкубируют при 37°С в течение 2 ч с вирусом, полученным из 25 мл клеток В95-8. После заражения клетки дважды промывают культуральной средой, засевают в 96-луночные круглодонные плашки для микротитрования (Nunc, Fisher Scientific, Pittsburg, PA) в концентрации 1×104 клеток/лунку, и культивируют при 37°С во влажной атмосфере с 5% СО 2 и 95% воздуха.

Обнаружение гетерогибридов мышь-человек

После EBV-трансформации клеточных линий их культивируют в течение, приблизительно, 4 недель, собирают супернатант и тестируют в ELISA на присутствие антител, специфичных к вирусу бешенства. Позитивные лунки вначале переносят в 1 мл, а затем в 2 мл культуры (48- и 24-луночные планшеты, Nunc), и полученный зупернатант анализируют затем в быстром тесте на ингибирование флуоресцентного свечения (RFFIT) (Hooper, ASM Press, WA p.775, 1997). Клеточные линии, продуцирующие нейтрализующее антитело, гибридизуют с клетками SHM-D33 (АТСС, каталожный номер CRL1668) следующим образом. Равные количества SHM-D33 и EBV-трансформированных клеток (приблизительно 5×106 каждых) помещают вместе в стерильную круглодонную полистироловую пробирку Falcon, Fisher Scientific) и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин. Клетки дважды промывают бессывороточной средой и полученный осадок клеток ресуспендируют в 100 мкл среды.

Пробирки нагревают в 37°С водяной бане в течение 1 мин и затем добавляют по каплям в течение 45 сек 0,5 мл нагретого 37°С) 50% (мас./об.) полиэтиленгликоля (Sigma, Chemical Co., St. Louis, МО, каталожный номер Р-7181), осторожно встряхивая нагретую пробирку. Затем реакцию слияния останавливают, медленно приливая 3 мл бессывороточной среды в течение 30 сек с последующим добавлением 9 мл этой среды в течение 30 сек. Пробирки оставляют при комнатной температуре в течение 8 мин и затем инкубируют в течение 2 мин в 37°С водяной бане. После чего данные клетки центрифугируют при 500 g в течение 3 мин и полученный осадок клеток ресуспендируют в 30 мл модифицированной Iscove среде Дюльбекко (IMDM; Gibco), содержащей 10% FBS, а также 0,4 мкМ аминоптерина (Gibco) и 10 мкМ уабаина (Sigma) для отбора клеток, которые не гибридизуют. Клеточные суспензии высевают в 96-луночные круглодонные планшеты для микротитрования в концентрации 1×104 клеток на лунку и инкубируют как описано для клеточных линий.

Когда колонии гетерогибридных клеток оформятся (приблизительно 6-недельная культура), супернатантны тестируют в ELISA и RFFIT на образование специфичных к вирусу бешенства антител. Антителопродуцирующие клетки клонируют, минимум, три раза с помощью лимитирующих разведении в планшетах для микротитрования. Клетки титруют а 96-луночных круглодонных планшетах 2-кратными разведениями, начиная с 4-х клеток на лунку. Клетки из лунок, в среднем содержащих 0,25 клеток или меньше, размножают для сбора из супернатанта и анализируют дальше.

Анализ специфичных к вирусу бешенства антител в ELISA

Специфичность антитела и изотипа оценивают в твердофазном ELISA. Планшеты (PolySorb , Nunc) покрывают при комнатной температуре в увлажненной камере в течение ночи 5*г/мл ERA-вируса бешенства, гликопротеина, или нуклеотпротеина, разбавленного в фосфатно-солевом буфере (PBS). Затем эти планшеты блокируют с помощью 5% порошкового молока в PBS и промывают их в PBS, содержащем 0,05% Твин 20 (PBS-Tween) перед добавлением супернатантных образцов.

После инкубации при комнатной температуре в течение 2 ч полученные планшеты промывают с помощью PBS-Tween для удаления несвязавшегося первичного антитела и в течение 1 ч при комнатной температуре добавляют различные фермент-конъюгированные или биотинилированные вторичные антитела, специфичные к разным изотипам тяжелой цепи человека. Вторичные антитела детектируют либо путем образования растворимого конечного продукта в данной среде после добавления соответствующего субстрата (3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМВ) в фосфатно-цитратном буфере, или пара-нитрофенилфосфат (PNPP) в 0,1 М глициновом буфере (Sigma) или после добавления авидин-щелочной фосфатазы (30 мин при КТ) и PNPP-субстрата. Реакцию пероксидаза-ТМВ останавливают добавлением 2 М H 2SO4. Значения поглощения считывают в спектрофотометре для микропланшет (Biotek, Winooski VT) при 450 им для ТМВ-продукта и при 405 нм для PNPP-реакции.

RFFIT

Супернатантные образцы каждой трансформированной клеточной линии анализируют в присутствии антител, нейтрализующих вирус бешенства, с использованием изменения быстрого теста на ингибирование флуоресцентного свечения (RFFIT), как описано Ранее (Hooper, ASM Press, WA p.1997). Супернатантные образцы (50 мкл) разбавляют в 96-луночных круглодонных планшетах (Nunc). Разведение вируса бешенства, которое вызывает 80-90% инфицирование индикаторных клеток, добавляют к каждому испытуемому образцу, и данные планшеты инкубируют при 37°С в течение 1 ч. Отрицательную среду и положительную на бешенство иммунную сыворотку контрольных образцов включают в каждый анализ. После инкубации в каждую лунку добавляют клетки детеныша китайского хомячка (ВНК) в концентрации 30 ul 1,8×l06 клеток/мл и культуры инкубируют в течение ночи при 37°С. Затем планшеты однократно промывают ледяным PBS и фиксируют ледяным 90% ацетоном в течение 20 мин при -20°С. После фиксации ацетон удаляют и планшеты сушат на воздухе. Для детекции инфицированных ВНК клеток в каждую лунку добавляют на 45 мин при 37°С 40 ul FITC моноклонального глобулина (Centrocor, Malvern PA) против нуклеопротеина бешенства. Затем эти планшеты промывают три раза дистиллированной водой и просматривают под флуоресцентным микроскопом.

Выделение очисткой антител с помощью хроматографии по сродству

IgG1-антитело выделяют очисткой с использованием колонки с протеином A (rProtein A SepharoseТМ Fast Flow, Amersham Pharmacia Biotech). Вкратце, супернатанты осветляют фильтрацией через 0,45 мкм мембрану и доводят рН до 8,0 с помощью 1н NaOH. Супернатанты пропускают через данную колонку с линейной скоростью потока, приблизительно, 100 см/час. После промывки в PBS (рН 8) антитела элюируют из колонки с использованием раствора 0,1 М лимонной кислоты и затем диализуют против PBS.

IgG3-антитело выделяют очисткой с использованием колонки с протеином G (Protein G Sepharose TM Fast Flow, Amersham Pharmacia Biotech). Супернатант, содержащий IgG3, осветляют фильтрацией через 0,45 мкм мембрану и рН доводят до 7,0 с помощью 1н NaOH. Супернатант пропускают через данную колонку с линейной скоростью потока, приблизительно, 11 см/час. После промывки с помощью PBS антитело элюируют из колонки с использованием 0,1 М глицинового буфера, рН 3,0 и затем диализуют против PBS.

IgM-антитело выделяют очисткой с использованием маннан-связывающего белка и модификации ранее описанного метода (Nevens и соавт., J. Chromatogr, vol.597, p.247, 1992). Вкратце, содержащий IgM супернатант, обработанный ЭДТА, доводят до рН 8,0 с помощью 1М NaOH, фильтруют и охлаждают до 4°С. Маннан-связывающую протеин-агарозу (Sigma) промывают в колонке при 4°С буфером, состоящим из 0,1 М Na**СО 3/0,5 М NaCl, pH 8,3, затем добавляют супернатант и инкубируют в колонке в течение 15 мин при 4°С. Затем данную колонку промывают несколькими объемами связывающего буфера и доводят до КТ в течение 1 ч. IgM элюируют из колонки связывающим буфером при КТ и диализуют против PBS.

Белковые концентрации диализованных препаратов антитела определяют с использованием анализа детекции белка (Bio-Rad Labcratories, Hercules СА) следующим образом. 100 мкл образца добавляют к 5 мл разведенного 1/5 концентрата красящего реагента при КТ в течение 10 минут. В каждый анализ включают отрицательный PBS-контроль и разные белковые стандарты сывороточного альбумина крупного рогатого скота. После инкубации образцы прочитывают в спектрофотометре при 595 нм. Белковые концентрации тестируемых образцов рассчитывают по отношению к поглощению BSA-стандартов. Степень очистки всех препаратов антитела оценивают электрофорезом в 12,5% полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях (SDS-PAGE). Выделенные очисткой антитела демонстрируют в SDS-PAGE две основные полосы, корреспондирующие с выделенными тяжелой и легкой иммуноглобулиновыми цепями.

Получение, выделение и секвенирование клонов кДНК

Тотальную РНК выделяют из JA-гибридомных клеток путем использования RNAzol В (Biotecx Laboratories, Houston). Реакции обратного транскрибирования осуществляют при 42°С в течение 1 ч с обратной транскриптазой вируса миелобластоза (Promega) и oligo(dT)-праймера. Часть обратнотранскриптазных продуктов подвергают амплификации в полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя праймеры, специфичные для тяжелой цепи: IgG-HF1-праймер (5'-ACCATGGAGTTTGGGCTGAG-3' (SEQ ID NO:5), стартовый кодон; подчеркнут, каталожный №Y14737), и IgG-HR2-праймер (5'-ACTCATTTACCCGGGGACAG-3' (SEQ ID NO:6), стоп-кодон, подчеркнут, каталожный №Y14737) или праймеры, специфичные для легкой цепи: IgG-LF5-праймер (5'-AGCATG GAAGCCCCAGCTCA-3' (SEQ ID NO:7), стартовый кодон; подчеркнут, каталожный №М63438), и IgG-LR2-праймер (5'-CTCTA ACACTCTCCCCTGTTG-3' (SEQ ID NO:8', стоп-кодон, подчеркнут каталожный №М63438). Амплификацию осуществляют в течение 35 циклов денатурации при 94°С в течение 60 секунд, отжига при 50°С в течение 60 секунд, и полимеризации при 72°С в течение 90 секунд с Taq-полимеразой ДНК (Promega). Данные ПЦР-продукты (1,4 т.п.н. для тяжелой цепи, 0,7 т.п.н. для легкой цепи) выделяют очисткой и секвенируют с использованием AmpliTaq-набор для циклического секвенирования (Perkin-Elmer) со специфичными праймерами. Полученные ПЦР-продукты клонируют в ТА-клонирующий вектор, pCR2.1 (Invitrogen). Клонируемую кДНК тяжелой цепи и легкой цепи секвенируют с использованием AmpliTaq-набора для циклического секвенирования (Perkin-Elmer) со специфичными праймерами.

Кодирующие последовательности моноклонального антитела, нейтрализующего вирус бешенства

кДНК моноклонального антитела, и комплементарные ей последовательности, представляют собой нуклеиновые кислоты моноклонального антитела, созданные в настоящем изобретении. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения последовательность ДНК моноклонального антитела создают для тяжелой цепи (SEQ ID NO:1) и для легкой цепи (SEQ ID NO:2) моноклонального антитела из клона JA, и поэтому не имеющего каких-либо интронов.

Настоящее изобретение относится также к одноцепочечным элигонуклеотидам для использования в качестве праймеров для ПЦР, которая амплифицирует фрагмент, содержащий последовательность моноклонального антитела, например вариабельную или гипервариабельную область данного моноклонального антитела. Олигонуклеотид, обладающий последовательностью гибридизующего участка, по меньшей мере, из 8 нуклеотидов, гена моноклонального антитела, и другой олигонуклеотид, обладающий обратно комплементарной последовательностью справа на той же цепи гена моноклонального антитела так, что каждый олигонуклеотидный праймер синтезирует в направлении к другому. Данные олигонуклеотиды содержат предпочтительно в пределах 10-35 нуклеотидов в длину.

Настоящее изобретение относится к полноразмерным последовательностям кДНК для тяжелой и легкой цепей моноклонального антитела из гетерогибридомного клона JA (соответственно, SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2), и кодируемым полипептидам из 1-474 аминокислот для тяжелой цепи (SEQ ID NO:3) и 1-234 аминокислот для легкой цепи (SEQ ID NO:4).

В конкретном варианте описанного здесь осуществления настоящего изобретения, настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты моноклонального антитела из гетерогибридомного клона JA. В предпочтительном, но не ограниченном, аспекте настоящего изобретения данный гетерогибридомный клон JA является источником кДНК моноклонального антитела.

Функциональные эквиваленты моноклокальных антител, нейтрализующих вирус бешенства

Настоящее изобретение включает также функциональные эквиваленты антител, представленные в данном описании. Функциональные эквиваленты обладают характеристиками связывания, сравнимые с характеристиками связывания рассматриваемых антител, и включают, например, химерные и одноцепочечные антитела, а также их фрагменты. Способы получения таких функциональных эквивалентов раскрыты в РСТ-заявке WO 93/21319, в Европейской Патентной Заявке №239400; РСТ-заявке WO 89/09622; Европейской Патентной Заявке 338745; и Европейской Патентной Заявке ЕР 332424.

Функциональные эквиваленты включают полипептиды с аминокислотными последовательностями в основном такими же, что и аминокислотная последовательность вариабельной или гипервариабельной областей антител настоящего изобретения. "В основном такая же" аминокислотная последовательность указана здесь в виде последовательности, по меньшей мере, с 70%, предпочтительно, по меньшей мере, около 80%, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, около 90% гомологией с другой аминокислотной последовательностью, как установлено с помощью поискового способа FAST, согласно Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444-2448, 1988. Химерные антитела обладают константными областями, полученными в значительной степени или исключительно из константных областей антитела человека и вариабельных областей, полученными в основном или исключительно из последовательности вариабельной области моноклонального антитела каждой стабильной гетерогибридомы (Champion, J.M., и соавт., Journal of Immunological Methods, 235 31-50, 2000).

Одноцепочечные антитела или Fv-фрагменты представляют собой полипептиды, которые состоят из вариабельной области тяжелой цепи антитела, сцепленной с вариабельной областью легкой цепи с помощью соединительного линкера или без него. Таким образом, Fv включает полный сайт связывания данного антитела.

Кроме того, функциональные эквиваленты включают фрагменты антител, которые обладают такими же, или существенно такими же характеристиками связывания, что и целые антитела. Такие фрагменты могут содержать один или несколько Fab-фрагментов из F(ab').sub.2-фрагмента. Предпочтительно, если все данные антительные фрагменты содержат области, определяющие комплементарность целого антитела, хотя фрагменты, содержащие отдельные такие области, например, три, четыре или пять областей, определяющих комплементарность, также являются функциональными. Функциональные эквиваленты являются членами иммуноглобулинового класса IgG и его подклассов, но могут представлять собой или могут объединять любой из следующих иммуноглобулиновых классов: IgM, IgA, IgD, или IgE, и их подклассы. Тяжелые цепи разных подклассов, таких, например, как IgG-подклассов, ответственны за разные эффекторные функции и, поэтому, выбирая требуемую константную область тяжелой цепи, получают химерные антитела с требуемой эффекторной функцией. Предпочтительными константными областями являются гамма 1 (IgGI), гамма 3 (IgG3) и гамма 4 (IgG4). Константная область легкой цепи может представлять собой каппа- или лямбда-тип.

Иммуноглобулины настоящего изобретения могут быть моновалентными, двухвалентными или поливалентными. Моновалентные иммуноглобулины представляют собой димеры (HL), получаемые из химерной тяжелой цепи, связанные с помощью дисульфидных мостиков с химерной легкой цепью. Двухвалентные иммуноглобулины представляют собой тетрамеры (H 2L2), получаемые из двух димеров, связанных, по меньшей мере, одним дисульфидным мостиком.

Стандартные методы получения рекомбинантных ДНК

Стандартные методы получения рекомбинантных ДНК описаны у Sambrook и соавт., "Molecular Cloning" (Молекулярное Клонирование), Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press (1987) и у Ausubel и соавт. (Eds) "Current Protocols in Molecular Biology" (Современные Протоколы в Молекулярной Биологии), Green Publishing Associates/Wiley-Interscience, New York (1990).

Вкратце, выбирают подходящий источник клеток, содержащих нуклеиновокислотные молекулы, которые экспрессируют требуемую ДНК, такую как у антитела или эквивалентную ДНК антитела. Тотальную ДНК получают с помощью стандартного порядка действий из подходящего источника. Тотальную РНК используют для прямого синтеза кДНК. Стандартные способы выделения РНК и синтеза кДНК представлены в стандартных руководствах по молекулярной биологии, например, таких, которые описаны выше.

Полученную кДНК можно амплифицировать известными способами. Например, полученную кДНК можно использовать в качестве матрицы для амплификации в полимеразной цепной реакции (ПЦР); смотрите Saiki и соавт., Science, 239, 487, 1998 или Mullis и соавт., Патент США №*83195. Последовательности нуклеотидных праймеров для ПЦР-амплификации получают из известной последовательности, которую амплифицируют. Олигонуклеотиды синтезируют способами, известными в данной области техники. Подходящие способы включают способы, описанные у Caruthers в Science 230, 281-285, 1985.

В ПЦР-амплификации используют левый и правый олигонуклеотиды. Условия оптимизируют для каждой отдельной пары праймеров в соответствии со стандартным порядком действий. Полученный ПЦР-продукт анализируют, например, с помощью электрофореза для кДНК, обладающей корректным размером, корреспондирующей с последовательностью между данными праймерами.

Альтернативно, кодирующую область можно амплифицировать для двух или нескольких перекрывающихся фрагментов. Перекрывающиеся фрагменты создают, чтобы включить сайт рестрикции, позволяющий смонтировать интактную кДНК из данных фрагментов.

Для того чтобы выделить кодирующие белок полноразмерные области тяжелой и легкой цепей в каждом моноклональном антителе из каждой гетерогибридомной клеточной линии, например, левый ПЦР-олигонуклеотидный праймер должен быть комплементарен данной последовательности по 5'-концу, охватывая старт-кодон ATG и, по меньшей мере, 5-10 нуклеотидов левее от данного старт-кодона. Правый ПЦР-олигонуклеотидный праймер должен быть комплементарен последовательности по 3'-концу требуемой последовательности ДНК. Требуемая кДНК кодирует весь участок тяжелой и легкой цепей каждого моноклонального антитела, включая стоп-кодон.

Амплифицируемую кДНК, кодирующую данные антитела или антительные эквиваленты, можно также реплицировать в самые разные клонирующие векторы в самых разных хозяйских клетках. Такая клетка-хозяин может быть прокариотической или эукариотической.

Вектор, в который сплайсируется кДНК моноклонального антитела, может включать участки хромосомной, нехромосомной и синтетической последовательностей ДНК. Некоторые подходящие прокариотические клонирующие векторы включают, но не ограничиваются, плазмиды из E.coli, такие как colE1, pCR1, pBR322, рМВ9, pUC, pKSM, и RP4. Прокариотические векторы также включают, но не ограничиваются, производные фаговой ДНК, такие как М13 и другие одноцепочечные ДНК нитевидных фагов.

Вектор, содержащий кДНК моноклонального антитела, которая экспрессируется, трансфицируют в подходящую клетку-хозяин, как описано ниже. Клетку-хозяин поддерживают в соответствующей культуральной среде и подвергают воздействию условий, при которых данная клетка и данный вектор реплицируются.

Химерные антитела

В целом, химерные антитела производят путем получения для каждого компонента химерного иммуноглобулина, легкого и тяжелого, слитого гена, включающего первый участок ДНК, который кодирует, по меньшей мере, функциональную часть, специфически нейтрализующую вирус бешенства человека, предпочтительно гликопротеин, вариабельную область иммуноглобулина человека, сцепленную (например, функционально перестроенную вариабельную область с присоединенной областью) со вторым участком ДНК, кодирующим, по меньшей мере, часть константной области иммуноглобулина человека. Каждый слитый ген монтируют в экспрессионный вектор или встраивают в него. Реципиентные клетки, способные экспрессировать генные продукты, трансфицируют затем с помощью данных генов. Трансфицированные реципиентные клетки культивируют в условиях, которке позволяют экспрессировать встроенные гены, а экспрессированные иммуноглобулины или иммуноглобулиновую цепь извлекать.

Гены, кодирующие вариабельную область иммуноглобулиновых тяжелой и легкой цепей, получают из лимфоидных клеток, которые продуцируют антитела, нейтрализующие вирус бешенства. Например, гетерогибридомные клеточные линии, которые производят моноклональное антитело против гликопротеина вируса бешенства, являются источником иммуноглобулиновой вариабельной области для химерных антител настоящего изобретения. Константные области получают из антителообразующих клеток человека с помощью стандартных методов клонирования. Альтернативно, поскольку гены представлены двумя классами легких цепей, данные классы тяжелых цепей клонируют, происходящие от человека константные области сказываются легко доступными из этих клонов. Фрагменты связывания химерного антитела, такие как F(ab').sub.2 и Fab-фрагменты, получают путем конструирования гена химерной тяжелой цепи в редуцированной форме. Например, химерный ген, кодирующий участок тяжелой цепи F(ab').sub.2, должен включать последовательности ДНК, кодирующие CH1-домен и шарнирную область данной тяжелой цепи. Альтернативно, такие фрагменты можно получить ферментной обработкой химерного иммуноглобулина. Например, обработка папаином или пепсином может образовать, соответственно Fab- или F(ab').sub.2-фрагменты.

Предпочтительно, слитые гены, кодирующие тяжелую и легкую химерные цепи, или их части, монтируют в два разных экслрессирующих вектора, которые можно использовать для котрансфекции реципиентной клетки. Каждый вектор содержит два селективных гена, один для селекции в бактериальной системе, а другой для селекции в эукариотической системе, и каждый вектор обладает отличающейся парой генов. Данные векторы делают возможным наработку и амплификацию слитых генов в бактериальной системе, и последующую котрансфекцию эукариотических клеток и селекцию полученных котрансфицированных клеток. Примеры селективных генов для данной бактериальной системы включают, но не ограничиваются, гены, которые придают устойчивость к ампициллину и гены, которые придают устойчивость к хлорамфениколу. Два селективных гена для селекции эукариотических трансфектантов являются предпочтительными, но не ограничиваются: (i) ксанти-гуанинфосфорибозилтрансферазным геном (gpt), и (ii) фосфотрансферазным геном из Тn5 (обозначаемый neo). Селекция с помощью gpt основана на способности фермента, кодируемого данным геном, использовать ксантин в качестве субстрата для пуриннуклеотидного синтеза; аналог эндогенного фермента отсутствует. В среде, содержащей ксантин и микофеноловую кислоту, которая блокирует превращение инозинмонофосфата в ксантимонофосфат, могут выжить лишь клетки, экспрессирующие данный ген gpt. Продукт neo блокирует ингибирование белкового синтеза в эукариотических клетках антибиотиком G418 и другими антибиотиками его класса. Две селекционные процедуры можно использовать одновременно или последовательно, которые отбирают для экспрессии гены иммуноглобулиновых цепей, встроенных в два разных вектора ДНК в эукариогической клетке.

Экспрессирующие системы

Вследствие присущей генетическому коду вырожденности другие последовательности ДНК, которые кодируют существенно такие же или функционально эквивалентные аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей, находятся в рамках настоящего изобретения. Измененные последовательности ДНК, которые можно использовать в соответствии с настоящим изобретением, включают делеции, добавки или замены в разных нуклеотидных остатках, давая последовательности, которые кодируют один и тот же, или функционально эквивалентный, генный продукт. Данный генный продукт может содержать делеции, добавки или замены аминокислотных остатков в последовательности тяжелой или легкой цепи, что дает "немое" изменение, продуцируя, таким образом, функционально эквивалентное моноклональное антитело.

В соответствии с настоящим изобретением нуклеотидные последовательности, кодирующие тяжелую и легкую цепи моноклонального антитела, нейтрализующего вирус бешенства, его фрагмент или его аналог, встраивают в соответствующий экспрессирующий вектор. Данный вектор, который содержит необходимые элементы для транскрипции и трансляции последовательности, кодирующей белок, встраивают так, чтобы образовать молекулы рекомбинантной ДНК, которые управляют экспрессией тяжелой и легкой цепи иммуноглобулинов для образования моноклонального антитела, нейтрализующего вирус бешенства.

Предпочтительная реципиентная клеточная линия представляет собой миеломную клеточную линию. Миеломные клетки могут синтезировать, собирать и секретировать иммуноглобулины, кодируемые трансфицируемыми иммуноглобулиновыми генами. Кроме того, они обладают механизмом гликозилирования данного иммуноглобулина. Особенно предпочтительной реципиентной клеткой является клетка миеломной линии, которая не производит иммуноглобулин, такой как Sр2/0. Такие клеточные линии производят только иммуноглобулин, кодируемый трансфицированными иммуноглобулиновыми генами. Миеломные клетки можно вырастить в культуре или в брюшной полости мышей, где секретируемый иммуноглобулин можно получить из асцитной жидкости. Другие лимфоидные клетки, такие как В-лимфоциты или гибридомные клетки, могут служить в качестве подходящих реципиентных клеток.

Существует несколько способов для трансфекции лимфоидных клеток с помощью векторов, содержащих гены, кодирующие иммуноглобулин. Предпочтительный путь введения ДНК в лимфоидные клетки представляют собой электропорацию. В данной методике реципиентные клетки подвергают электрическому импульсу в присутствии данной вводимой ДНК. Другой путь введения представляет собой слияние протопластов. В данном способе лизоцим используют для удаления клеточных стенок бактерий, несущих рекомбинантную плазмиду, содержащую данный иммуноглобулиновый ген. Получаемые сферопласты сливают с миеломными клетками при помощи полиэтиленгликоля. После слияния протопластов трансфектанты отбирают и выделяют. Другой метод, который можно использовать для введения ДНК в возможные типы клеток, представляет собой кальций-фосфатное осаждение.

Иммуноглобулиновые гены можно также экспрессировать в нелимфоидных клетках, таких как бактериальные или дрожжевые. Когда они экспрессируются в бактериях, иммуноглобулиновые тяжелые цепи и легкие цепи становятся частью телец включения. Поэтому данные цепи необходимо изолировать и выделить очисткой, а затем собрать в функциональные иммуноглобулиновые молекулы. Имеются и другие способы экспрессии в E.coli (смотрите, например, Pluckthun, A., BioTechnology 9:545-551, 1991; Skerra, А. и соавт., BioTechnology 9:273-278, 1991), включая секрецию из E.coli в виде слитых белков, в том числе сигнальной последовательности.

Пример 2

Определены полные последовательности двух моноклональных антител против вируса бешенства, Mab 57 и Mab JB.1. Данные моноклональные антитела специфически связываются с гликопротеином разных штаммов вируса бешенства. Послеэкспозиционное лечение, а также профилактическое лечение с помощью смеси моноклональных антител, нейтрализует вирус бешенства на участке входа инфекции и препятствует распространению данного вируса в центральной нервной системе (ЦНС). Таким образом, для трансдермального или мукозального воздействия на вирус бешенства, смесь моноклональных антител, специфичных к бешенству, вкапывают в место укуса, а также вводят системно. Так как репликация вируса ограничена почти исключительно нервными клетками, нейтрализация и клиренс вируса моноклональными антителами настоящего изобретения перед входом в ЦНС является эффективной послеэкспозиционной профилактикой.

Смесь моноклональных антител против вируса бешенства вводят пациенту, который был подвержен, или подвергался высокому риску воздействия вирусом бешенства. Смесь моноклональных антител настоящего изобретения эффективно подавляет образование любых вирусных вариантов бешенства, которые могут избежать нейтрализации, поскольку каждое моноклональное антитело в данной смеси моноклональных антител обладает специфичностью к эпитопу, который сохраняется в разных уличных вирусах бешенства.

Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи Mab JB.1 человека против бешенства представляет собой SEQ ID NO:9. Аминокислотная последовательность тяжелой цепи Mab JB.1 человека против бешенства представляет собой SEQ ID NO:10. Нуклеотидная последовательность легкой цепи Mab JB.1 человека против бешенства представляет собой SEQ ID NO:11. Аминокислотная последовательность легкой цепи Mab JB.1 человека против бешенства представляет собой SEQ ID NO:12. Нуклеотидная последовательность легкой цепи Mab 57 человека против бешенства представляет собой SEQ ID NO:13. Аминокислотная последовательность легкой цепи Mab 57 человека против бешенства представляет собой SEQ ID NO:14. Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи Mab 57 человека против бешенства представляет собой SEQ ID NO:15. Аминокислотная последовательность тяжелой цепи Mab 57 человека против бешенства представляет собой SEQ ID NO:16.

Дополнительные примеры

Дополнительный пример 1

Нейтрализующий вирус эффект моноклонального антитела, имеющего аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO:10 и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO:12, тестировали на изолятах вируса бешенства, приведенных ниже в Таблице 1, используя быстрый флуоресцентный тест ингибирования очага (RFFIT). Нейтрализующую активность данного антитела сравнивали с активностью коммерчески доступного препарата иммуноглобулина человека против вируса человека (HRIG) (Imogam-rabies®, Pasteur Merieux Connaught).

Нейтрализующую активность препарата антитела определяли, осуществляя четыре повторных двухкратных титрования с использованием клеток мышиной нейробластомы в качестве субстрата для вирусного роста. Антитела разбавляли до 0,02 МЕ/0,1 мл. Приблизительно 50-100 TCID50 каждого вируса из Таблицы 1 инкубировали с антителами в течение 90 минут при 37°С. Добавляли аликвоту, равную 200 мкл суспензии клеток мышиной нейробластомы (50000 клеток/мл), и инкубировали в течение 40 часов при 37°С. После фиксации ацетоном инфицированные вирусом клетки визуализировали окрашиванием меченым флуоресцеинизотиоционатом реагентом против вируса бешенства. Положительная оценка основывалась на полной нейтрализации вируса. Результаты приведены в Таблице 1 (+, нейтрализация; 0, отсутствие нейтрализации).

Моноклональное антитело SEQ ID NO:10/SEQ ID NO:12 нейтрализовали все тестированные варианты вируса бешенства, за исключением одного. Моноклональное антитело нейтрализовало штамм вируса бешенства, полученный из бело-серой летучей мыши, который не нейтрализуется коммерческим препаратом HRIG.

Таблица 1: 
Нейтрализация вируса бешенства HRIG и моноклональным антителом SEQ ID NO:10/SEQ ID NO:12 
Изолят вируса бешенства - HRIG Mab 
(1) Енот (Procyon lotor), восточная часть США + + 
(2) Скунс (Mephitis mephitis), север центральной части США + + 
(3) Скунс (М. mephitis}, юг центральной части США + + 
(4) Скунс (М. mephitis), Калифорния, США + + 
(5) Серая лисица (Urocyon cinereoargenteus), Техас, США + + 
(6) Бело-серая летучая мышь (Lasiurus cinereus) 0 + 
(7) Большая коричневая летучая мышь (Eptesicus fuskus), Нью-Йорк, США + + 
(8) Большая коричневая летучая мышь (Е. fuskus), Вашингтон, США + + 
(9) Серебристая летучая мышь (Lasionycteris noctiagans), США + 0 
(10) Собака, граница США-Мексика + + 
(11) Собака, Таиланд + + 
(12) Собака, Филиппины + + 
(13) Арктическая лисица {Alopex lagopus), Аляска, США + + 


Дополнительный пример 2

Нейтрализующий вирус эффект in vivo моноклонального антитела с аминокислотной последовательностью тяжелой цепи SEQ ID NO:10 и аминокислотной последовательностью легкой цепи SEQ ID NO:12 тестировали на изоляте вируса бешенства от техасского койота следующим образом, используя сирийских хомяков в качестве тестовых животных. Группу из шести тестовых животных и группу из десяти контрольных животных инокулировали в правую икроножную мышцу 50 микролитрами 1:1000 разведения гомогената слюнной железы койота, инфицированного естественным образом вирусом бешенства. Через двадцать четыре часа хомякам вводили в очаг инокуляции 50 мкл препарата моноклонального антитела, что составляет дозу активности, нейтрализующей вирус бешенства, приблизительно равную 40 МЕ/кг, на каждое животное.

Все контрольные животные погибли от бешенства на 16-е сутки после инфицирования, в то время как все животные, обработанные моноклональным антителом выжили без клинических признаков заболевания.

Дополнительный пример 3

Через 24 часа после инокуляции изолятом вируса бешенства от летучей мыши Алабамы, начинали профилактику в четырех группах обработки сирийских хомяков моноклональным антителом SEQ ID NO:10/SEQ ID NO:12 (40 МЕ/кг) или коммерческим HRIG (20 МЕ/кг), вводимым в очаг инокуляции вирусом. Четыре группы обработки состояли из шести животных каждая. Контрольная группа состояла из 10 животных.

Через 24 часа после инокуляции изолятом вируса бешенства от скунса севера центральной части США начинали профилактику в четырех группах обработки сирийских хомяков моноклональным антителом SEQ ID NO:10/SEQ ID NO:12 (40 МЕ/кг) или коммерческим HRIG (20 МЕ/кг), вводимым в очаг инокуляции вирусом. Четыре группы обработки состояли из шести животных каждая. Контрольная группа состояла из 10 животных.

Девяносто пять процентов (19/20) контрольных животных погибли от бешенства. Шестьдесят семь процентов (4/6) и 50% (3/6) животных, обработанных 40 МЕ/кг моноклонального антитела SEQ ID NO:10/SEQ ID NO:12 были защищены после инокуляции вирусом бешенства от летучей мыши Алабамы или вирусом бешенства от скунса севера центральной части США, соответственно. Для сравнения, 17% (1/6) и 50% (3/6) животных, обработанных 20 МЕ/кг HRIG, были защищены после инкубации теми же изолятами вируса.

Моноклональное антитело SEQ ID NO:10/SEQ ID NO:12, является, таким образом, по меньшей мере настолько же эффективными, как и коммерческий препарат HRIG при защите животных от бешенства.




















ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


1. Антитело, нейтрализующее вирус бешенства, содержащее полипептид тяжелой цепи, характеризующийся по меньшей мере 80%-ной гомологией аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:10, и полипептид легкой цепи, характеризующийся по меньшей мере 80%-ной гомологией аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:12.

2. Антитело по п.1, содержащее полипептид тяжелой цепи, характеризующийся по меньшей мере 90%-ной гомологией аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:10, и полипептид легкой цепи, характеризующийся по меньшей мере 90%-ной гомологией аминокислотной последовательности с SEQ ID NO:12.

3. Антитело по п.1 или 2, представляющее собой человеческое антитело.

4. Антитело по п.1 или 2, представляющее собой антитело IgG1.

5. Антитело по п.2, содержащее полипептид тяжелой цепи, характеризующийся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:10, и полипептид легкой цепи, характеризующийся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:12.

6. Фрагмент антитела, охарактеризованного по любому из пп.1-5, нейтрализующий вирус бешенства, где указанный фрагмент выбран из группы, состоящей из Fv-фрагментов, Fab-фрагментов и Р(ab') 2-фрагментов.

7. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10, содержащий тяжелую цепь нейтрализующего вирус бешенства антитела.

8. Нуклеиновая кислота по п.7, содержащая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:9, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10.

9. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12, содержащий легкую цепь нейтрализующего вирус бешенства антитела.

10. Нуклеиновая кислота по п.9, содержащая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:11, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12.

11. Экспрессирующий вектор, содержащий по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту по любому из пп.7-10.

12. Вектор по п.11, введенный в клетку-хозяина.

13. Способ лечения индивида, подвергшегося воздействию вируса бешенства, предусматривающий введение указанному индивиду терапевтически эффективного количества антитела по любому из пп.1-5 или фрагмента по п.6.

14. Способ по п.13, где антитело или фрагмент вводят индивиду в место укуса или системно.