БЕЛКОВОПЕПТИДНЫЙ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЙ КОМПОЗИТ, КЛЕТОЧНЫЙ ПРЕПАРАТ, АКТИВИРОВАННЫЙ ЭТИМ КОМПОЗИТОМ, И СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ ОПУХОЛЕЙ

БЕЛКОВОПЕПТИДНЫЙ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЙ КОМПОЗИТ, КЛЕТОЧНЫЙ ПРЕПАРАТ, АКТИВИРОВАННЫЙ ЭТИМ КОМПОЗИТОМ, И СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ ОПУХОЛЕЙ


RU (11) 2283129 (13) C1

(51) МПК
A61K 38/12 (2006.01)
A61P 35/00 (2006.01) 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 29.08.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(14) Дата публикации: 2006.09.10 
(21) Регистрационный номер заявки: 2004137945/15 
(22) Дата подачи заявки: 2004.12.24 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2004.12.24 
(45) Опубликовано: 2006.09.10 
(56) Аналоги изобретения: RU 2233625 А, 20.08.2004. СОХ A.L. et al., Science 264:716-719, 1994. 
(72) Имя изобретателя: Калинина Екатерина Сергеевна (RU); Луценко Елена Валерьевна (RU); Луценко Сергей Викторович (RU); Северин Евгений Сергеевич (RU); Северин Сергей Евгеньевич (RU); Фельдман Наталия Борисовна (RU); Хомякова Анастасия Викторовна (RU) 
(73) Имя патентообладателя: Луценко Сергей Викторович (RU); Северин Евгений Сергеевич (RU); Северин Сергей Евгеньевич (RU) 
(98) Адрес для переписки: 117638, Москва, Симферопольский б-р, 8, МНИИМЭ, С.В. Луценко 

(54) БЕЛКОВОПЕПТИДНЫЙ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЙ КОМПОЗИТ, КЛЕТОЧНЫЙ ПРЕПАРАТ, АКТИВИРОВАННЫЙ ЭТИМ КОМПОЗИТОМ, И СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ ОПУХОЛЕЙ
Изобретение относится к области иммунологии и клеточной терапии. Сущность изобретения составляет белковопептидный противоопухолевый композит, содержащий белок теплового шока семейства HSP 70 или его фрагмент и нековалентно связанный с ним опухолеспецифический пептид, выбранный из группы: MAGE-A1, -А2, -A3, gp 100, HER2/neu, EGFRvIII или фрагмент любого из них, при этом нековалентная связь обеспечена предварительным инкубированием компонентов в физиологических условиях с аденозиндифосфатом. В качестве белка теплового шока он содержит белок, выбранный из группы: DnaK из М.tuberculosis, M.bovis или Е.coli, или белок HSP 70 человека. В качестве фрагмента опухолеспецифического пептида содержит таковой в соответствии с таблицей, приведенной в описании, дополнительно содержит иммуномодулятор, выбранный из группы: INF , INF , TNF , IL-2, -4, -6 или их комбинацию, а также фармацевтический носитель. Другим объектом изобретения является клеточный препарат, представляющий собой выделенные и промытые дендритные лейкоциты, активированные инкубированием с новым композитом. Еще одним объектом изобретения является способ иммунотерапии или иммунопрофилактики опухолей путем введения в организм парентерально композита или клеточного препарата в эффективном количестве. 3 н. и 5 з.п. ф-лы, 1 табл., 3 ил. 




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Изобретение относится к области биомолекулярной иммунологии и клеточной терапии, в частности созданию белковопептидного противоопухолевого композита, клеточного препарата на его основе, а также профилактики или лечения первичных и метастатических неопластических заболеваний с помощью этих препаратов.

Наряду со специфическим тормозящим влиянием на опухоли современные антинеопластические средства действуют не только на опухолевые, но и на другие ткани и системы организма, что, с одной стороны, обусловливает их нежелательные побочные эффекты, а с другой - позволяет использовать их в других областях медицины. Кроме того, существенным недостатком современных химиотерапевтических препаратов является малая избирательность действия в отношении опухолевых клеток.

Одним из основных побочных эффектов противоопухолевой химиотерапии является угнетение кроветворения, что требует точного регулирования доз и режима применения таких препаратов; необходимо учитывать, что депрессия гемопоэза усиливается при комбинированной терапии - сочетании препаратов с лучевой терапией и др. Некоторые противоопухолевые антибиотики обладают кардио- (доксорубицин и др.), нефро- и ототоксичностью. При применении отдельных препаратов возможно развитие гиперурикемии. Эстрогены, андрогены, их аналоги и антагонисты могут вызывать гормональные расстройства. В настоящее время все большее распространение получают препараты нового поколения - прицельно направленные против опухолевых клеток (векторные) и клеточные, например клеточные линии, экспрессирующие противоопухолевые агенты.

Например, известны альгинатные капсулы для применения в лечении опухоли мозга (патент РФ №2229287, май 2004 г.). Этот патент описывает клеточную линию, способную экспрессировать молекулу, являющуюся ингибитором роста опухоли центральной нервной системы, инкапсулированную в альгинат, содержащий более 15% гиалуроновой кислоты.

Известен способ лечения нейроэктодермальной или эпителиальной опухоли, включающий введение пациенту агента, ингибирующего ангиогенез, и иммунотерапевтического агента, содержащего цитокиновый компонент и иммуноглобулиновый пептид (патент РФ №2233625, сентябрь, 2004). Однако эти разработки направлены на достаточно узкую область воздействия и не могут быть использованы для других онкологических патологий.

В связи с высокой потребностью создания эффективных и безопасных препаратов для профилактики и лечения различных онкологических заболеваний, от которых в мире ежегодно умирает около 6 млн. человек, работы в области расширения арсенала таких препаратов являются чрезвычайно актуальными. Результатом работ в этой области явился ряд изобретений, которые легли в основу стратегии наших исследований.

В частности, это работы в области противоопухолевых препаратов - гибридных, слитых и других белков. Например, в опубликованной заявке на изобретение РФ №2003101965/14 описан способ лечения заболеваний, связанных с вирусом папилломы человека (бородавки, рак шейки матки и прямой кишки и т.д.) с помощью композиции, содержащей гибридный белок, включающий микобактериальный белок теплового шока (HSP 65 или HSP 70 из Mycobacterium bovis) и белок вируса папилломы. Лечение может осуществляться либо путем введения субъекту рекомбинантного гибридного белка либо путем введения нуклеиновой кислоты, кодирующей гибридный белок, которая содержится в вирусном векторе.

К недостаткам используемого авторами заявки подхода следует отнести использование вирусного вектора, последствия применения которого недостаточно изучены и могут представлять потенциальную опасность для пациента. Кроме того, при введении гибридного белка его частичное внутриклеточное протеосомное расщепление может приводить к элиминированию антигенных детерминант вирусного белка и недостаточно активной презентации опухолеспецифичных пептидов в составе белков главного комплекса гистосовместимости на поверхности опухолевых клеток. Следует также отметить, что применение описанного изобретения ограничивается лишь новообразованиями, связанными с инфицированием вирусом папилломы человека.

В последние годы были проведены научно-исследовательские работы по созданию иммуностимулирующих комплексов, в состав которых входят белки теплового шока. В связи с низкой иммуногенностью синтетических антигенных пептидов рядом авторов предпринимались попытки ее повышения путем создания in vitro комплексов антигенных пептидов и человеческих микобактериальных белков теплового шока [1, 2]. Эти комплексы обладают способностью вызывать сильные специфичные реакции на входящие в их состав антигенные пептиды.

В опубликованной заявке на изобретение США №20030216315, 2003 г. описан метод ингибирования роста первичных опухолей и метастазов путем введения субъекту рекомбинантного фрагмента белка теплового шока (HSP 60, HSP 70, HSP 90), лишенного пептидсвязывающего домена. При этом могут быть использованы гены, кодирующие указанные белки из любых организмов. Авторы названной заявки рассматривают рекомбинантный фрагмент белка теплового шока в качестве средства стимуляции иммунного ответа при онкологических и иных заболеваниях. По мнению авторов, этот белок может также найти применение в качестве адьюванта для стимуляции специфического иммунного ответа на экзогенные антигены. Совместное введение белка и антигенного пептида субъекту должно вызывать специфический адаптивный иммунный ответ, направленный против антигена.

Однако с точки зрения практического применения такого белка, полученного в виде рекомбинантного продукта, а не целого нативного белка теплового шока, т.е. его фрагмента, лишенного пептидсвязывающего домена, просматриваются серьезные недостатки. Хотя фрагмент и сохраняет свойства адьюванта, отсутствие в его составе пептидсвязывающего домена не позволяет использовать этот белок для создания in vitro эффективных препаратов-вакцин, в составе которых антигенные пептиды находятся в прочной, но нековалентной связи с белком теплового шока. Лишь нековалентные комплексы белков теплового шока и антигенных иммуномодулирующих пептидов способны обеспечить эффективную презентацию противоопухолевых антигенов на поверхности антигенпредставляющих клеток и индуцировать клеточный иммунный ответ на соответствующие пептиды.

Технической задачей настоящего изобретения является создание препарата, устраняющего вышеописанные недостатки противоопухолевых препаратов, обладающего высокой иммуногенностью и специфической цитотоксической активностью в отношении различных групп опухолевых клеток.

Техническая задача решается с помощью создания белковопептидного противоопухолевого композита, включающего белок теплового шока семейства HSP 70 или его фрагмент и нековалентно связанный с ним опухолеспецифический пептид, выбранный из группы: MAGE-A1, -А2, -A3, gp 100, HER2/neu, EGFRvIII или фрагмент любого из них, при этом нековалентная связь обеспечена предварительным инкубированием компонентов в физиологических условиях с участием аденозинфосфатного производного, а белок и пептид взяты в молярном соотношении 1:1. Композит в качестве белка теплового шока семейства HSP 70 содержит белок, выбранный из группы: DnaK из М.tuberculosis, M.bovis или Е.coli, или белок HSP 70 человека, а в качестве фрагмента опухолеспецифического антигенпредставляющего пептида содержит таковой, указанный в соответствии с таблицей 1, приведенной ниже. Композит дополнительно содержит иммуномодулятор, выбранный из группы: INF , INF , TNF , IL-2, -4, -6 или их комбинацию. Композит дополнительно может содержать пригодный фармацевтический носитель при введении его пациенту (для парентерального введения). В качестве аденозинфосфатного производного можно использовать аденозинди- или - трифосфорную кислоту или ее соли.

Дополнительный технический результат - композиты HSP-белков с опухолеспецифическими пептидами можно рассматривать в качестве доступных вакцинных препаратов, которые могут применяться без каких-либо дополнительных адьювантов.

Также нековалентные композиты HSP-белков с антигенпредставляющими онкоспецифическими пептидами могут быть использованы для активации ex vivo взятых у пациентов (или здоровых доноров) «дендритных» клеток - лейкоцитов. После введения пациенту активированных дендритных клеток достигается достаточно сильный клеточный иммунный ответ на противоопухолевые пептиды, входящие в состав композитов.

В связи с этим еще одним объектом изобретения является противоопухолевый клеточный препарат, представляющий собой выделенные, промытые и очищенные дендритные мононуклеарные аутологичные клетки или таковые от здорового донора, активированные белковопептидным композитом, охарактеризованным выше. Активирование проводят инкубированием дендритных клеток с эффективным количеством нашего композита.

Литературные и собственные исследования показывают, что использование в настоящей разработке перечисленных опухолеспецифических белков или их пептидных фрагментов в композите с белками теплового шока можно пояснить следующим образом.

С иммунологической точки зрения антигены опухолеспецифических пептидов группы MAGE являются очень хорошими мишенями для проведения иммунотерапии. Группа пептидов MAGE - это относительно крупные белки с рядом потенциальных эпитопов, связываемых HLA класса I. Однако при применении пептидных фрагментов этих белков in vivo вызываемый ими иммунный ответ и противоопухолевая активность остаются на весьма низком уровне. Группа пептидов MAGE широко представлена в ряде опухолей и отсутствует в нормальных тканях человека, за исключением яичек, на которых клетки иммунной системы не действуют благодаря отсутствию прямого контакта клеток яичек и иммунных клеток, а также отсутствию HLA класса I на поверхности репродуктивных клеток [3, 4]. Одним из объяснений низкой иммуногенности антигенов MAGE является стабильность их структуры, как и другие высокоорганизованные белки, MAGE имеют в составе молекулы высокий процент -спиралей, обеспечивающих оптимальную геометрию для максимального количества и силы водородных связей. Внутри клетки для последующего представления антигена белок MAGE должен быть частично ренатурирован, убиквитирован и затем подвергнут протеолитической деградации. Очевидно, что высокоорганизованный белок со структурой, стабилизированной большим количеством связей, будет более устойчив к протеосомной деградации, а следовательно, и с большим трудом презентироваться на поверхности клеток в составе HLA типа I, что и наблюдается в случае меланомных белков MAGE. Вероятно, что опухолевые клетки характеризуются крайне низким уровнем экспрессии презентируемого антигена из следовых количеств частично денатурированных опухолеспецифичных белков MAGE. В силу этого лимитирующим этапом может являться обучение «наивных» лимфоцитов, для которого требуется примерно в 1000 раз более высокие концентрации (уровни) антигенного пептида, презентируемого на клеточной поверхности, чем это требуется для лизиса клетки, несущей антиген, уже обученными лимфоцитами. Значительное повышение иммуногенности пептидов MAGE может быть достигнуто при их применении в составе с белками теплового шока (стрессовыми белками, HSP). Белки теплового шока, как оказалось, обладают способностью к связыванию с широким спектром опухолеспецифических антигенных пептидов. Такой комплекс обладает способностью к интернализации в антигенпредставляющие клетки с последующей эффективной презентацией пептида на их поверхности в составе HLA класса I. Презентируемый соответствующим образом антиген после активации «наивных» лимфоцитов вызывает развитие клеточного иммунного ответа, направленного на клеточные белки, принимающие участие в опухолевом процессе. Преимуществом предлагаемого нами подхода является возможность создания композитов (подобных комплексным противоопухолевым вакцинам) in vitro. Композит получают путем смешивания и инкубирования (в физиологических условиях в присутствии аденозиндифосфата) определенных количеств белка теплового шока семейства HSP 70 и пептида из определенного набора опухолеспецифических антигенпредставляющих пептидов.

Наряду с пептидами группы MAGE одним из наиболее перспективных антигенпредставляющих пептидов для индукции клеточного иммунного ответа является продукт экспрессии гена gp 100. Белок gp 100 представляет собой мембранный гликопротеин, состоящий из 661 аминокислоты. Ген gp 100 экспрессируется в большинстве линий меланомных клеток, а также на культивируемых меланоцитах. В линиях немеланомных раковых клеток gp 100 не экспрессируется. В нормальных тканях gp 100 обнаружен лишь в сетчатке глаза [5], где белок преимущественно локализован в мембране и филаментном матриксе премеланосом, где, по-видимому, участвует в синтезе меланина [6, 7]. Белок gp 100 распознается рестриктированными по HLA-A2 инфильтрующими опухоль лимфоцитами [8]. При этом идентифицирована последовательность, распознаваемая цитотоксическими лимфоцитами. Очевидно, что использование белка gp 100 или его фрагментов в составе HSP-препаратов для профилактической помощи или лечения меланом имеет большие перспективы. Применение композита, содержащего белок HSP 70 и пептид gp 100 (его антигенный фрагмент) для активации антигенпредставляющих клеток и последующей индукции иммунного ответа, может позволить сделать терапию значительно более прогнозируемой и эффективной.

Другим перспективным онкоспецифическим белком для создания композита на основе белка теплового шока является белок HER2/neu, имеющий высокую степень гомологии с рецептором эпидермального фактора роста. Данный белок экспрессируется у 20-40% больных раком молочной железы или яичника [9, 10]. Гиперэкспрессия белка HER2/neu и его пептидных Т-эпитопов может приводить к усилению их имуногенности за счет преодоления необходимого для реакций Т-клеток порога плотности комплексов «молекула МНС-пептид» на поверхности клетки. Однако на практике в большинстве случаев, несмотря на гиперэкспрессию рецепторов, эффективного распознавания трансформированных клеток иммунной системой не происходит.Использование онкоспецифического фрагмента HER2/neu в композите с белком теплового шока является действенным инструментом для создания противоопухолевой вакцины, способной вызвать презентацию онкоспецифического пептида на поверхности антигенпредставляющих клеток и обеспечить эффективное «обучение» наивных Т-лимфоцитов с последующим элиминированием опухолевых клеток.

На основе композита, содержащего белок теплового шока и онкоспецифический белок HER2/neu, может быть создан активированный клеточный препарат, в котором указанный белковопептидный композит ex vivo инкубирован с дендритными клетками. Активированные таким образом клетки вводят пациенту и вызывают эффективную реакцию Т-лимфоцитов на опухолевые клетки, экспрессирующие HER2/neu.

Преимуществом предлагаемого подхода является возможность создания эффективных композиций и клеточных препаратов как на основе любых отдельных фрагментов HER2/neu, так и различных комбинаций этих фрагментов в композите на основе белка теплового шока.

Рецептор EGFRvIII представляет собой наиболее часто встречающийся продукт делеции экзонов 2-7 у нативного рецептора эпидермального фактора роста (ЭФР, например ErbBI), локализованный на поверхности клеток рака мозга (глиомы), легких и яичника. Образующийся в результате делеции продукт гена лишен 268 аминокислотных остатков внеклеточного лигандсвязывающего домена [11]. В результате делеции формируется уникальный специфичный для опухоли эпитоп. Рецептор EGFRvIII превалирует в глиомах, в опухолевых клетках при раке молочной железы и яичника и немелкоклеточном раке легкого [12, 13]. Рецептор EGFRvIII проявляет слабое сродство к ЭФР и конститутивно активен в отсутствие лиганда, что является ключевым фактором злокачественной трансформации клеток [14]. Плотность рецептора на поверхности опухолевых клеток достаточно высока и составляет 106 рецепторов на клетку. Полное отсутствие рецептора EGFRvIII в нормальных тканях организма позволяет рассматривать его в качестве идеального опухолевого маркера.

Заявителем предлагается также использовать онкоспецифические пептидные фрагменты или сам рецептор EGFRvIII (в качестве фрагмента, например, PEPErbBlvIII структуры LEEKKGNYVVTDHGS) для создания белковопептидных композитов на основе белка теплового шока, позволяющих осуществлять профилактическую помощь пациентам или терапию пациентов с опухолями, несущими рецептор EGFRvIII.

В настоящей разработке решается задача усиления иммунного ответа на пептиды - фрагменты опухолеспецифических белковых антигенов - с помощью стрессовых белков (белков теплового шока). Предлагаемые композиты белков семейства HSP 70 с опухолеспецифическими пептидами, перечисленными ниже, для вакцинации и иммунотерапии опухолей и метастазов ранее не применялись, и состав и эффективность их действия установлены Заявителем опытным путем впервые.

Таким образом предлагаются вакциноподобные композиции (композиты) белков теплового шока семейства HSP 70 и антигенных пептидов для профилактики и лечения опухолевых заболеваний, отличием которой является то, что она содержит белок теплового шока и нековалентно связанные с ним опухолеспецифические антигены (MAGE-A1, -А2, -A3, gp 100, HER2/neu, EGFRvIII) или их пептидные фрагменты. Композиты могут содержать как индивидуальные антигены, так и их различные сочетания, например, смесь всех вышеуказанных антигенов группы MAGE при лечении меланом или смесь антигенов HER2/neu и EGFRvIII при лечении больных с опухолями эпидермального происхождения. В качестве белковых компонентов композита предлагается использовать один из следующих белков теплового шока: DnaK из М.tuberculosis, M.bovis или Е.coli или HSP 70 человека. Предпочтительно данные белки получают путем экспрессии их генов в составе пригодных рекомбинантных векторов в штаммах-продуцентах клеток-хозяев. Опухолеспецифические антигены - компоненты вакцинных композиций -могут быть получены как из опухолевых клеток, так и с помощью генно-инженерных технологий. Короткие пептидные антигенные компоненты вакцинных композиций могут быть получены методами пептидного синтеза. Компоненты композиции смешивают и инкубируют in vitro непосредственно перед введением пациенту или перед процедурой сенситизации (активизации) антигенпредставляющих клеток для получения клеточного препарата.

Предлагается также способ иммунотерапии или иммунопрофилактики опухолей путем введения в организм препарата белкового происхождения, при этом в организм вводят белковопептидный композит, охарактеризованный выше, или клеточный препарат, активированный таким композитом в эффективном количестве.

Композит при молярном соотношении белка HSP и онкоспецифического пептида (его фрагмента) 1:1 используют для иммунотерапии в диапазоне доз от 0,01 до 10 мкг на одно введение.

Сущность изобретения поясняется с помощью следующих примеров:

Пример 1. Синтез пептидов - фрагментов опухолеспецифических пептидов (антигенов).

Пептиды получают методом твердофазного пептидного синтеза с использованием Fmoc стратегии. В качестве полимерного носителя была выбрана смола Wang-resin. На каждом шаге пептидной конденсации карбоксильную группу Fmoc-аминокислот активировали превращением в гидроксибензотриазоловый эфир с помощью HOBt и N.N-диизопропилкарбодиимида. Fmoc-аминокислоты, HoBt и N.N-диизопропилкарбодиимид вводили в реакцию в 10-кратных молярных избытках по отношению к аминогруппам полимера. За ходом реакции следили по изменению окраски бромфенолового синего, который добавляли в реактор в виде раствора в диметилсульфоксиде (ДМСО) в соотношении 1/1000 (мол.) к количеству аминогрупп.Реакция длилась 1.5-2 ч. После завершения конденсации смолу промывали 4 раза диметилформамидом (ДМФ) и обрабатывали 50% раствором пиперидина в ДМФ. Отщепление пептида от полимерного носителя проводили смесью трифторуксусной кислоты - 95%; воды - 2.5%; 1,2-этандитиола - 2.5%. После того, как смола была отфильтрована, пептид высаживали из раствора диэтиловым эфиром. Осадок отделяли центрифугированием, высушивали в вакууме и анализировали методом обращеннофазовой ВЭЖХ (ОФ ВЭЖХ) на колонке Phenomenex Luna С 18 250×3. Градиентное элюирование пептида с колонки проводили в системе растворителей: ацетонитрил-0.1% трифторуксусная кислота/вода. Полупрепаративная ОФ ВЭЖХ проводилась в тех же условиях на колонке Nucleosil С 18 250×8. Чистота пептидов после хроматографического разделения составляла 96-98%.

Пептиды были охарактеризованы методом масс-спектрометрии. В таблице 1 приведена аминокислотная структура синтезированных пептидов - фрагментов опухолеспецифических белков (антигенов), содержащихся в композите.

Таблица 1 
Онкоспецифический белок Аминокислотная последовательность пептидного фрагмента 
MAGE-A1 EADPTGHSY 
MAGE-A2 KMVELVHFL 
MAGE-A3 FLWGPRALV 
gp 100 YLEPGPVTA 
HER2/neu ELVSEFSRMA 
HER2/neu HLDMLRHLYQGCQVV 
HER2/neu SRLLGICLTSTVQLV 
PEP ErbBlvIII LEEKKGNYVVTDHGS 


Пример 2. Получение композита, содержащего смесь белка HSP 70 и опухолеспецифического пептида.

Для приготовления белковопептидного композита его компоненты смешивают в молярном соотношении 1:1 и проводят инкубацию в буферном растворе (физиологический раствор или фосфатно-солевой буфер с 2 мМ MgCl2) при 37°С в течение 1 ч. Затем вносят 0.5 мМ аденозиндифосфата (АДФ) и продолжают инкубацию в течение 1 ч при той же температуре. После повторной инкубации композит готов к использованию. Его приготовление проводят непосредственно перед использованием.

Компоненты композита хранят в асептических условиях в запаянных стеклянных ампулах, в сухом виде. В отдельных ампулах содержатся физиологический раствор или фосфатно-солевой буфер, содержащий 2 мМ MgCl2. АДФ в лиофилизированном из фосфатно-солевого буфера виде хранится в отдельных ампулах. Компоненты смешивают и инкубируют по вышеописанной технологии ex temporae, т.е. непосредственно перед применением.

Пример 3. Приготовление клеточного препарата

Клеточный препарат является взвесью так называемых дендритных клеток (ДК), представляющих собой очищенную фракцию мононуклеарных лейкоцитов из периферической крови. ДК выделяют из лейкоконцентрата периферической крови здоровых доноров по методике, описанной в литературе [15]. С помощью градиентного центрифугирования (400 g, 30 мин) через раствор фиколл-пак (Pharmacia, Швеция) получают фракцию мононуклеарных лейкоцитов. Фракцию промывают три раза раствором Версена (250 g, 175 g и 110 g по 15 мин), ресуспендируют в среде RPMI 1640 с добавлением 10%-ной инактивированной нагреванием эмбриональной бычьей сыворотки, содержащей 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина в концентрации 50 млн клеток/мл, затем помещают по 10 мл в чашки Петри и инкубируют 2 ч в увлажненной атмосфере 5%-ного СО2 при 37°С. После инкубации отбирают не прикрепившиеся к стенкам чашки клетки (в основном лимфоциты), центрифугируют, замораживают и хранят в жидком азоте. К монослою прикрепившихся клеток (в основном моноцитов) вносят по 10 мл свежей среды и инкубируют в стандартных условиях культивирования до следующего дня, который обозначали как "день №1". На 1-й и 3-й дни культивирования в инкубационную среду добавляли ГМ КСФ (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, 800 ед/мл) и IL-4 (1000 ед/мл). На 5-й день клетки собирают и переносят в 6-луночные планшеты при плотности 5·105 клеток на лунку в 3 мл свежей среды с цитокинами в той же концентрации. В день №6 добавляют индукторы созревания ДК в виде комплексного препарата цитокинов первой фазы иммунного ответа (препарат включает интерферон- , интерлейкины 1, 6, 8, 12 и фактор некроза опухолей , синтезированные лейкоцитами из крови клинически здоровых доноров) и приготовленный комплекс HSP 70-пептид. На 8-й день ДК (целевой продукт) собирали в отдельную емкость и затем использовали для индукции цитотоксических лимфоцитов in vitro или для проведения иммунотерапии in vivo.

Пример 4. Индукция цитотоксических лимфоцитов и определение их цитотоксической активности (ЦТА).

Лимфоциты, выделенные из периферической крови здоровых доноров, как было описано выше, суспендировали в культуральной среде. Для стимуляции лимфоцитов ДК отмывали фосфатно-солевым буфером и помещали в 24-луночные планшеты вместе с лимфоцитами при соотношении ДК: лимфоциты, равном 1:20, в 1 мл среды HyQ IMDM, содержащей 10% инактивированной эмбриональной бычьей сыворотки. На следующий день после начала стимуляции и далее 1 раз в 3 дня к культуре добавляли по 30 ед/мл человеческого рекомбинантного IL-2. Через 7 дней проводили вторичную стимуляцию культуры лимфоцитов с использованием размороженных ДК в таком же количестве, как и для первичной стимуляции. В качестве фидеров к культурам лимфоцитов после каждой стимуляции вносили сингенные лимфоциты (1 млн на лунку), инактивированные ультрафиолетовым облучением. Через 5 дней после вторичной стимуляции проводили определение ЦТА лимфоцитов в отношении опухолевых клеток-мишеней. Для этого в лунки 96-луночного планшета вносили суспензию лимфоцитов-эффекторов в количестве 12,5-100 тыс.клеток на лунку, а затем добавляли опухолевые клетки (5 тыс.клеток на лунку), предварительно помеченные 3Н-тимидином, так, чтобы соотношение (клетки-мишени): (клетки эффекторы) составляло 1:2.5-1:20. Через 24 ч инкубации определяли выживаемость опухолевых клеток и рассчитывали ЦТА лимфоцитов-эффекторов по формуле: ЦТА=(1-Рмишень+эффектор /Рмишень)·100%, где Рмишень Р мишень+эффектор - радиоактивность проб, в которых инкубировались только опухолевые клетки-мишени и эти же клетки вместе с клетками-эффекторами соответственно.

Пример 5. Результаты оценки ЦТА в отношении опухолевых клеток

Результаты исследования цитотоксической активности стимулированных лимфоцитов в отношении опухолевых клеток приведены на фигурах:

Фиг.1. Цитотоксическая активность лимфоцитов, стимулированных дендритными клетками, нагруженными смесями HSP 70 и антигенов MAGE или gp 100, в отношении клеток меланомы В 16 in vitro.

Фиг.2. Цитотоксическая активность лимфоцитов, стимулированных дендритными клетками, нагруженными смесями HSP 70 и пептидных фрагментов белков MAGE или gp 100, в отношении клеток меланомы В 16 in vitro.

Фиг.3. Цитотоксическая активность лимфоцитов, стимулированных дендритными клетками, нагруженными смесями HSP 70 и пептидов HER2/neu и EGFRvIII, в отношении клеток эпидермальной карциномы человека линии А431 in vitro.

В качестве опухолевых клеток-мишеней были выбраны клетки меланомы линии В 16 и клетки эпидермальной карциномы человека линии А431, в которых экспрессируются антигены MAGE и g 100 (клетки В 16) и HER2/neu и EGFR v III (клетки А431). Как видно из фиг.1-3, цитотоксические лимфоциты, полученные после совместного культивирования с дендритными клетками, нагруженными соответствующими вакцинными композициями, обладали более высокой цитотоксической активностью по сравнению с контрольными лимфоцитами, индуцированными интактными дендритными клетками, при всех исследованных соотношениях мишень: эффектор.

Пример 6. Сенситизация композитом антигенпредставляющих клеток - макрофагов и дендритных клеток (ДК).

ДК получают из лейкоконцентрата периферической крови здоровых доноров, как описано в примере 3. Макрофаги получают из мононуклеарных клеток, выделенных из периферической крови человека путем центрифугирования в градиенте Фиколла. Клетки высеиваются на культуральные чашки Петри, предварительно покрытые сывороткой человека, и инкубируются в течение 1 ч при 37°С. Затем неприкрепившиеся клетки удаляют, а к прикрепившимся добавляют охлажденный до +4°С фосфатно-солевой буфер, содержащий 1 мМ ЭДТА, и оставляют на 10-15 мин. Клетки собирают, отмывают и суспендируют в среде RPMI. Дальнейшее культивирование и сенситизацию клеток проводят как описано в примере 3.

Сенситизированные аутологичные антигенпредставляющие клетки могут быть внутривенно введены пациенту со злокачественным новообразованием. Одному пациенту может быть одномоментно введено от 106 до 1012 сенситизированных макрофагов. Для усиления эффекта могут также применяться различные иммуномодуляторы - IFN , IFN , TNF , IL-2, -4, -6 и др.

При введении представленных препаратов пациентам используют следующие фармацевтические носители: физиологический раствор или фосфатно-солевой раствор, приготовленный на воде для инъекций. рН растворов составляет около 7,4.

Пример 7. Иммунопрофилактика опухолевых патологий с помощью композита (на примере меланомы).

Для иммунизации композит, полученный, как описано в примере 2 и содержащий пептидный фрагмент MAGE-A1 (см. табл.1), вводили мышам линии С 57 В 1/6 внутрикожно. Через 7 дней после иммунизации мышам подкожно вводили суспензию опухолевых клеток меланомы линии В 16 в количестве 1·106 клеток/мышь. Такое количество прививаемых опухолевых клеток в 10 раз превышает дозу, обычно используемую в экспериментах по моделированию опухолей данной линии у мышей. Размеры развивающихся опухолей измеряли 3 раза в неделю. Эффективность вакцинации оценивали по замедлению роста опухолей у иммунизированных мышей по сравнению с контрольными (интактными) животными, а также по увеличению средней продолжительности жизни животных. На момент гибели контрольных животных средний объем опухолей у иммунизированных мышей составлял всего 53% от контроля, а продолжительность жизни иммунизированных животных увеличивалась на 59%. Сходные результаты были получены в результате иммунизации мышей композитом, содержащим другие пептиды по табл.1 (данные не приведены).

Пример 8. Иммунотерапия с помощью клеточного препарата в эксперименте на животных

Для индукции опухолей мышам линии С 57 В 1/6 подкожно (в правый бок) вводили суспензию опухолевых клеток меланомы линии В 16 (2·105 клеток/мышь). На 6-й день эксперимента опытным животным также подкожно (в левый бок) вводили суспензию дендритных клеток, выделенных из крови здоровых мышей и активированных композитом, содержащим смесь пептидов группы MAGE, как описано в примерах 3 и 6. Эффективность терапии оценивали по тем же показателям, что и в примере 7. На момент гибели контрольных животных средний объем опухолей у иммунизированных мышей составлял 42% от данного показателя у контрольных животных. Средняя продолжительность жизни иммунизированных животных увеличивалась на 67%.

Таким образом, разработан новый белковопептидный композит, который может быть использован как противоопухолевый препарат при онкологических патологиях, на его основе создан клеточный препарат за счет активизации клеток-лейкоцитов новым композитом, состоящим из белка теплового шока и опухолеспецифичного пептида. Подобные препараты отличаются безопасностью и высокой эффективностью терапевтического действия, заключающегося в подавлении опухолевого роста и усилении иммунного ответа организма. На основе композита и клеточного препарата разработан способ профилактики, а также лечения онкологических патологий с высоким иммунногенным эффектом и цитотоксическим действием в отношении опухолевых клеток.

ЛИТЕРАТУРА

1. Barrios С.et al., Eur. J. Immunol. 22: 1365-1372, 1992.

2. Roman E. and Moreno C., Immunol. 88:487-492, 1996.

3. Barker C.F. and Billingham R.E., Adv. Immunol. 25: 1-54, 1977.

4. Tomita Y. et al, J. Urol. 149: 659-663, 1993.

5. Adema G.J. et al., Am. J. Pathol. 143: 1579-1585, 1993.

6. Schaumburg-Lever G. et al., J. Cutan. Pathol. 18: 432-435, 1991.

7. Vennegoor С.et al., Am. J. Pathol. 130: 179-192, 1988.

8. Cox A.L. et al., Science 264: 716-719, 1994.

9. Peoples G.E. et al., J. Immunol. 151: 5481, 1993.

10. Yoshino I. et al., J. Immunol. 152: 2393, 1994.

11. Wikstrand C.J. et al., Cancer Res. 55: 3140-3148, 1995.

12. Moscatello D.K. et al., Cancer Res. 55: 5536-5539, 1995.

13. Garcia de Palazzo I.E. et al., Cancer Res. 53: 3217-3220, 1993.

14. Moscatello D.K. et al., Cancer Res. 55: 5536-5539, 1995.

15. Thurner В. et al., J. Immunol. Meth. 223: 1-15, 1999.




ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


1. Белковопептидный противоопухолевый композит, содержащий белок теплового шока семейства HSP 70 и нековалентно связанный с ним опухолеспецифический пептид, выбранный из группы: MAGE-A1, -А2, -A3, gp 100, HER2/neu, EGFRvIII или фрагмент любого из них, при этом нековалентная связь обеспечена предварительным инкубированием компонентов в физиологических условиях с участием аденозинфосфатного производного, а белок и пептид взяты в молярном соотношении 1:1.

2. Композит по п.1, отличающийся тем, что в качестве белка теплового шока семейства HSP 70 содержит белок, выбранный из группы: DnaK из М.tuberculosis, M.bovis или Е.coli, или белок HSP 70 человека.

3. Композит по п.1, отличающийся тем, что в качестве фрагмента опухолеспецифического пептида содержит таковой в соответствии с таблицей 1.

4. Композит по п.1, отличающийся тем, что он дополнительно содержит иммуномодулятор, выбранный из группы: INF , INF , TNF , IL-2, -4, -6 или их комбинацию.

5. Композит по п.1 или 4, отличающийся тем, что дополнительно может содержать пригодный фармацевтический носитель.

6. Противоопухолевый клеточный препарат, представляющий собой выделенные и промытые дендритные мононуклеарные аутологичные клетки или таковые от здорового донора, активированные инкубированием с белковопептидным композитом, охарактеризованным в пп.1-3.

7. Способ иммунотерапии или иммунопрофилактики опухолей путем введения в организм препарата белкового происхождения, отличающийся тем, что в организм парентерально вводят композит, охарактеризованный в пп.1-5, или клеточный препарат, охарактеризованный в п.6, в эффективном количестве.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что компоненты композита предварительно смешивают и инкубируют ex temporae в физиологических условиях.