СОСТАВ ПОКРЫТИЯ ПЬЕЗОКВАРЦЕВОГО РЕЗОНАТОРА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ YERSINIA ENTEROCOLITICA В ВОДНЫХ СРЕДАХ

СОСТАВ ПОКРЫТИЯ ПЬЕЗОКВАРЦЕВОГО РЕЗОНАТОРА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ YERSINIA ENTEROCOLITICA В ВОДНЫХ СРЕДАХ


RU (11) 2287585 (13) C1

(51) МПК
C12Q 1/04 (2006.01)
G01N 33/53 (2006.01) 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 29.08.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(14) Дата публикации: 2006.11.20 
(21) Регистрационный номер заявки: 2005115786/13 
(22) Дата подачи заявки: 2005.05.24 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2005.05.24 
(45) Опубликовано: 2006.11.20 
(56) Аналоги изобретения: КАЛМЫКОВА Е.Н. и др. Разработка пьезокварцевых иммуносенсоров для проточно-инжекционного анализа высоко- и низкомолекулярных соединений, Вести. Моск. Ун-та, сер. 2, Химия, 2002, т.43, №6, с.399-403. US 5,306,644 А, 26.04.1994. LU et al., A reusable and specific protein A - coated piezoelectric biosensorfor flow injection immunoassay, Biotechnol Prog., 2000 Jan-Feb; 16(1) реф. 
(72) Имя изобретателя: Калмыкова Елена Николаевна (RU); Дергунова Елена Сергеевна (RU); Горшкова Раиса Петровна (RU); Командрова Надежда Алексеевна (RU); Ермолаева Татьяна Николаевна (RU) 
(73) Имя патентообладателя: Липецкий Государственный технический университет (ЛГТУ) (RU) 
(98) Адрес для переписки: 398600, г.Липецк, ул. Московская, 30, НИС ЛГТУ 

(54) СОСТАВ ПОКРЫТИЯ ПЬЕЗОКВАРЦЕВОГО РЕЗОНАТОРА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ YERSINIA ENTEROCOLITICA В ВОДНЫХ СРЕДАХ
Изобретение относится к иммунологии. Предложен состав покрытия пьезокварцевого резонатора для определения антител Yersinia enterocolitica в водных средах, содержащий кедровое масло 5,6-24,4 (% по массе) и липополисахарид из Yersinia enterocolitica 75,6-94,4 (% по массе). Использование изобретения позволяет упростить и ускорить формирование покрытия на поверхности пьезокварцевого резонатора, а также определять антитела к Yersinia enterocolitica с пределом обнаружения 1,3 мкг/мл. 1 табл.




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Изобретение относится к составу покрытий пьезокварцевых резонаторов и может быть рекомендовано для анализа жидкостей при определении антител Yersinia enterocolitica 0:5,27 с помощью гравиметрических иммуносенсоров.

В настоящее время за рубежом интенсивно разрабатываются гравиметрические иммуносенсоры, предназначенные для прямого (без дополнительных меток и сложной пробоподготовки) высокочувствительного и избирательного определения различных биологически активных веществ, в том числе антител. В качестве прототипа выбран состав покрытия пьезокварцевого резонатора, предназначенного для определения концентрации антител к атразину в водных растворах с применением пьезокварцевого иммуносенсора в проточно-инжекционном режиме (Р.Skladal, J.Horacek. Kinetic studies of affinity interactions: Comparison of piezoelectric and resonant mirror-based biosensors. // Anal. Lett., 1999. Vol.32, №8. P.1519 - 1529). Указанный состав биорецепторного покрытия сенсора включает слой -аминопропилтриэтоксисилана, к которому ковалентно (с помощью глутарового альдегида) прикреплены атразинбелковые конъюгаты. Для формирования биослоя, позволяющего определять концентрации соответствующих антител в линейном диапазоне 350-3000 мкг/мл с пределом обнаружения 5 мкг/мл, требуется продолжительное время (не менее 15 часов), относительно высокий расход химических и биохимических реагентов, а также использование жестко действующих щелочных растворов при очищении электродов.

При создании изобретения ставились задачи: упрощение и сокращение процедуры получения биочувствительного покрытия пьезокварцевого иммуносенсора; уменьшение расхода биохимических и химических реагентов и повышение чувствительности определения гомологичных антител.

Это достигается тем, что состав покрытия пьезокварцевого сенсора содержит водорастворимый липополисахарид (75,6-94,4% по массе), выделенный из бактерий Yersinia enterocolitica сервара 0:5,27, иммобилизованный методом физической сорбции на гидрофобном липидном слое кедрового масла [nD 20=1,477; d 20 20=0,927], предварительно сформированном на поверхности электрода сенсора (5,6-24,4% по массе). Липополисахариды, состоящие из углеводной и липидной областей, при контакте с липидным слоем ориентируются липидной областью к гидрофобной подложке и иммобилизуются за счет физической сорбции.

Формирование биослоя сенсора осуществляли в два этапа. На первом этапе на поверхность золотых и серебряных электродов пьезокварцевых резонаторов АТ-среза (частота колебаний 9,5-10 МГц) активировали нанесением фиксированного объема 0,01-0,04% раствора кедрового масла в хлороформе. На втором этапе выполняли иммобилизацию липополисахаридов, для чего каплю водного 0,01-0,001% раствора липополисахаридов помещали на полученную после испарения растворителя липидную пленку (подложку) и выдерживали не менее 2 часов. После промывания и высушивания до постоянной массы модифицированные резонаторы использовали для проточно-инжекционного анализа образца раствора антител (по прототипу). Разрушение иммунного комплекса осуществляли 0,1-0,3 mM раствором тиоцианата калия, что обеспечило многоразовое использование сенсора. Полное очищение металлической поверхности электродов пьезокварцевых резонаторов достигается использованием хлороформа.

Технический результат выражается в том, что применение предлагаемого состава покрытия пьезокварцевого сенсора расширяет перечень иммунореагентов для выявления антител с помощью пьезокварцевого сенсора, обеспечивает более высокую по сравнению с прототипом чувствительность определения (предел обнаружения антител составляет 1,3 мкг/мл по сравнению с прототипом - 5 мкг/мл), сокращает и упрощает процедуру получения биорецепторного слоя сенсора (до 2-3 часов), а следовательно, повышается эффективность анализа.

Пример 1. Образец раствора поликлональных антител к бактериям Yersinia enterocolitica 0:5,27 (штамм 124), содержащий 25 мкг кроличьей сыворотки крови в пересчете на сухую навеску, анализировали с помощью проточного пьезокварцевого иммуносенсора с иммобилизованными липополисахаридами Yersinia enterocolitica 0:5,27 (штамм 124) в качестве биорецепторного слоя. Среднее значение измерений аналитических сигналов сенсора, выполненных в 5 повторах, составляет 45 Гц, воспроизводимость (Sr) - 0,084.

Пример 2. Образец антител, использованный в примере, исследовали аналогично способу, указанному в примере 1, с применением покрытия более высоким содержанием кедрового масла (30% по массе). Среднее значение аналитического отклика иммуносенсора соответствует 16 Гц, Sr - 0,096. Увеличение доли липидной компоненты в составе покрытия приводит к снижению чувствительности сенсора вследствие превышения оптимальной массы рецепторного слоя.

Пример 3. Образец антител, использованный в примерах 1 и 2, исследовали аналогично способу, указанному в примере 1, с применением покрытия, характеризующегося более низким содержанием кедрового масла (1% по массе). Среднее значение аналитического отклика иммуносенсора соответствует 21 Гц, S r - 0,097. Низкие концентрации липидного раствора при получении подложки не обеспечивают равномерность последующего распределения молекул липополисахаридов по площади электрода, что снижает чувствительность определений.

Пример 4. Образец раствора антител к бактериям Yersinia enterocolitica 0:5,27; штамм 124, содержащий 50 мкг сыворотки крови в пересчете на сухую навеску, в 1 мл буферного физраствора исследовали аналогично способу, указанному в примере 1. Среднее значение аналитического отклика иммуносенсора соответствует 100 Гц, Sr - 0,087.

Пример 5. Образец раствора антител к бактериям Yersinia enterocolitica 0:5,27; штамм 124, содержащий 100 мкг сыворотки крови в пересчете на сухую навеску, в 1 мл буферного физраствора исследовали аналогично способу, указанному в примере 1. Среднее значение аналитического отклика иммуносенсора составляет 149 Гц, Sr - 0,082.

Пример 6. Образец раствора антител к бактериям Yersinia enterocolitica 0:5,27; штамм 124, содержащий 150 мкг сыворотки крови в пересчете на сухую навеску, в 1 мл буферного физраствора исследовали аналогично способу, указанному в примере 1. Среднее значение аналитического отклика иммуносенсора соответствует 70 Гц, Sr - 0,081.

Пример 7. Образец раствора неспецифического белка - бычьего сывороточного альбумина (BSA), содержащий 25 мкг белка в пересчете на сухую навеску, в 1 мл буферного физраствора исследовали аналогично способу, указанному в примере 1. Аналитический отклик иммуносенсора составляет 8 Гц, Sr - 0,080. Низкое значение сигнала связано с отсутствием аффинного взаимодействия биорецепторного слоя с неспецифическим белком.

Сокращение продолжительности анализа и повышение чувствительности определения антител с рецепторным покрытием сенсора на основе липополисахаридов объясняется высокой 0-антигенной специфичностью природных макромолекул и эластичностью получаемого слоя, поддерживающего конформационную подвижность рецепторных молекул. Чувствительность пьезокварцевого детектирования (нижний предел определяемых содержаний) антител с использованием тонкой биорецепторной пленки на основе иммобилизованных липополисхаридов превосходит прототип и составляет 1,3 мкг/мл (по прототипу 5 мкг/мл).

Сравнительная характеристика известного и предлагаемого состава биорецепторного покрытия пьезокварцевого сенсора при определении антител в водной среде приведена в таблице.

Таблица 
Показатели Известное покрытие Предлагаемое покрытие 
Продолжительность формирования биослоя 15 часов 2-3 часа 
Количество стадий обработки резонатора при получении биослоя 3 2 
Использование кросс-линкеров и спейсеров Требуется Не требуется 
Концентрация раствора иммобилизуемых биомолекул 300 мкг/мл 100 мкг/мл 
Диапазон определяемых содержаний специфичных антител 350-3500 мкг/мл 1-300 мкг/мл 
Предел обнаружения 5,0 мкг/мл 1,3 мкг/мл 
Время, получения аналитического сигнала, мин 10 2 
Регенерирующий покрытие раствор 100 mM NaOH 0,1- mM KCNS 
Полное очищение поверхности металла 2 МН Cl Хлороформ 


Как видно из таблицы, предложенный состав рецепторного слоя пьезокварцевого иммуносенсора по совокупности существенных признаков является новым, позволяет значительно сократить время его формирования, уменьшить расход реактивов и добиться повышения чувствительности определения антител к Yersinia enterocolitica сервара 0:5,27 в водных растворах.




ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


Состав покрытия пьезокварцевого резонатора для определения антител Yersinia enterocolitica в водных средах, характеризующийся тем, что содержит кедровое масло и липополисахарид из Yersinia enterocolitica при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Кедровое масло 5,6-24,4 
Липополисахарид из Yersinia enterocolitica 75,6-94,4