ВАКЦИНА ПРОТИВ ВИРУСА ГРИППА И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ

ВАКЦИНА ПРОТИВ ВИРУСА ГРИППА И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ


RU (11) 2164148 (13) C1

(51) 7 A61K39/145, A61K39/385 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 29.08.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2001.03.20 
(21) Регистрационный номер заявки: 2000120902/14 
(22) Дата подачи заявки: 2000.08.09 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2000.08.09 
(43) Дата публикации заявки: 2001.03.20 
(45) Опубликовано: 2001.03.20 
(56) Аналоги изобретения: RU 1580617 A1, 10.02.1997. US 5612037 A, 18.03.1997. EP 0176493 A1, 02.04.1986. WO 97/07818 A1, 06.03.1997. EP 0721782 A3, 16.04.1997. WO 94/19013 A1, 01.09.1994. WO 95/02416 A1, 26.01.1995. WO 96/03145 A1, 08.02.1996. 
(71) Имя заявителя: Петров Рэм Викторович; Хаитов Рахим Мусаевич; Некрасов Аркадий Васильевич; Пучкова Наталья Григорьевна; Иванова Альберта Сергеевна 
(72) Имя изобретателя: Петров Р.В.; Хаитов Р.М.; Некрасов А.В.; Пучкова Н.Г.; Иванова А.С. 
(73) Имя патентообладателя: Петров Рэм Викторович; Хаитов Рахим Мусаевич; Некрасов Аркадий Васильевич; Пучкова Наталья Григорьевна; Иванова Альберта Сергеевна 
(98) Адрес для переписки: 127490, Москва, ул. Мусоргского, д.1, кв.287, Ивановой Т.П. 

(54) ВАКЦИНА ПРОТИВ ВИРУСА ГРИППА И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и применяется для профилактики гриппа и острых респираторных вирусных заболеваний. Сущность изобретения: вакцина против вируса гриппа в виде соединения полимерного носителя с вакцинными антигенами вируса гриппа, в которой соотношение антиген-носитель составляет 1:5-30, а в качестве полимерного носителя используют производные гетероцепных полиаминов с мол.м. 5000-150000 Д. Способ получения вакцины против вируса гриппа путем взаимодействия вакцинных антигенов вируса гриппа с производными гетероцепных полиаминов азидным методом или посредством реакции комплексообразования. Преимущество изобретения заключается в получении безопасной вакцины против вируса гриппа, превосходящей все существующие гриппозные вакцины за счет повышения стабильности и иммуногенности антигенов, позволяющую снизить вакцинирующую дозу препарата в 3-5 раз. Изобретение позволяет также повысить технологичность процесса получения вакцины против вируса гриппа, улучшить экологические условия его проведения, увеличить выход и повысить качество препарата. 3 с. и 8 з.п.ф-лы, 4 табл. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в иммунологии, в частности, для профилактики гриппа и острых респираторных вирусных заболеваний.

Наиболее применяемые при гриппозных вакцинациях живые аттенуированные или инактивированные гриппозные вакцины (1), представляя собой цельновирионные препараты, являются достаточно реактогенными и небезопасными для массовой вакцинопрофилактики. Известные препараты субъединичных вакцин менее реактогенны, но и менее эффективны, поэтому для достижения необходимого иммунного ответа требуют, как минимум двукратного, с интервалом 2-3 недели введения достаточно больших доз, что значительно затрудняет выполнение программ массовой вакцинации против гриппа. Для повышения антигенной активности субъединичные вакцины готовят с добавлением сорбентов или интактных вирионов, что также отрицательно влияет на выполнение условий безопасности и реактогенности препарата.

Наиболее близкой из известных вакцин к описываемой является вакцина против вируса гриппа (2), включающая соединение полимерного носителя с вакцинными антигенами вируса гриппа.

Однако вакцинные белки в известной вакцине, привитые на полимерный носитель с низкой молекулярной массой, недостаточно стабильны при применении и хранении препарата, а потому известная вакцина не всегда удовлетворяет жестким требованиям к срокам годности даже при выполнении особых условий, ее хранения. Известная вакцина обладает также относительно низкой иммуногенной активностью и для получения необходимого иммунного ответа требует введения достаточно высоких доз препарата.

Кроме того, указанный полимерный носитель с низкой молекулярной массой не может образовывать с вакцинными антигенами устойчивых в физиологических условиях электростатических комплексов, а потому исключается возможность использования несложных, безопасных и экономичных технологий комплексообразования для производства вакцины против вируса гриппа.

Известен способ получения вакцины против вируса гриппа (2) путем взаимодействия вакцинных антигенов вирусы гриппа с полимерным носителем. Использование токсичного сукцинимидного эфира в известном способе создает экологически неблагоприятные условия его осуществления и требует специальных мер по проведению тонкой очистки, что усложняет технологию производства вакцины, повышает требования к условиям труда и технике безопасности. Недостаточная технологичность известного способа получения вакцины против вируса гриппа сопровождается значительным расходом материальных и трудовых ресурсов, в то же время выход целевого продукта не превышает 20-30%. При этом, известный способ получения вакцины против вируса гриппа не обеспечивает оперативного и объективного контроля на всех этапах производства вакцины, что отрицательно сказывается на воспроизводимости параметров препарата.

Таким образом, технический результат, получаемый при реализации описываемого изобретения, заключается в создании безопасной для населения всех возрастных категорий вакцины против вируса гриппа, повышение ее профилактической эффективности при значительном снижении вакцинирующей дозы препарата, а также повышение технологичности процесса получения вакцины, расширение технологических возможностей за счет использования новых методов образования соединений полимерного носителя с вакцинными антигенами, снижение требований к технике безопасности и экологическим условиям производства, повышение качества препарата.

Указанный технический результат достигается тем, что в вакцине против вируса гриппа, включающей соединение полимерного носителя с вакцинными антигенами вируса гриппа, в качестве полимерного носителя используют производные гетероцепных полиаминов с молекулярной массой 50000-150000 Д, при этом соединение имеет соотношение антиген-носитель 1:5-30 и общую формулу



где R - протективные антигены вируса гриппа;

n = 400-1000 - количество элементарных звеньев,

q = (0,2-0,4)п - количество алкилированных звеньев,

z = (0,4-0,8)п - количество окисленных звеньев,

x = 2 или 4; у = 1 или 2; А=CH или N.

В качестве производных гетероцепных полиаминов могут быть использованы, например, сополимер N-oкиcи -1,4-этилeнпипepaзинa и (N-карбоксиэтил)-1,4-этиленпиперазиний бромида с общей формулой



либо сополимер N-окиси-1,2-этиленпиперидина и (N-карбоксиэтил)-1,2-этиленпипередина бромида с общей формулой



В качестве вакцинных антигенов вируса гриппа целесообразно использовать поверхностные белки вируса гриппа гемагглютинин (ГА) и нейраминидазу (НА).

В качестве вакцинных антигенов вируса гриппа применимы также внутренние белки вируса гриппа матриксный белок (М-белок) и нуклеопротеид (НП-белок).

В качестве протективных антигенов вируса гриппа может быть использована смесь поверхностных и внутренних белков вируса гриппа

Указанный технический результат достигается также тем, что в способе получения вакцины против вируса гриппа, включающем взаимодействие вакцинных антигенов вируса гриппа с полимерным носителем, в качестве полимерного носителя используют производные гетероцепных полиаминов с молекулярной массой 50000-150000 Д, а его взаимодействие с вакцинными антигенами вируса гриппа осуществляют азидным методом при весовом соотношении антиген-носитель 1:5-30.

Целесообразно производные гетероцепных полиаминов предварительно активировать путем введения гидразидных групп.

Упомянутый выше технический результат достигается также тем, что в способе получения вакцины против вируса гриппа, включающем взаимодействие вакцинных антигенов вируса гриппа с полимерным носителем, в качестве полимерного носителя используют производные гетероцепных полиаминов с молекулярной массой 50000-150000 Д, а его взаимодействие с вакцинными антигенами осуществляют посредством реакции комплексообразования при соотношении антиген-носитель 1:5-30.

При этом реакцию комплексообразования предпочтительно проводить между противоположно заряженными макромолекулами производных гетероцепных полиаминов и вакцинных антигенов вируса гриппа.

В случае использования в качестве производных гетероцепных полиаминов сополимера N-окиси 1,4-этиленпиперазина и (N-карбоксилэтил)-1,4-этиленпиперазиний бромида, а в качестве вакцинных антигенов - поверхностных белков вируса гриппа реакцию комплексообразования осуществляют в условиях фосфатного буферы с pH = 5,8 при температуре 2-4oC.

Таким образом, описываемая вакцина против вируса гриппа представляет собой либо конъюгат с прочной ковалентной связью между вакцинными антигенами вируса гриппа и водорастворимыми производными гетероцепных полиаминов, либо комплексный препарат с устойчивой электростатической связью между этими компонентами.

Вакцина против вируса гриппа является высокомолекулярным соединением с молекулярной массой порядка 1-3 млн Дальтон и размером молекулы в диаметре 50-80 нм и имеет изоэлектрическую точку 7,25.

Традиционно в гриппозных вакцинах используются поверхностные антигены вируса гриппа гемагглютинин (ГА) с молекулярной массой 77000 Д и нейраминидаза (НА) с молекулярной массой 220000 Д, которые представляют собой поверхностные белки (субъединицы суперкапсида) вириона и имеют изоэлектрические точки, соответственно, 6,9 и 7,1. Эти антигены отвечают за процесс формирования антительного иммунного ответа и обеспечивают защиту против заражения гомологичным вирусом, поскольку антитела к ГА обладают вируснейтрализующей активностью.

Используемые для получения описываемой вакцины внутренние антигены вируса гриппа (субъединицы нуклеокапсида) - нуклеопротеид (НП-белок) с молекулярной массой 170000 Д и изоэлектрической точкой 6,5 и матриксный (или М-белок) с молекулярной массой 64000 Д и изоэлектрической точкой 6,8 - также играют важную роль в инфекционном процессе. Установлено, что у переболевших гриппом или привитых от него цельновирионными вакцинами вырабатываются антитела как к поверхностным антигенам ГА и НА, так и к внутренним М-белкам и НП-белкам.

Для выделения вакцинных антигенов из вируса соответствующего штамма используют технологии с применением неионных детергентов. Вирусы гриппа выращивают в аллантоисной полости 10-дневных куриных эмбрионов, очищают и концентрируют в ступенчатом градиенте плотности сахарозы.

Производные гетероцепных полиаминов с молекулярной массой 50000-150000 Д представляют собой водорастворимые, нетоксичные, вполне биогенные соединения, обладающие выраженными иммунностимулирующими свойствами.

Получение водорастворимых производных гетероцепных полиаминов осуществляют путем синтеза гетероцепных полиаминов методом "живой" катионной полимеризации с последующим их окислением и алкилированием. Полученные таким образом вещества обладают собственной физиологической и фармакологической активностями.

Модификация вакцинных антигенов указанным высокомолекулярным водорастворимым носителем-иммуностимулятором позволяет усилить иммуногенную активность субъединиц. За счет образованных устойчивых ковалентных или электростатических (в зависимости от поставленной задачи и способа получения соединения) связей описанных производных гетероцепных полиаминов с вакцинными антигенами вируса гриппа обеспечивается высокая стабильность последних и усиление их иммуногенности, что позволяет снизить прививочную дозу антигенов. При этом, имеет место более эффективное формирование иммунологической памяти к антигенам вируса гриппа. Одновременно повышаются защитные свойства организма к другим инфекциям, а следовательно, повышение общей профилактической эффективности вакцины. Кроме того, использование нетоксичного водорастворимого носителя способствует безопасности вакцины, делая пригодным ее применение для вакцинации детей с 6-ти месячного возраста.

Способ получения вакцины против вируса гриппа на основе конъюгата производных гетероцепных полиаминов с протективными антигенами вируса гриппа осуществляют следующим образом.

В описании возможности осуществления способов получения вакцины против вируса гриппа по настоящему изобретению для определенности в качестве исходного производного гетероцепного полиамина выбран выпускаемый промышленностью "полиоксидоний" - сополимер N-окиси-1,4-этиленпиперазина и (N-карбоксиэтил)-1,4- этиленпиперазиний бромида (СПЛ).

Предварительно получают активированную форму производного гетероцепного полиамина СПЛ, с этой целью исходный СПЛ модифицируют гидразин гидратом.

Полученный после активации гидразид СПЛ смешивают с протективными антигенами вируса гриппа в соотношении 10-30:1 и проводят реакцию их взаимодействия азидным методом, в результате чего происходит ковалентное связывание вакцинных антигенов вируса гриппа с высокомолекулярным синтетическим носителем с образованием устойчивой ковалентной амидной связи между карбоксильной группой полимерного носителя и первичной аминогруппой лизинового остатка молекул белков.

Описываемый синтез проводится в строго контролируемых условиях и дает возможность получать препараты с заранее заданной структурой и соотношением белок-полимер. Использование азидного метода при тщательном соблюдении условий реакции позволяет полностью избежать межмолекулярных и внутримолекулярных сшивок, сохранить активные центры и получать целевой продукт с высоким выходом и качеством.

Способ получения вакцины против вируса гриппа на основе комплексного соединения высокомолекулярного полимерного носителя из класса водорастворимых производных гетероцепных полиаминов с протективными антигенами вируса гриппа осуществляют следующим образом.

СПЛ растворяют в фосфатном буфере при pH 5,8. К полученному раствору добавляют раствор вакцинных антигенов вируса гриппа в том же буфере. В зависимости от выбора конкретных производных гетероцепных полиаминов и протективных антигенов, вступающих в реакцию прочность комплекса варьирует. При этом выбирают допустимо высокие соотношения компонентов в растворах для образования прочных электростатических связей. Реакцию комплексообразования проводят медленным добавлением раствора белка к раствору полимера в соотношениях антиген-носитель 1:5-30. При указанном значении pH макромолекулы полимерного носителя СПЛ и поверхностных антигенов вируса гриппа заряжены противоположно и в результате описываемой реакции образуют устойчивую электростатичекую связь.

Выделение препаратов осуществляют хроматографическимческим методом.

Анализ состава полученных соединений и их специфических свойств с использованием таких методик, как SDS-электрофореэ в ПААГ, электронная и флуоресцентная микроскопия, методы кругового дихроизма, позволил количественно оценить степень связывания белка с носителем, определить локализацию связи и подтвердить конформационную стабильность белка в составе конъюгата.

Оценка иммуногенных и протективных свойств полученных соединений проводилась путем исследования реакции иммунной системы и организма в целом на экспериментальных животных, а также путем испытания вакцины на добровольцах.

Проведенные исследования показали, что полученная в соответствии с описываемым изобретением вакцина против вируса гриппа в виде коньюгированиого или комплексного препарата обладает следующими преимуществами:

- иммуногенная активность в 10 раз выше по сравнению с субъединичными вакцинами,

- оптимум pH активности равен 7,25, что является близким к значениям pH физиологических жидкостей и обеспечивает высокую биодоступность,

- полностью безопасен в применении, поскольку используются только высокоочищенные вакцинные антигены вируса гриппа, а вакцинирующая доза по белкам в 3-5 раз ниже по сравнению с 11 традиционными вакцинами,

- вакцина эффективна при однократной иммунизации в течение всего эпидемиологического сезона,

- стабильность вакцинных антигенов в составе конъюгированного или комплексного препарата более чем в 100 раз превышает стабильность нативных белков,

- полимерные носители на основе высокомолекулярных водорастворимых производных гетероцепных полиаминов обладают выраженной собственной иммуностимулирующей активностью, благодаря чему достигается резкое повышение иммуногенности и профилактической эффективности вакцины.

Исследования на добровольцах проводили в период сезонного подъема заболеваемости гриппом и ОРЭ при однократной вакцинации. Из анализа заболеваемости гриппом и ОРЗ у взрослых очевидно, что в группе внешнего контроля показатель заболеваемости гриппом (92,3 на тысячу наблюдений) существенно выше по сравнению с группой привитых вакциной по описываемому изобретению (26,7 на тысячу привитых) и группой внутреннего контроля (36 на тысячу наблюдений). Была проведена серологическая расшифровка этиологического диагноза гриппа.

Установленные по материалам эпидоопыта показатели позволили определить по соответствующим формулам наиболее важные характеристики препарата, как вакцины, а именно:

- индекс эффективности равен 3,4,

- коэффициент профилактической эффективности - 77%,

- при наличии 50% иммунной прослойки в коллективе коэффициент противоэпидемической защиты составляет 68%.

Ниже представлены примеры реализации описываемого изобретения, где в примерах 1-12 показаны конкретные варианты осуществления способов получения вакцины против вируса гриппа, а в примерах 13-16 приведена экспериментальная оценка эффективности препаратов, полученных в примерах 1-12. Результаты оценки эффективности препаратов отражены в таблицах 1-4.

Пример 1. Получение вакцины на основе конъюгата СПЛ с поверхностными белками вируса гриппа ГА и НА посредством азидного метода конъюгации.

Первая стадия - синтез активированной формы носителя - гидразида СПЛ.

500 мг СПЛ (n=700; q=02; z=0,8, ММ 80000; ММР 1,33) растворяют в 25 мл метилового спирта. При температуре 20oC добавляют 0,2 мл (210-3) гидразин-гидрата. Реакцию ведут в течение 24 часов, после чего отгоняют метанол на роторном испарителе, остаток растворяют в воде и проводят эфирную экстракцию. Готовый продукт выделяют методом ультрафильтрации с использованием мембран фирмы "Миллипор" с последующей лиофилизацией.

Содержание гидразидных групп определяют стандартным методом титрования первичных аминогрупп - 2,4,6-тринитробензолсульфокислотой. Содержание гидразидных групп составляет 10-15%.

Вторая стадия - получение конъюгата по реакции конденсации гидразида СПЛ с ГА и НА.

100 мг гидразида СПЛ растворяют в 4 мл 1N HCl. Раствор охлаждают до 0-2oC. Затем при перемешивании и охлаждении добавляют 1,15 мл 3-х процентного раствора нитрита натрия. Через 15 минут доводят pH раствора до 8,5 добавлением 2N NaOH.

Раствор 20 мг смеси белков ГА и НА (соотношение 95:5) в 10 л 0,05 М фосфатного буфера при pH 8,5 добавляют к раствору гидразида СПЛ. Поддерживают pH реакционной смеси равным 8,5 добавлением 2N NaOH. Реакцию проводят в течение 12 часов при перемешивании и охлаждении до 0-2oC. Для выделения и очистки конъюгата реакционную смесь наносят на колонку (2,6х90), заполненную Сефадекс Г-100, в качестве элюента используют фосфатный буфер 0,05М pH 7,5, содержащий 0,05м NaCI. Выход конъюгата контролируют с помощью проточного спектрофотометра при = 226 нм. Определение содержания антигенов и анализ конъюгата проводят методами флуоресцентной спектроскопии и электрофореза в ПААГ. Мольный состав конъюгата белки-СПЛ составляет 1:5. Выход конъюгата 97%.

Состав сополимера определяют методами ЯМР-спектроскопии, ИК-спектроскопии, молекулярную массу и молекулярно-массовое распределение устанавливают методом малоуглового лазерного светорассеяния.

Пример 2. Получение вакцины на основе комплекса СПЛ с поверхностными белками вируса гриппа ГА и НА.

100 мг СПЛ (n=1000; q=0,4; z=0,4; MM 145000; ММР 1,7) растворяют в 10 мл 0,05М фосфатного буфера pH=5,8. При температуре 2-4oC добавляют 10 мг раствор смеси ГА и НА (соотношение 95:5) в 2 мл того же буфера. При данном значении pH макромолекулы полимерного носителя и антигенов заряжены противоположно. Реакцию комплексообразования проводят медленным введением раствора антигенов к раствору полимера, не допуская выпадения осадка. Реакционную смесь выдерживают при температуре 2-4oC в течение 24 часов. По окончании реакции доводят pH раствора до значения 7,1 добавлением раствора гидроксида натрия. Мольное соотношение комплекса белки-СПЛ составляет 1:10. Выход целевого продукта 96%. Определение содержания белка и анализ соединения проводят методами флуоресцентной спектроскопии и электрофореза в ПААГ.

Пример 3. Процесс осуществляют аналогично примеру 1, при этом, в качестве носителя антигенов используют СПЛ с характеристиками:

n=400, q=0,3; z=0,7; MM 60000, ММР 1,1, а в качестве вакцинных антигенов вируса гриппа используют внутренние белки вируса гриппа М-белок и НП-белок. Мольное соотношение белок- СПЛ составляет 1:6. Анализ белка в конъюгате проводят по методу Лоури.

Пример 4. Процесс осуществляют аналогично примеру 1, при этом, в качестве носителя используют СПЛ с характеристиками:

n=800; q=0,35; z=0,65; MM 100000, ММР 1,6, а в качестве вакцинных антигенов - смесь поверхностных ГА и НА белков и внутренних М-белка и НП-белка вируса гриппа. Мольное, соотношение белок-СПЛ составляет 1:5. Определение содержания белка проводят по методу Бредфорда.

Пример 5. Процесс проводят аналогично примеру 2, при этом, используют в качестве носителя СПЛ с характеристиками:

n= 540; q=0,25; z=0,75; MM 78000, ММР 1,8, а в качестве вакцинных антигенов - внутренние белки вируса грипа М-белок и НП-белок. Мольное соотношение белки-СПЛ составляет 1:30. Анализ содержания белка в препарате проводили по методу Бредфорда

Пример 6. Процесс проводят аналогично примеру 2, при этом, используют в качестве носителя СПЛ с характеристиками:

n=900; q=0,3; z=0,7; ММ 135000;, ММР 1,7, а качестве вакцинных антигенов - смесь поверхностных ГА и НА белков и внутренних М-белка и НП-белка вируса гриппа. Мольное соотношение белки-СПЛ составляет 1:25.

Пример 7. Процесс осуществляют аналогично примеру 1, при этом, в качестве носителя вакцинных антигенов вируса гриппа используют сополимер N-окиси 1,2-этиленпиперидина и (N-карбоксиэтил)-1,2-этиленпиперидиний бромида (СПЛ-А) с характеристиками:

n= 1000; q=0,4; z=0,4, MM 145000; MMP 1,7, а в качестве вакцинных антигенов используют ГА и НА. Соотношение антиген-носитель составляет 1:10. Анализ белка проводили по методу Лоури.

Пример 8. Процесс проводят аналогично примеру 1, при этом, используют в качестве носителя СПЛ-А с характеристиками:

n=400: q=0,3: z=0,7: MM 60000, MMP 1,1, а в качестве вакцинных антигенов - внутренние белки вируса гриппа матриксный М-белок и НП-белок. Мольное соотношение антиген-носитель составляет 1:8. Анализ белка проводят по методу Лоури.

Пример 9. Процесс осуществляют аналогично примеру 1, при этом, используют в качестве носителя СПЛ-А с характеристиками:

n= 900: q= 0,35: z=0,65: MM 110000, MMP 1,6, а в качестве вакцинных антигенов используют смесь поверхностных ГА- и НА- белков с внутренними М-белком и НП-белком вируса гриппа. Мольное соотношение антиген-носитель составляет 1:5. Определение содержания белка проводили по методу Бредфорда.

Пример 10. Процесс осуществляют аналогично примеру 2, при этом, используют в качестве носителя СПЛ-А с характеристиками:

n=540, q=0,25, z=0,75; MM 78000; MMP 1,8, а в качестве вакцинных антигенов - поверхностные белки вируса гриппа ГА и НА. Мольное соотношение антиген-носитель составляет 1:30. Определение содержания белка проводили по методу Лоури.

Пример 11. Процесс осуществляют аналогично примеру 2, при этом, используют в качестве носителя СПЛ-А с характеристиками:

n= 950, q=0,3; z=0,7; MM 120000; MMP 1,7, а в качестве вакцинных антигенов - внутренние М-белок и НП-белок. Мольное соотношение антиген-носитель составляет 1:25. Определение содержания белка в препарате проводили по методу Лоури.

Пример 12. Процесс осуществляют аналогично примеру 2, при этом, используют в качестве носителя СПЛ-А с характеристиками:

n= 600, q=0,4, z=0,4; MM 90000; MMP 1,7, при этом, в качестве вакцинных антигенов используют смесь поверхностных ГА и НА с внутренними М-белком и НП-белком вируса гриппа. Мольное соотношение антиген-носитель составляет 1: 20. Определение содержания белка проводили по методу Лоури.

Пример 13. Изучение эффективности вакцины против вируса гриппа.

Для установления специфичности и определения нарастания титров специфических антител проводят тест оценки антигенной активности в сыворотке крови мышей и в сыворотке крови добровольцев в реакции торможения гемагглютинации (РТГА).

После удаления неспецифических ингибиторов готовят двукратные разведения сывороток в лунках плексиглазового планшета в объеме 0,2 мл. К каждому разведению сыворотки добавляют 0,2 мл гомологичного антигена в количестве 4АЕ. Смесь встряхивают и оставляют при температуре 202oC на 30 минут, после чего в каждую лунку добавляют 0,4 мл 1% суспензии куриных эритроцитов. Смесь повторно встряхивают и оставляют при температуре 202oC в течение 40-45 минут (до оседания эритроцитов в контроле), после чего производят учет результатов реакции по 4-х крестовой системе. За титр антигена или одну агглютинирующую единицу (1АЕ) принимают наибольшее разведение антигена, дающее четко выраженную агглютинацию эритроцитов. При наличии специфических антител в сыворотке наступает задержка агглютинации эритроцитов. За титр антител в сыворотке принимают предельное разведение антигена, вызывающее полную задержку гемагглютинации.

В опытах использовали половозрелых мышей линии (CBAxC57B1/6)F1 с массой 18-20 г. В качестве антигенов использовали ГА, НА, М-белок и НП-белок вируса гриппа, выделенные из штамма вируса гриппа соответствующего типа H3N2, H1N1, В, а также препараты, полученные на основе их соединений с полимерными носителями СПЛ и СПЛ-А.

Дозу антигена подбирали в предварительных опытах на мышах. Каждая группа состояла из 8-10 мышей. Все препараты вводили внутрибрюшно в объеме 0,5 мл. Мыши контрольной группы получали 0,5 мл физиологического раствора. Использовалась схема двукратной вакцинации с ревакцинацией через две недели. Через 12 дней после второй иммунизации в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) оценивали иммуногенность исследуемых препаратов.

Полученные результаты представлены в таблице 1, где позиция 13 показывает антигенную активность контрольной группы.

Пример 14. Оценка иммуногенности вакцины против вируса гриппа.

Препараты вводили в различных дозах и схемах инбредным мышам (CBAxC57B1)F1. После этого проводили многопараметровое исследование антигенспецифических иммунных реакций, в том числе определяли содержание специфических к ГА антител в сыворотках иммунизированных животных.

Препараты разводили в фосфатном буфере, вводили мышам в дозе от 0,1 до 10 мг/мышь по белку внутрибрюшно или подкожно в область основания хвоста. Для индукции вторичной иммунной реакции делали повторную инъекцию препарата спустя 21 день после первого введения. В определенные сроки после иммунизации проводили декапитацию мышей, собирали кровь и получали сыворотки.

Содержание специфических к ГА антител в сыворотках определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА). Анализ проводили в 96-ти луночных полистироловых планшетах по общепринятой методике.

ИФА-титры антител определяли после первичной и вторичной иммунизации в опытных и контрольной группах и расчитывали коэффициент специфической иммунной памяти Кип и коэффициент специфической иммуностамуляции Kсс. У мышей контрольной группы иммунная память не формируется.

Данные коэффициенты не зависят от абсолютных значений титров и являются объективными показателями иммуногенных свойств вакцинных препаратов. Результаты анализа представлены в таблице 2.

Пример 15. Оценка иммуногенности описываемой вакцины на добровольцах проводилась в соответствии с утвержденным Протоколом испытаний. Для вакцинации отбирали серонегативных (титр РТГА менее 10) лиц среднего возраста (30-40 лет), группы со стояли из 10-12 человек. Вакцинацию проводили внутримышечно, в область дельтовидной мышцы левой руки шприцами одноразового пользования по 0,5 мл однократно. Каждая доза содержала по (51) мкг гемагглютинина вируса гриппа типа A (H1N1) и носителя СПЛ-1 в дозе, соответствующей описанному в примерах 1, 2, 4, 6. Лицам, вошедшим в контрольную группу, вводили по 0,5 мл физиологического раствора.

Для оценки иммуногенности изучаемых препаратов парные сыворотки привитых, взятые до вакцинации и через месяц после нее, исследовали в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с вакцинным штаммом вируса гриппа. Эффективность препаратов оценивали по проценту лиц с защитными титрами антител. Лица считаются иммуннозащищенными, если титр антител в РТГА превышает 1:40.

Результаты изучения иммуногенности вакцин представлены в таблице 3.

Экспериментальные данные, приведенные в таблице 3, свидетельствуют о формировании у лиц, вакцинированных описываемыми препаратами, напряженного иммунного ответа с высоким защитным титром антител.

Пример 16. Оценка эффективности вакцины против вируса гриппа в тесте нейтрализации вируса.

Определение титров "защитных" антител проводится по методике вируснейтрализующей активности сывороток мышей, иммунизированных описываемыми препаратами.

Постановка эксперимента осуществляется аналогично примеру 14. После двукратного (с интервалом 21 день) введения оптимальной иммуногенной дозы вакцины у мышей собирают сыворотку крови и исследуют ее активность в тесте инактивации живого вируса гриппа. С этой целью различные разведения сыворотки смешивают с суспензией вируса гриппа и по общепринятой методике оценивают титры вируснейтрализующих антител. Вируснейтрализующим титром мышиной сыворотки считают ее максимальное разведение, которое вызывает отмену гемагглютинирующей активности аллантоисной жидкости в 50% эмбрионов. Результаты оценки приведены в таблице 4.

Известно, что титры 1:400 и индекс сероконверсии 40 в тесте нейтрализации вируса гриппа являются надежными показателями эффективности вакцины против вируса гриппа и считаются "защитными" титрами. Приведенные в таблице 3 данные показывают, что сыворотки мышей, иммунизированных препаратами по описываемому изобретению, содержат по меньшей мере в 40 раз больше вируснейтрализующих антител, чем в нормальных мышиных сыворотках.

Источники информации

1. Перадзе Т. В. и др. Противогриппозные профилактические препараты. М.: Медицина, 1986, с. 79, 100, /2/.

2. Патент РФ N 1580617, МКИ А 61 К 39/145, оп. 1996. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



1. Вакцина против вируса гриппа, включающая соединение полимерного носителя с вакцинными антигенами вируса гриппа, отличающаяся тем, что в качестве полимерного носителя используют производные гетероцепных полиаминов с мол. м. 50000 - 150000 Д, при этом соединение имеет соотношение антиген-носитель 1 : 5 - 30 и общую формулу



где R - вакцинные антигены вируса гриппа;

n = 350 - 1000 - количество элементарных звеньев;

q = (0,2 - 0,4)n - количество алкилированных звеньев;

z = (0,4 - 0,8)n - количество окисленных звеньев;

x = 2 или 4; y = 1 или 2; А = CH или N.

2. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что в качестве производных гетероцепных полиаминов используют сополимер N-окиси 1,4-этиленпиперазина и (N-карбоксиэтил)-1,4-этиленпиперазиний бромида с общей формулой



3. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что в качестве производных гетероцепных полиаминов используют сополимер N-окиси-1,2-этиленпиперидина и (N-карбоксиэтил)-1,2-этиленпиперидиний бромида с общей формулой



4. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что в качестве вакцинных антигенов вируса гриппа используют поверхностные белки вируса гриппа гемагглютинин и нейраминидазу.

5. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что в качестве вакцинных антигенов вируса гриппа используют внутренние белки вируса гриппа матриксный белок и нуклеопротеид.

6. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что в качестве вакцинных антигенов вируса гриппа используют поверхностные и внутренние белки вируса гриппа.

7. Способ получения вакцины против вируса гриппа, включающий взаимодействие вакцинных антигенов вируса гриппа с полимерным носителем, отличающийся тем, что в качестве полимерного носителя используют производные гетероцепных полиаминов с мол.м. 50000 - 150000Д, а его взаимодействие с вакцинными антигенами вируса гриппа осуществляют азидным методом при соотношении антиген-носитель 1 : 5 - 30.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что производные гетероцепных полиаминов предварительно подвергают активации путем введения гидразидных групп.

9. Способ получения вакцины против вируса гриппа, включающий взаимодействие вакцинных антигенов вируса гриппа с полимерным носителем, отличающийся тем, что в качестве полимерного носителя используют производные гетероцепных полиаминов с мол.м. 50000 - 150000Д, а его взаимодействие с вакцинными антигенами осуществляют посредством реакции комплексообразования при соотношении антиген-носитель 1 : 5 - 30.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что реакцию комплексообразования проводят между противоположно заряженными макромолекулами производных гетероцепных полиаминов и вакцинных антигенов вируса гриппа.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что в качестве производных гетероцепных полиаминов используют сополимер N-окиси 1,4-этиленпиперазина и (N-карбоксиэтил)-1,4-этиленпиперазиний бромида, в качестве вакцинных антигенов - поверхностные белки вируса гриппа гемагглютинин и нейтраминидазу, а реакцию комплексообразования осуществляют в условиях фосфатного буфера с pH 5,8, при 2 - 4oC.