СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ОСНОВНОГО БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА 70 КДА

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ОСНОВНОГО БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА 70 КДА


RU (11) 2242764 (13) C1

(51) 7 G01N33/53 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 29.08.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2004.12.20 
(21) Регистрационный номер заявки: 2003124736/15 
(22) Дата подачи заявки: 2003.08.07 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2003.08.07 
(45) Опубликовано: 2004.12.20 
(56) Аналоги изобретения: POCKLEY A.G. et al. Detection of heat shock protein 70 (Hsp70) and anti-Hsp70 antibodies in the serum of normal individuals // Immunol Invest. - 1998, №27(6), р. 367-377.

DE 10017249 A, 11.10.2001.

US 5447843 A, 05.09.1995.

US 5188964 A, 23.02.1993.

ГУЖОВА И.В., ЛАСУНСКАЯ Е.Б. и др. Влияние теплового шока на процессы дифференцировки и апоптоза в клетках U-937 // Цитология. - 2000, №7, с.653-658.

MARGULIS B.A., WELSH M. Isolation of hsp70-binding proteins from bovine muscle // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1991, №178(1), р.1-7, abstr. 
(72) Имя изобретателя: Новоселов С.С. (RU); Суржиков С.А. (RU); Воронин А.П. (RU); Гужова И.В. (RU); Маргулис Б.А. (RU) 
(73) Имя патентообладателя: Институт цитологии Российской академии наук (статус государственного учреждения) (RU) 
(98) Адрес для переписки: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр-т, 4, Институт цитологии РАН 

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ОСНОВНОГО БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА 70 КДА
Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике. Сущность способа заключается в иммобилизации агента, взаимодействующего с БТШ70 на поверхности лунок 96-луночного планшета для иммуноферментного анализа, промывке лунок буфером, внесении в лунки исследуемого образца или стандарта и инкубации, промывке лунок, внесении в лунки поликлональных кроличьих антител к БТШ70 и инкубации, промывке лунок, внесении в лунки антител, взаимодействующих с кроличьими антителами, коньюгированных с ферментом и инкубации, промывке лунок, внесении в лунки субстрата фермента и хромогена, инкубации, спектрофотометрической оценке развившейся окраски и соотнесения ее с данными калибровки. В качестве иммобилизованного агента, взаимодействующего с БТШ70, используют производное АТФ, ковалентно связанное в комплексе с ГМДА с яичным альбумином. К образцам и стандартам добавляют натриевую соль АТФ до 10 мМ, а также вносят в буфер ионы магния до конечной концентрации 10 мМ на всех этапах. Способ обладает высокой чувствительностью и точностью определения. 3 ил.






ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Изобретение относится к области биологии и медицины, а также экологии, и может быть применимо для выявления и количественного определения основного белка теплового шока 70 кДа (БТШ70) в образцах тканей животных и человека и биологических жидкостях организма. 

Известен способ определения концентрации БТШ70 [1], заключающийся в проведении иммуноферментного анализа на 96-луночных планшетах путем иммобилизации поликлональных кроличьих антител к БТШ70 с последующей промывкой лунок и внесении в них исследуемого образца с добавлением очищенного и биотинилированного БТШ70, инкубации, следующей отмывкой и внесением авидина, коньюгированного с ферментом - пероксидазой хрена, инкубации и внесении после очередной промывки субстрата пероксидазы хрена - перекиси водорода и хромогена. Развивающаяся окраска оценивается спектрофотометрически. Интенсивность окраски обратно пропорциональна количеству небиотинилированного БТШ70 в пробе. Чувствительность метода составляет всего 40 нг/мл. 

Наиболее близким к заявляемому является способ [2], в котором определение концентрации БТШ70 производится посредством иммуноферментного анализа на 96-луночных планшетах путем взаимодействия иммобилизованных моноклональных антител к БТШ70 с антигеном, содержащимся во внесенной в лунку пробе за время инкубации, последующей промывке лунок, узнаванием захваченного антигена распознающими кроличьими поликлональными антителами, вносимыми в лунки, промывке лунок, внесении в них третьих антител, коньюгированных с ферментом. 

Внесение в лунки субстрата фермента и хромогена обеспечивает количественную оценку антигена в пробе благодаря развитию цветной окраски, пропорциональной количеству связанного БТШ70. Интенсивность окраски оценивается спектрофотометрически и сравнивается с калибровочной кривой. Чувствительность метода также невысока и составляет 20 нг/мл. Кроме того, данный способ требует пары антител, взаимодействующих с различными частями молекулы БТШ70. Получение такой пары трудоемко в силу особенностей данного белка.

Задачей предлагаемого способа является определение концентрации БТШ70 в образцах тканей животных и человека и биологических жидкостях организма с повышенной чувствительностью и исключение необходимости получения второго антитела к молекуле БТШ70 благодаря использованию свойства БТШ70 высокоспецифично взаимодействовать с иммобилизованным аденозинтрифосфатом (АТФ).

Поставленная цель достигается тем, что на поверхности лунок 96-луночного планшета для иммуноферментного анализа иммобилизуются комплексы 8-(6-аминогексил)-амино-аденозин-5’-трифосфата (ГМДА-АТФ) (фиг.1), полученного по известной методике [3], коньюгированного с молекулами яичного альбумина (фиг.2), лунки промываются буфером, в них вносят исследуемый образец или стандарт, в который добавлена натриевая соль АТФ до концентрации 10 мМ, и содержимое инкубируется, лунки промываются, в лунки вносятся поликлональные кроличьи антитела к БТШ70 и производится инкубация, лунки промываются, в них вносят антитела, взаимодействующие с кроличьими антителами, коньюгированные с ферментом, и содержимое инкубируется, лунки промываются, в них вносят субстрат фермента и хромоген, содержимое инкубируют и производят спектрофотометрическую оценку развившейся окраски с последующим соотнесением ее с данными калибровки.

Признаками, отличающими изобретение от прототипа, являются замена иммобилизованных в лунках 96-луночной платы антител к БТШ70 на производное АТФ, имеющее более высокую афинность к БТШ70, добавление к образцу натриевой соли АТФ до 10 мМ, вызывающее диссоциацию комплексов БТШ70 с другими белками, в том числе с другими молекулами БТШ70, и, таким образом, демаскирование его антигенных детерминант, способствующее более полному взаимодействию БТШ70 с распознающими кроличьими поликлональными антителами, а также внесение в буфер ионов магния до конечной концентрации 10 мМ на всех этапах, что необходимо для взаимодействия БТШ70 с АТФ.

Графические материалы.

1) структурная формула ГМДА-АТФ (фиг.1);

2) конъюгация ГМДА-АТФ с яичным альбумином (фиг.2);

3) схематическое изображение последовательно взаимодействующих элементов комплекса (фиг.3).

Способ осуществляют следующим образом. ГМДА-АТФ (фиг.1), полученный по известной методике [3], ковалентно присоединяется к молекулам яичного альбумина посредством гетеро-бифункционального линкера сукцинимидил-4(р-малеимидофенил)-бутират (SMPB), позволяющего связать аминогруппу ГМДА-АТФ с сульфогруппой молекул цистеина, входящего в состав яичного альбумина (фиг.2). Готовят раствор полученных комплексов в буфере Трис НСl рН 7.5, содержащем 140 мМ хлорида натрия с конечной концентрацией яичного альбумина 10 мкг/мл. В лунки 96-луночного планшета для иммуноферментного анализа вносят по 100 мкл раствора. За время 60-минутной инкубации при 37°C происходит иммобилизация молекул белка с присоединенными к ним молекулами производного АТФ на поверхности лунок. Далее выполняется трехкратная промывка лунок 300 мкл буфера, содержащего 0,2% детергента Твин-20. Этот же буфер с 0,2% детергента Твин-20, 140 мМ хлорида натрия и 10 мМ хлорида магния используется на всех последующих этапах. Готовят разведения очищенного БТШ70 для построения в дальнейшем калибровочной кривой. Концентрация БТШ70 в разведениях составляет 1 мкг/мл, 250 нг/мл, 50 нг/мл, 5 нг/мл, 1 нг/мл, 500 пг/мл и 250 пг/мл. В первую лунку вносится 100 мкл буферного раствора, не содержащего БТШ70, в качестве отрицательного контроля. Все стандартные разведения наносятся в две лунки каждое для контроля воспроизводимости результата. В остальные лунки вносятся исследуемые образцы. В лунки на этом этапе вносится также натриевая соль АТФ до конечной концентрации 10 мМ. После часовой инкубации, производимой на орбитальном встряхивателе при комнатной температуре, производится трехкратная промывка лунок 300 мкл буфера. Следующим реактивом, помещаемым в лунки, являются 100 мкл раствора поликлональных кроличьих антител против БТШ70. Часовая инкубация при комнатной температуре завершается промывкой, после чего в лунки вносится раствор вторых антител, направленных против кроличьих и коньюгированных с ферментом - пероксидазой хрена. После часовой инкубации при комнатной температуре производится промывка лунок и в них вносится по 100 мкл субстрата пероксидазы хрена - перекиси водорода, и хромогена - ортофенилендиамина, в цитратном буфере с рН 4,5. После 30-минутной инкубации ферментативная реакция останавливается добавлением 50 мкл 0,19 М серной кислоты в каждую лунку. Интенсивность окраски определяется спектрофотометрически с помощью ридера 96-луночных планшетов на длине волны 450 нм. По величине поглощения для известных концентраций БТШ70, очищенный препарат которого вносился в лунки одновременно с исследуемыми образцами, строится калибровочная кривая. Искомая концентрация БТШ70 в исследуемых образцах определяется с использованием этой кривой. Схематическое изображение последовательно взаимодействующих элементов комплекса представлено на фиг.3. Техническим результатом изобретения является обеспечение возможности количественной оценки БТШ70 в образцах тканей животных и человека и биологических жидкостях организма с чувствительностью на порядок более высокой - до 250 пг/мл, при этом использование производного АТФ в качестве агента, связывающего БТШ70, позволяет исключить необходимость поиска дополнительного антитела к альтернативному участку молекулы БТШ70. Кроме того, применение антител к другим известным белкам, способным узнавать АТФ, может резко раздвинуть рамки применения предлагаемого способа.

Источники информации

1. Margulis В.A., Nacharov P.V., Tsvetkova O.I., Welsh M., Kinev A.V. The Characterization and Use of Different Antibodies Against the Hsp70 Major Heat Shock Protein Family for the Development of an Immunoassay. Electrophoresis. 1991, Sep., 12 (9), p.670-673.

2. Pockley A.G., Shepherd J, Corton J.M. Detection of Heat Shock Protein 70 (Hsp70) and Anti-Hsp70 Antibodies in the Serum of Normal Individuals. Immunol. Investig. 1998, 27, p.367-377.

3. Lee C.Y., Lappi D.A., Wermuth В., Everse J., Kaplan N.O. 8-(6-Aminohexyl)-Amino-Adenine Nucleotide Derivatives for Affinity Chromatography. Archives of Biochemistry and Biophysics. 1974, 163, p.561-569.




ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


Способ определения концентрации основного белка теплового шока 70 кДа (БТШ70), заключающийся в иммобилизации агента, взаимодействующего с БТШ70 на поверхности лунок 96-луночного планшета для иммуноферментного анализа, промывке лунок буфером, внесении в лунки исследуемого образца или стандарта и инкубации, промывке лунок, внесении в лунки поликлональных кроличьих антител к БТШ70 и инкубации, промывке лунок, внесении в лунки антител, взаимодействующих с кроличьими антителами, конъюгированных с ферментом и инкубации, промывке лунок, внесении в лунки субстрата фермента и хромогена, инкубации, спектрофотометрической оценке развившейся окраски и соотнесения ее с данными калибровки, отличающийся тем, что в качестве иммобилизованного агента, взаимодействующего с БТШ70, используют производное АТФ, ковалентно связанное в комплексе с ГМДА с яичным альбумином, к образцам и стандартам добавляют натриевую соль АТФ до 10 мМ, а также вносят в буфер ионы магния до конечной концентрации 10 мМ на всех этапах.