СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНТЕРЛЕЙКИНА-8 ИЗ НЕЙТРОФИЛОВ КРОВИ ДОНОРОВ

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНТЕРЛЕЙКИНА-8 ИЗ НЕЙТРОФИЛОВ КРОВИ ДОНОРОВ


RU (11) 2290948 (13) C1

(51) МПК
A61K 38/20 (2006.01)
A61K 35/14 (2006.01)
C07K 14/55 (2006.01) 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 29.08.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(14) Дата публикации: 2007.01.10 
(21) Регистрационный номер заявки: 2005118285/15 
(22) Дата подачи заявки: 2005.06.14 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2005.06.14 
(45) Опубликовано: 2007.01.10 
(56) Аналоги изобретения: ДОЛГУШИН И.И. и др. Нейтрофилы и гемостаз. - Екатеринбург, 2001, с.75. RU 2157701 С2, 20.10.2000. CN 1243130 А1, 02.02.2000. JP 8169842 А1, 02.07.1996. ЕР 0212489 А1, 04.03.1987. ES 8606788 А1, 16.10.1986. JP 60115528 А1, 22.06.1985. КЕТЛИНСКИЙ С.А. и др. Иммунология для врача. - С.-Пб.: Гиппократ, 1998, с.120-121. 
(72) Имя изобретателя: Третьякова Ирина Евгеньевна (RU) 
(73) Имя патентообладателя: Северо-Осетинская государственная медицинская академия (RU) 
(98) Адрес для переписки: 362019, РСО-Алания, г. Владикавказ, ул. Пушкинская, 40, СОГМА 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНТЕРЛЕЙКИНА-8 ИЗ НЕЙТРОФИЛОВ КРОВИ ДОНОРОВ
Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии. Способ получения ИЛ-8 из нейтрофилов крови доноров включает выделение нейтрофилов из периферической крови доноров на двойном градиенте фиколл-верографина, доведение клеточной суспензии нейтрофилов до концентрации 5×106 клеток/мл, активирование при 37°С в течение 1 часа с последующим центрифугированием и отделением супернатанта, содержащего целевой продукт, при этом для активирования клеточную суспензию нейтрофилов в концентрации 5×106 клеток/мл раствора Хенкса разливают в пластмассовые чашки Петри. Разработан новый простой и доступный способ, обеспечивающий высокий уровень интерлейкина-8 (ИЛ-8) нейтрофилами крови доноров, не требующий использования дорогостоящих препаратов. 1 табл.




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии.

Иммуноцитокины находятся в центре внимания современной иммунологии. Одним из наиболее важных цитокинов воспаления считают интерлейкин-8 (ИЛ-8), относящийся к -суперсемейству хемокинов, регулирующих активацию и подвижность клеток в воспалительном очаге (Симбирцев А.С., 1999; Смирнов B.C., Фрейдлин И.С., 2000). Главными клетками - продуцентами ИЛ-8 служат моноциты/макрофаги и эндотелиоциты, однако он может продуцироваться и многими другими типами клеток: лимфоцитами, нейтрофильными гранулоцитами, различными эпителиальными клетками, фибробластами, гепатоцитами и другими (Кетлинский С.А., Калинина Н.М., 1998; Симбирцев А.С., 1999; Смирнов B.C., Фрейдлин И.С., 2000; Cassatella M., Bazzoni F., Ceska M., 1992). Продукция ИЛ-8 начинается в ответ на активацию клеток различными биологически активными веществами, включающими компоненты клеточных стенок бактерий, вирусы, многие цитокины, лектины и др. (Кетлинский С.А., Калинина Н.М., 1998; Симбирцев А.С., 1999; Смирнов B.C., Фрейдлин И.С., 2000).

Разработка методов получения цитокинов» в том числе ИЛ-8, является актуальной проблемой иммунологии.

Известен способ получения ИЛ-8 из лейкоцитов периферической крови. Он включает пятикратное разведение средой Игла свежей гепаринизированной крови, приготовление рабочего раствора индуктора синтеза и секреции ИЛ-8 (продигиозана). В 96-луночный планшет для культивирования клеток вносят по 100 мкл рабочего раствора продигиозана, добавляют в лунки по 100 мкл подготовленной периферической крови и культивируют в СО2-инкубаторе в течение 24 часов при температуре 37°С, после чего осторожно собираются супернатанты и исследуются на наличие ИЛ-8 (Кетлинский С.А., Калинина Н.М. Иммунология для врача. - Санкт-Петербург: Гиппократ, 1998. - С.120-121).

Недостатком описываемого способа получения ИЛ-8 является использование различных популяций лейкоцитов, секретирующих цитокины с разнонаправленным спектром действия, что способствует ингибированию активности клеток и снижению уровня секреции цитокинов. Этот способ требует использования дорогостоящих препаратов и по продолжительности занимает достаточно много времени.

Наиболее близким по совокупности существенных признаков к заявляемому изобретению является способ получения секреторных продуктов нейтрофилов (Долгушин И.И., Бухарин О.В. Нейтрофилы и гомеостаз, - Екатеринбург, 2001. - С.75), заключающийся в выделении лейкоцитарной взвеси из гепаринизированной периферической крови доноров путем осаждения эритроцитов добавлением 10% раствора желатина в соотношении 10:1 при температуре 37°С в течение 30 минут, выделении нейтрофилов из лейкоцитарной взвеси на двойном градиенте плотности фиколла-верографина, доведении нейтрофилов до концентрации 5×10 клеток/мл средой 199 с последующей их активацией частицами монодисперсного полистирольного латекса диаметром 1,7 мкм из расчета 50 частиц на один нейтрофил. Затем клетки и частицы латекса удаляли путем центрифугирования при скорости 3000 об/мин в течение 15 минут и последующей фильтрации через миллипоровые фильтры с диаметром пор 0,24 мкм («Millipore», USA).

У прототипа и заявляемого изобретения имеются следующие существенные признаки: для выделения цитокинов используют нейтрофилы крови доноров, которые выделяют из лейкоцитарной взвеси, доводят нейтрофилы до определенной концентрации и активируют эти клетки.

Недостатками прототипа являются:

1. Низкий уровень секреции ИЛ-8;

2. Использование дорогостоящих препаратов (частиц монодисперсного полистирольного латекса, миллипоровых фильтров).

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа получения ИЛ-8 из нейтрофилов крови доноров.

Решение этой задачи позволяет разработать новый простой и доступный способ, обеспечивающий высокий уровень секреции ИЛ-8 нейтрофилами крови доноров, не требующий использования дорогостоящих препаратов.

Для достижения этого результата заявляемое изобретение «Способ получения интерлейкина-8 из нейтрофилов крови доноров» включает использование лейкоцитов периферической крови доноров, выделение нейтрофилов из лейкоцитарной взвеси, разведение их до определенной концентрации и проведение активации этих клеток. При этом нейтрофилы активируют адгезией на полистирольном пластике в течение 1 часа при температуре 37°С в растворе Хенкса без последующей фильтрации супернатантов через миллипоровые фильтры.

По отношению к прототипу у заявляемого изобретения имеются следующие отличительные признаки: активацию нейтрофилов осуществляют адгезией их на полистирольном пластике в течение 1 часа при температуре 37°С в растворе Хенкса, что обеспечивает высокий уровень секреции ИЛ-8 и является экономически выгодным, так как исключает использование дорогостоящих препаратов.

Между отличительными признаками и техническим результатом существует причинно-следственная связь: способ обеспечивает высокий уровень секреции преформированного ИЛ-8 и является экономически выгодным.

Для осуществления способа получения ИЛ-8 используются нейтрофилы крови доноров, которые активируют адгезией их на полистирольном пластике в течение 1 часа при температуре 37°С в растворе Хенкса, что обеспечивает высокий уровень секреции этого цитокина за короткий промежуток времени без использования дорогостоящих препаратов, что является экономически выгодным.

По имеющимся у авторов сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, не известна из уровня техники, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».

По мнению авторов сущность заявляемого изобретения не следует для специалиста явным образом из известного уровня техники, так как из него не выявляются вышеуказанные влияния на получаемый технический результат

- новое свойство объекта - совокупности признаков, которые отличают от прототипа заявляемое изобретение, что позволяет сделать вывод о его соответствии критерию «изобретательский уровень»,

Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть многократно использована в медицине с получением технического результата, заключающегося в получении ИЛ-8 из нейтрофилов крови доноров, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применяемость».

Данный способ осуществляется следующим образом.

У доноров производят забор 20,0 мл гепаринизированной периферической венозной крови, которую с целью осаждения эритроцитов и получения лейкоцитарной взвеси отстаивают с добавлением 10% раствора желатина в соотношении 10:1 при температуре 37°С в течение 30 минут. Выделенную лейкоцитарную взвесь однократно отмывают в растворе Хенкса центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 минут. Нейтрофилы выделяют из лейкоцитарной взвеси на двойном градиенте плотности стерильных растворов фиколла-верографина (Pharmacia, Sweden; Spofa, CSSR). Плотность верхнего слоя градиента составляет 1,075-1,077, а нижнего - 1,093-1,095. Объем каждого слоя градиента равняется 1,5 мл. Через 30 минут центрифугирования при 1500 об/мин на границе между плазмой и верхним слоем градиента образуется кольцо, состоящее в основном из мононуклеарных клеток (лимфоциты - 45-50%, моноциты - 15-20%, гранулоциты - 10-15%). В интерфазе между двумя слоями градиентов плотности располагается слой гранулоцитов с чистотой 96-98%, 2-4% составляют мононуклеары. Клетки аккуратно собирают, переносят в стерильные центрифужные пробирки, трижды отмывают стерильным раствором Хенкса и разводят этим же раствором до концентрации 5×106 клеток/мл. Разливают по 1,0 мл клеточной суспензии в стерильные пластмассовые чашки Петри диаметром 40 мм. Культивируют 1 час при температуре 37°С. Сливают надосадок. Неадгезированные клетки удаляют из супернатанта центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 минут. В выделенном супернатанте нейтрофилов доноров определяют содержание провоспалительных цитокинов: ИЛ-1 , ИЛ-1 , ИЛ-8, ФНО- . Для этой цели используют соответствующие тест-системы ТОО «Цитокин» (г.Санкт-Петербург). Эти тест-системы основаны на «сендвич»-методе твердофазного ИФА с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента (Кетлинский С.П., Калинина К.М. Иммунология для врача. - Санкт-Петербург: Гиппократ, 1998. - 156 с.).

Для определения эффективности предлагаемого способа получения ИЛ-8 использовали супернатанты неактивированных и активированных частицами полистирольного монодисперсного латекса диаметром 1,7 мкм (получен из НИИ синтетического каучука, Санкт-Петербург) нейтрофилов крови доноров. Культивирование нейтрофилов без индуктора секреции клеток и в его присутствии проводили в том же режиме, т.е. при температуре 37°С в течение 1 часа в растворе Хенкса.

Результаты исследования показали, что активированные адгезией на пластике нейтрофилы крови доноров достоверно больше по сравнению с неактивированными и активированными латексом нейтрофилами секретируют преформированные провоспалительные цитокины: ИЛ-1 , ИЛ-8, ФНО- . Вероятно, адгезия нейтрофилов на пластике является наиболее раздражающим фактором, что приводит к достоверно более выраженной секреции преформированных цитокинов по сравнению с неактивированными и активированными латексом нейтрофилами крови доноров. Наиболее высокие значения уровня секреции отмечались в отношении ИЛ-8 (табл.1).

Таблица 1

Содержание цитокинов в супернатантах неактивированных и активированных нейтрофилов крови доноров (М±m). 
ИЛ-1 (пг/мл) ИЛ-1 (пг/мл) ИЛ-8 (пг/мл) ФНО- (пг/мл) 
Супернатанты неактивированных нейтрофилов доноров(n=10) 51,3±3,5 12,6±1,4 48,8±23,4 4,6±0,27 
Супернатанты активированных частицами латекса нейтрофилов доноров (n=10) 53,5±6,1 24,8±14,1 101,7±42,3 6,2±0,85 
Супернатанты активированных адгезией на пластике нейтрофилов доноров (n=10) 63,1±5,3 63,5±16,6*, ** 889,5±28,3*, ** 163,1±43,3*, ** 
Примечание: * - достоверность различий показателей по отношению к группе «Супернатанты неактивированных нейтрофилов доноров»; 
** - достоверность различий показателей по отношению к группе «Супернатанты активированных частицами латекса нейтрофилов доноров». Использован критерий Вилкоксона. 


Представленные табличные данные свидетельствуют о том, что предлагаемый «Способ получения интерлейкина-8 из нейтрофилов крови доноров» является наиболее эффективным по сравнению с применяемым в современной иммунологии.




ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


Способ получения интерлейкина-8 из нейтрофилов крови доноров, включающий выделение нейтрофилов из периферической крови доноров на двойном градиенте фиколл-верографина, доведение клеточной суспензии нейтрофилов до концентрации 5·106 клеток/мл, активирование при 37°С в течение 1 ч с последующим центрифугированием и отделением супернатанта, содержащего целевой продукт, отличающийся тем, что для активирования клеточную суспензию нейтрофилов в концентрации 5·106 клеток/мл раствора Хенкса разливают в пластмассовые чашки Петри.