СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКАХ КРОВИ К ПАТОГЕННЫМ БАКТЕРИЯМ YERSINIA ENTEROCOLITICA СЕРОВАРОВ O:3, O:5 ИЛИ O:6,30 С ПРИМЕНЕНИЕМ ПЬЕЗОГРАВИМЕТРИЧЕСКОГО ИММУНОСЕНСОРА

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКАХ КРОВИ К ПАТОГЕННЫМ БАКТЕРИЯМ YERSINIA ENTEROCOLITICA СЕРОВАРОВ O:3, O:5 ИЛИ O:6,30 С ПРИМЕНЕНИЕМ ПЬЕЗОГРАВИМЕТРИЧЕСКОГО ИММУНОСЕНСОРА


RU (11) 2288472 (13) C1

(51) МПК
G01N 33/53 (2006.01)
C12Q 1/00 (2006.01)
C12R 1/00 (2006.01) 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 29.08.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(14) Дата публикации: 2006.11.27 
(21) Регистрационный номер заявки: 2005116366/13 
(22) Дата подачи заявки: 2005.05.30 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2005.05.30 
(45) Опубликовано: 2006.11.27 
(56) Аналоги изобретения: GRANFORS et al. Measurment of immunoglobulin M, immunoglobulin G and immunoglobulin A antibodies against Yersinia enterocolitica by Enzyme-linked immunosorbent assay: comparison of lipopolysaccharide and whole bacterium as antigen, Journal of Clinical microbioligy, July, 1981, с.6-14. Калмыкова Е.Н. и др. Разработка пьезокварцевых иммуносенсоров
для проточно-инжекционного анализа высоко- и низкомолекулярных соединений. Вести Моск. Ун-та, сер.2. Химия, 2002, т.43, № 6, с.399-403. LU et al., A reusable and specific protein A-coated piezoelectric biosensor for flow injection immunoassay, Biotechnol Prog., 2000 Jan-Feb; 16(1), реф. US 5,306,644 A, 26.04.1994.

(72) Имя изобретателя: Калмыкова Елена Николаевна (RU); Дергунова Елена Сергеевна (RU); Горшкова Раиса Петровна (RU); Командрова Надежда Алексеевна (RU); Ермолаева Татьяна Николаевна (RU) 
(73) Имя патентообладателя: ЛИПЕЦКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ (ЛГТУ) (RU) 
(98) Адрес для переписки: 398600, г.Липецк, ул. Московская, 30, ЛГТУ, НИС 

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКАХ КРОВИ К ПАТОГЕННЫМ БАКТЕРИЯМ YERSINIA ENTEROCOLITICA СЕРОВАРОВ O:3, O:5 ИЛИ O:6,30 С ПРИМЕНЕНИЕМ ПЬЕЗОГРАВИМЕТРИЧЕСКОГО ИММУНОСЕНСОРА
Изобретение относится к иммунологии. Через проточную микроячейку объемом 15-20 мкл пропускают поток фосфатного буферного раствора-носителя со скоростью 30-90 мкл/мин, в который вводят анализируемый образец сыворотки в объеме 200 мкл. Проточная ячейка снабжена горизонтально закрепленным пьезогравиметрическим иммуносенсором с частотой колебания fm и рецепторным покрытием на основе одного из ЛПС Yersinia enterocolitica серовара О:3, О:5 или О:6,30. Затем регистрируют связывание ЛПС Yersinia enterocolitica серовара О:3, О:5 или О:6,30, с антителами по уменьшению частоты колебаний сенсора от fm до f и определяют концентрацию антител по градуировочному графику прямо пропорционально величине f, равной fm-f. Использование изобретения позволяет сократить процедуру анализа до 10 мин, а также проводить многоразовый анализ после регенерации сорбированных ЛПС с чувствительностью 1,3 мкг/мл и определять концентрацию антител в диапазоне 10-100 мкг/мл. 1 табл.




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Изобретение относится к области аналитической химии и может быть рекомендовано для высокочувствительного селективного определения антител к бактериям Yersinia enterocolitica сероваров О:3; О:5 или О:6,30 в образцах сыворотки крови.

Известен метод определения антител к патогенным бактериям Yersinia enterocolitica в образцах сыворотки крови на основе непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) на твердофазном носителе с использованием в качестве антигенов липополисахаридов (ЛПС) 0-3 и 0-9 серогрупп [Инструкция «Тест-система скрининговая для иммуноферментного определения IgG антител к условно-патогенным бактериям (ИФА-АТ-УПБ)» Лаборатории иммунохимической диагностики НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова РАМН, http://autoimmunity.narod.ru/ifaatupb.html.], характеризующийся относительно невысокой чувствительностью (метод полуколичественный), необходимостью введения ферментной метки (пероксидазы) для выявления образовавшегося иммунного комплекса, длительностью (включает стадии отмывания, обработки «стоп-реагентами»), высокой стоимостью, поскольку предусматривает одноразовое использование полистирольных сорбент-планшетов и биореагентов.

При создании изобретения ставились задачи: упрощение и сокращение процедуры анализа; уменьшение расхода биохимических реагентов за счет исключения ферментных меток и обеспечения возможности многоразового использования сорбированных ЛПС после их регенерации; а также повышение чувствительности определения гомологичных антител в сыворотках крови.

Это достигается тем, что в предлагаемом способе регистрация образующегося (и разрушающегося) иммунного комплекса ЛПС-Ат осуществляется с помощью гравиметрического (пьезокварцевого) иммуносенсора по изменению массы его селектирующего слоя, сформированного на поверхности электрода пьезокварцевого резонатора, содержащего иммобилизованные ЛПС. Аналитическим сигналом сенсора служит уменьшение частоты колебаний (f) пьезокварцевого резонатора, вследствие увеличения массы биорецепторного покрытия его электрода при связывании иммобилизованных ЛПС с анализируемыми антителами. Сигнал, регистрируемый с помощью частотомера, рассчитывается по уравнению: f=fm - f, где fm - частота колебаний иммуносенсора до введения антител; f - частота колебаний иммуносенсора после образования гетерогенного иммунного комплекса.

Проточно-инжекционный способ определения антител с использованием пьезогравиметрического иммуносенсора осуществляли в режиме реального времени следующим образом: анализируемые образцы (200 мкл) вводили в поток раствора-носителя (фосфатный буферный физиологический раствор, рН 6,8-7,5, скорость 30-90 мкл/мин), который пропускали через микроячейку детектирования (объем 15-20 мкл) с горизонтально закрепленным в ней массочувствительным иммуносенсором, контактирующим одной стороной с исследуемьм раствором. Для создания иммуносенсора использовали пьезокварцевый резонатор АТ-среза (частота колебаний 9,5-10 МГц) с золотыми и серебряными электродами диаметром 8 мм, на поверхности которых формировали тонкую пленку, содержащую иммобилизованные ЛПС. Для этого на одну сторону электрода наносили раствор кедрового масла (0,01%, в хлороформе), после удаления растворителя, на поверхность полученной пленки помещали каплю 0,001% водного раствора ЛПС и выдерживали не менее 2 часов для получения прочного биочувствительного слоя. После промывания в буферном физрастворе и стабилизации в проточной системе иммуносенсор использовали для анализа образцов сывороток крови с различной концентрацией специфических антител Yersinia enterocolitica различных сероваров и неспецифического белка бычьего сывороточного альбумина (BSA).

Введение в поток раствора-носителя пробы гомологичной сыворотки с различной концентрацией антител вызывало снижение частоты колебаний сенсора, прямо пропорциональное концентрации антител; введение регенерирующего раствора (0,1-0,3 mM тиоцианат калия) приводило к разрушению иммунного комплекса и восстановлению исходной частоты колебаний. Один измерительный цикл, включающий регенерацию и стабилизацию сенсора, осуществляется за 10-30 мин. На сенсоре с иммобилизованными ЛПС одного серовара возможно проведение свыше 15 измерений. Полное очищение электродов хлороформом позволяет использовать один резонатор для иммобилизации ЛПС другой специфичности более 10 раз.

Градуировочный график для определения антител линеен в диапазоне концентраций 10-100 мкг/мл. Предлагаемый способ характеризуется высокой специфичностью и чувствительностью (предел обнаружения составляет 1,3 мкг/мл), воспроизводимость определений, выполненных в 3-5 повторах (S r), соответствует 0,080±0,004.

Пример 1. Образец раствора поликлональных антител к бактериям Yersinia enterocolitica О:5 (штамм 124), содержащий 25 мкг кроличьей сыворотки крови в пересчете на сухую навеску, анализировали с помощью проточного пьезокварцевого иммуносенсора с иммобилизованными ЛПС Yersinia enterocolitica О:5 (штамм 124) в качестве биорецепторного слоя. Среднее значение измерений аналитических сигналов сенсора, выполненных в 5 повторах, составляет 45 Гц, воспроизводимость (Sr ) - 0,084.

Пример 2. Образец раствора антител к бактериям Yersinia enterocolitica О:5 (штамм 124), содержащий 100 мкг сыворотки крови в пересчете на сухую навеску, в 1 мл буферного физраствора исследовали аналогично способу, указанному в примере 1. Среднее значение аналитического отклика иммуносенсора составляет 149 Гц, Sr - 0,082.

Пример 3. Образец раствора антител к бактериям Yersinia enterocolitica О:5 (штамм 124), содержащий 150 мкг сыворотки крови в пересчете на сухую навеску, в 1 мл буферного физраствора исследовали аналогично способу, указанному в примере 1. Среднее значение аналитического отклика иммуносенсора соответствует 70 Гц, Sr - 0,081.

Пример 4. Образец раствора антител к бактериям Yersinia enterocolitica О:6,30 (штамм 102), содержащий 50 мкг сыворотки крови в пересчете на сухую навеску, в 1 мл буферного физраствора исследовали аналогично способу, указанному в примере 1, используя в качестве рецепторного слоя иммобилизованные ЛПС Yersinia enterocolitica О:6,30 (штамм 102). Среднее значение аналитического отклика иммуносенсора соответствует 103 Гц, Sr - 0,079.

Пример 5. Образец раствора антител к бактериям Yersinia enterocolitica О:3 (штамм 81), содержащий 50 мкг сыворотки крови в пересчете на сухую навеску, в 1 мл буферного физраствора исследовали аналогично способу, указанному в примере 1, используя в качестве рецепторного слоя иммобилизованные ЛПС Yersinia enterocolitica О:3 (штамм 81). Среднее значение аналитического отклика иммуносенсора соответствует 106 Гц, Sr - 0,081.

Пример 6. Образец раствора неспецифического белка - бычьего сывороточного альбумина (BSA), содержащий 25 мкг белка в пересчете на сухую навеску, в 1 мл буферного физраствора исследовали аналогично способу, указанному в примере 1, используя в качестве рецепторного слоя иммобилизованные ЛПС Yersinia enterocolitica О:5 (штамм 124). Среднее значение аналитического сигнала иммуносенсора составляет 8 Гц, Sr - 0,080. Низкие значения сигнала связаны с отсутствием аффинного взаимодействия биорецепторного слоя с неспецифическим белком.

Пример 7. Образец раствора неспецифического белка - бычьего сывороточного альбумина (BSA), содержащий 25 мкг белка в пересчете на сухую навеску, в 1 мл буферного физраствора исследовали аналогично способу, указанному в примере 1, используя в качестве рецепторного слоя иммобилизованные ЛПС Yersinia enterocolitica О:6,30 (штамм 102). Среднее значение аналитического сигнала иммуносенсора составляет 6 Гц, Sr - 0,079. Низкие значения сигнала связаны с отсутствием аффинного взаимодействия биорецепторного слоя с неспецифическим белком.

Пример 8. Образец раствора антител к бактериям Yersinia enterocolitica О:3 (штамм 81), содержащий 25 мкг сыворотки крови в пересчете на сухую навеску, в 1 мл буферного физраствора исследовали аналогично способу, указанному в примере 1, используя в качестве рецепторного слоя иммобилизованные ЛПС Yersinia enterocolitica О:5 (штамм 124). Среднее значение аналитического отклика иммуносенсора соответствует 8 Гц, Sr - 0,084. Низкие значения сигнала свидетельствуют об отсутствии перекрестных взаимодействий и высокой специфичности сенсора.

Сравнительная характеристика известного и предлагаемого способов определения антител в жидких средах приведена в таблице.

Таблица 
Показатели Известный способ Предлагаемый способ 
Чувствительность определений Полуколичественный метод Высокочувствительный 
Предел обнаружения антител Не указан 1,3 мкг/мл 
Введение ферментной метки Необходимо Не требуется 
Способ детектирования Апосредованный Прямой 
Продолжительность анализа Часы 10 минут 
Диапазон определяемых содержаний Не указан 10-100 мкг/мл 
Селективность анализа, % 90 96 
Многоразовое использование биослоя Не предусмотрено Возможно проведение свыше 15 измерительных циклов 





ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


Способ определения концентрации антител в сыворотках крови к патогенным бактериям Yersinia enterocolitica серовара O:3, O:5 или O:6,30, отличающийся тем, что через проточную микроячейку объемом 15-20 мкл, снабженную горизонтально закрепленным пьезогравиметрическим иммуносенсором с частотой колебания fm и рецепторным покрытием на основе одного из ЛПС Yersinia enterocolitica серовара O:3, O:5 или O:6,30, пропускают поток фосфатного буферного раствора-носителя со скоростью 30-90 мкл/мин, в который вводят анализируемый образец сыворотки в объеме 200 мкл, по уменьшению частоты колебаний сенсора от fm до f регистрируют связывание ЛПС с антителами и затем определяют концентрацию антител по градуировочному графику прямо пропорционально величине f , равной fm-f.