МИКРОАНАЛИЗ НА АЛЛЕРГЕНЫ

МИКРОАНАЛИЗ НА АЛЛЕРГЕНЫ


RU (11) 2276790 (13) C2

(51) МПК
G01N 33/53 (2006.01)
G01N 33/68 (2006.01) 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 29.08.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(14) Дата публикации: 2006.05.20 
(21) Регистрационный номер заявки: 2003112699/15 
(22) Дата подачи заявки: 2001.10.03 
(30) Приоритетные данные: 00890296.7 2000.10.03 EP 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2001.10.03 
(43) Дата публикации заявки: 2004.09.10 
(45) Опубликовано: 2006.05.20 
(56) Аналоги изобретения: US 4849337 A, 18.07.1989. US 5916818 A, 29.06.1999. 
(72) Имя изобретателя: ХИЛЛЕР Рейнхард (AT); ХАРВАНЕГ Кристиан (AT); МЮЛЛЕР Манфред В. (AT) 
(73) Имя патентообладателя: ВБС-ДЖИНОМИКС БАЙОСАЙЕНС РИСЕРЧ ГМБХ (AT) 
(85) Дата соответствия ст.22/39 PCT: 2003.05.05 
(86) Номер и дата международной или региональной заявки: EP 01/11429 (03.10.2001) 
(87) Номер и дата международной или региональной публикации: WO 02/29415 (11.04.2002) 
(98) Адрес для переписки: 103735, Москва, ул. Ильинка, 5/2, ООО "Союзпатент", пат.пов. А.П.Агурееву 

(54) МИКРОАНАЛИЗ НА АЛЛЕРГЕНЫ
Изобретение относится к области иммунологии. Сущность его заключается в разработке способа для обнаружения иммуноглобулина, связывающегося с аллергеном в образце. При этом один или более аллергенов иммобилизуют на структурном чипе, после чего образец инкубируют в присутствии иммобилизованных аллергенов. Иммуноглобулины, обладающие специфичностью в отношении аллергенов, связываются со специфическими аллергенами, после чего осуществляют детекцию иммуноглобулинов. Технический результат - повышение эффективности иммунодиагностики. 4 н. и 33 з.п. ф-лы, 5 табл., 4 ил. 




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к медицине, в частности к способу детекции иммуноглобулина, связанного с аллергеном в аналитическом образце, а также к способу in vitro диагностики аллергии у пациента.

Уровень техники

Аллергия представляет собой реакцию иммунной системы организма на вещество, которое в обычных условиях считается безвредным. Именно такая реакция вызывает симптомы, которые классифицируются как аллергические реакции. В связи с этим аллергия является не нарушением иммунной системы, а проявлением ее повышенной активности. Существует множество симптомов реакции аллергика на аллерген. У некоторых людей проявляются такие симптомы, как астма, экзема, появление сыпи, глазной зуд, синусит, блокада носовых пазух или ринорея, а также сенная лихорадка, однако симптомы могут быть и более серьезными. Так например, в случае аллергических реакций на яды орехи и морских животных, имеющих панцирь, может возникать состояние, называемое анафилактическом шоком, представляющее собой потенциальную угрозу жизни. Это происходит в том случае, когда реакция организма столь сильна, что происходит разбухание горла, падение кровяного давления и затруднение дыхания. В некоторых случаях реакция такого типа может привести к летальному исходу.

Случаи аллергий становятся все более частыми в развитых странах (например, в Европе, Северной Америке и Японии). По некоторым оценкам, 2-50% населения подвержено действию аллергенов. В настоящее время известно, что аллергии являются результатом нарушения баланса Т-клеточного компартмента иммунной системы. Если быть более точным, то аллергические реакции сопровождаются повышенной активностью так называемых Т-2хэлперных (Th2) клеток по сравнению с активностью Т-1хэлперных (Th1) клеток, что приводит к повышенной продукции IgE.

IgE (иммуноглобулин Е) представляет собой, по меньшей мере, одно из веществ, вызывающих аллергические реакции. В нормальном состоянии специфичный на аллерген IgE не определяется в крови и вырабатывается лишь в тех случаях, когда объект приобретает повышенную чувствительность к аллергену. Вещества, вызывающие аллергии (называемые аллергенами), вырабатывают в организме уникальный специфический IgE, способный реагировать только с ними. Такая реакция между IgE и аллергеном подобна взаимодействию замка и ключа. В результате объединения IgE с аллергеном клетки выделяют химические вещества (например, гистамин), вызывающие аллергические симптомы. В организме человека может присутствовать IgE, обладающий специфичностью к нескольким веществам, и такой человек является аллергиком с реакцией на несколько веществ. Результаты тестирования на IgE ранжируют таким образом, чтобы показать, какое количество IgE, специфичного на испытуемое вещество, присутствует в крови. Чем выше ранг, тем больше вероятность того, что пациент подвержен аллергическим реакциям. В течение последних десятилетий в диагностике аллергических заболеваний использовались лишь частично очищенные экстракты, полученные из основных аллергенных источников. Очевидно, что такие неочищенные смеси имеют сложный и изменяющийся состав. Вследствие этого диагностический потенциал таких экстрактов может изменяться и приводить к получению ложных, отрицательных результатов. Последнее обстоятельство главным образом приписывалось неустойчивости аллергенов в среде экстрактов. Другой недостаток использования экстрактов для диагностики аллергенов состоит в плохой стандартизации коммерчески доступных продуктов в отношении их аллергенного состава. Для каждой компании, действующей на рынке, используются свои единицы эффективности и методы расчета. Как следствие, затруднено сравнение диагностических продуктов, выпускаемых различными компаниями.

За последние десятилетия были идентифицированы наиболее важные компоненты, связанные с заболеванием, основные аллергены, однако их количественное определение не легло в основу стандартизации аллергенных экстрактов. В настоящее время доступны моноклональные антитела против большинства основных аллергенов.

Тестирование аллергенов известными методами не является прогрессивным процессом. Указанные методы могут стать полезными при условии рассмотрения их истории с целью определения наиболее подходящих тестов. Однако имеется очень небольшое число признанных медицинских тестов для идентификации аллергических реакций, и их применение, как правило, ограничено клиническими лабораториями или специальными центрами. Хотя диагностика атопии или аллергии может быть сравнительно легко проведена квалифицированным практиком или специалистом в области аллергии, для подтверждения диагноза часто требуются дополнительные тесты.

Существуют различные методы исследования аллергических проявлений:

1. Аллергическая кожная проба с помощью укола

Предполагаемые аллергены инъецируют прямо под поверхность кожи, и реакция наблюдается квалифицированной медицинской сестрой или врачом. При проявлении реакции возникает зона покраснения, причем чем сильнее реакция, тем больше зона. Аллергическая кожная проба обладает достаточно высокой чувствительностью, хотя этим методом могут быть идентифицированы не все аллергены.

2. Накожная проба

Накожная проба может использоваться в случаях контактного дерматита. Обычно испытуемые вещества применяют на коже, покрытой бляшками, и оставляют на месте в течение 48 часов. В случае положительной реакции на небольшой площади наблюдается экзема. И в этом случае за реакцией наблюдает опытная медицинская сестра или врач.

3. Альтернативная проба на аллергию

Существует большое число альтернативных типов аллергических проб и, к сожалению, лишь небольшое их число можно считать достоверными и признанными медицинскими профессионалами. Такие альтернативные пробы часто вводят в заблуждение и, кроме этого, весьма дороги.

4. Тест Vega

Тест Vega представляет собой электрическое испытание, описанное как методика биоэнергетической регуляции. В ходе теста измеряют проводимость с использованием моста Уитстона. Электроды присоединяют к точкам акупунктуры или помещают на руке пациента. Затем в металлический лоток помещают различные растворы. После этого устройство калибруют, помещая в лоток стеклянную ампулу с токсичным веществом. Содержимое ампулы понижает электропроводность. Затем в лоток помещают другие вещества и, если получают аналогичные показания, то об этом сообщают как об аллергической или «сенсибилизирующей» реакции. Описанная методика широко используется в магазинах диетического питания, однако ее значение не доказано и отсутствуют достоверные опыты, способные подтвердить заявку.

5. Тест на разрушение лейкоцитов

Этот тест включает смешивание лейкоцитов пациента с экстрактом специального пищевого продукта и последующее проведение различных измерений на клетках с целью обнаружения каких-либо изменений. Тест дает большое число ложных положительных и ложных отрицательных реакций, и по заключению Американской Академии аллергии отсутствуют доказательства эффективности рассматриваемого теста в диагностике пищевой и ингаляционной аллергии.

6. Анализ волос

Другая форма испытания состоит в анализе волос. Волосы могут анализироваться на присутствие таких токсичных металлов, как свинец, ртуть и кадмий или низких уровней содержания селена, цинка, хрома, марганца и магния. Отравление тяжелыми металлами хорошо известно и документально подтверждено в судебной медицине, и анализ волос может давать доказательства воздействия металлов. Однако анализ волос как средство диагностики аллергии с использованием методов подобных "dowsing" (нахождению подпочвенных вод с помощью ивового прутка) никогда не был узаконен.

7. Прикладная кинезиология

Образцы пищи помещают под язык пациента или в стеклянный контейнер, который находится в руке пациента. Затем пациенту предлагается толкнуть свободной рукой руку исследователя. Наличие аллергической реакции проявляется в понижении мышечной реакции, в связи с чем пациент испытывает затруднения при подъеме руки. Рассматриваемая техника не выдерживает двукратного повторения при слепом методе исследования.

Кроме этого, существуют различные in vitro методы диагностики аллергий, в которых определяют наличие IgE или IgG антител в крови пациента:

8. Такие традиционные методы, как ELISA и вестерн-блоттинг, используются для детекции антител (IgE), присутствующих в сыворотке крови пациента, с помощью (рекомбинантных) аллергенов.

9. Радиоаллергосорбентный тест (RAST®):

В соответствии с этим способом, специфический аллерген наносят на бумажный диск; в случае наличия иммуноспецифичного IgE в сыворотке крови пациента его также связывают с диском; детекцию осуществляют с помощью радиоактивно меченного анти-IgE. Применяются различные системы подсчета для сравнения результатов теста с абсолютным связыванием отрицательного контрольного образца. Обычно модифицированный метод RAST® сопровождается инкубацией в течение ночи и характеризуется высокой чувствительностью.

10. Эксперименты по количественному ингибированию IgE на основе методики RAST, в которых экстракт аллергена точечно наносят на полоски из нитроцеллюлозы. Аликвоты сыворотки предварительно инкубируют со смесью специфических рекомбинантных аллергенов, после чего смесь инкубируют на полосках из нитроцеллюлозы. Связанный IgE определяют с помощью антител против IgE человека. На последней стадии рассчитывают процент ингибирования связывания IgE с природными экстрактами после предварительной абсорбции рекомбинантных аллергенов.

11. В соответствии с тестом на стимуляцию клеточных антигенов (CAST) базофильные клетки пациента стимулируют с помощью интерлейкина-3 и аллергена с последующим измерением по методике ELISA de novo образовавшегося и выделенного сульфидолейкотриена (SLT).

12. UniCAP: Рекомбинантные аллергены иммобилизуют на твердофазной структуре, после чего определяют связывание антител, присутствующих в сыворотке крови пациента, с аллергенами.

Следует отметить, что описанные способы требуют осуществления множества отдельных экспериментальных стадий для тестирования большого числа (например, 100) различных аллергенов. Кроме этого, упомянутые выше тесты не обладают достаточно высокой чувствительностью, не всегда достаточно надежны и очень продолжительны. Для проведения рассмотренных тестов требуются большие количества образца (например, сыворотки крови пациента), а также очищенных, возможно рекомбинантных, дорогостоящих аллергенов.

Патент США US 4444879 относится к способам и устройствам для иммунологических анализов на общий иммуноглобулин и IgE. В данном случае аллергены экстрагируют и иммобилизуют в покрытых полимером лунках микропланшета для титрования. После этого в лунки добавляют анализируемый образец и проводят общепринятый иммунологический анализ.

В ЕР 0556745 А1 описывается способ определения IgE антител против протеина пшеницы в жидкой среде организма, согласно которому экстракт пшеничного аллергена иммобилизуют на твердой фазе, представляющей собой, например, хроматографический или капиллярный материал или волокно, стекло, нейлон, целлюлозу или ее производные в виде стеклянных шариков, микрочастиц, пластин или лунок титрометрического микропланшета. Как и в предыдущем случае, после этого проводят традиционный иммунологический анализ для определения антител в образце крови пациента.

US 3720760 относится к способу анализа жидкой среды организма на иммуноглобулины. Как и в предыдущих ссылках, аллергенсодержащие экстракты, являющиеся коммерчески доступными материалами, прикрепляют к нерастворимому в воде полимеру, после чего проводят общепринятый иммунологический анализ.

US 4849337 также относится к способу количественной идентификации аллерген специфического IgE в сыворотке крови пациента в результате конъюгации IgE сыворотки с аллергенами, закрепленными на твердом носителе. В этом способе может применяться экстракт аллергена или аллерген, полученный непосредственно из пыльцы, пыли, от животных и т.п.

Однако традиционные способы иммунологического анализа не используются для тестирования пациента на аллергию, поскольку количество различных аллергий достигает нескольких сотен и постоянно растет. Для анализа сыворотки пациента на все возможные и редко встречающиеся аллергии требуется чрезмерно большое количество времени и экспериментальной работы, и это невозможно сделать в лабораторных условиях, где ежедневно приходится анализировать несколько сотен образцов, взятых у пациентов.

Сущность изобретения

В связи со сказанным выше, цель настоящего изобретения состоит в разработке способа детекции иммуноглобулина, связывающегося с аллергеном в образце, лишенного отмеченных выше недостатков, который может осуществляться за короткое время с использованием небольшого количества образца и аллергенов, отличается высокой надежностью и чувствительностью и, что особенно важно, позволяет определять практически неограниченное число аллергенов за один анализ.

Другая цель настоящего изобретения состоит в разработке лишенного указанных выше недостатков, способа in vitro диагностики аллергии у пациента.

Рассматриваемый способ характеризуется тем, что один или более аллергенов иммобилизуют на микроструктурном элементе (чипе) (microarray chip), после чего образец инкубируют в присутствии иммобилизованных аллергенов, в результате чего происходит связывание иммуноглобулинов, специфичных в отношении аллергенов, со специфическим аллергеном, после чего проводят определение иммуноглобулинов, связанных со специфическими иммобилизованными аллергенами.

Микросистемы были недавно адаптированы для ряда ДНК-технологий, которые достаточно давно используются в научном сообществе. Становятся доступными различные формы таких ДНК-чипов, что неизбежно изменит экспериментальный дизайн обычной лабораторной работы. In vitro ДНК-диагностика становится менее продолжительной и менее трудоемкой, поскольку использование новой технологии позволяет проводить сложные анализы в высокопроизводительном формате. Следовательно, в области исследования белков классические твердофазные субстраты, например микропланшеты для титрования, мембранные фильтры и микроскопические срезы, будут переведены в формат микросхем высокой плотности. Новая и гибкая белковая технология на базе микросхем, в конечном счете, позволит осуществить высокопроизводительный скрининг экспрессии генов и взаимодействия молекул (Walter с сотр., Curr. Opin. Microbiol., 2000 Jun; 3 (3): 298-302; Emili& Cagney, Nat Biotechnol 2000 Apr; 18 (4) 393-7). Недавно концепция белковых микросхем была адаптирована для иммунологических анализов.

Указывается, что биочип способен поддерживать высокопроизводительный (НТ), усложненный иммуносорбционный анализ на связывание фермента (ELISA). Такие биочипы могут состоять, например, из оптически гладкого стеклянного планшета с 96 лунками, выложенными гидрофобной тефлоновой маской, однако известны и могут использоваться биочипы из других материалов, имеющие другую форму. Эксперименты показывают, что специфическая множественная детекция белковых антигенов, размещенных на стеклянном субстрате, является вполне вероятным методом. Другие применения нового формата высокопроизводительного скрининга (HTS) охватывают анализ профиля прямой экспрессии клеточного белка, мультиплексные анализы для определения инфицирующих агентов и диагностику рака (Mendoza L.G. et al, Biotechniques 1999 Oct; 27 (4): 778-80).

Однако в известных способах тестирования белков с использованием микрочипов антитела иммобилизованы на микрочипе. Неожиданно оказалось возможным присоединить к микрочипу не только антитела, но даже аллергены, представляющие собой антигены, соответствующие специфическим антителам, в особенности IgE и IG. Этот факт особенно удивителен в свете того, что функциональные аллергены демонстрируют особую вторичную структуру, способную к модификации при связывании с такой высокоплотной твердой фазой, как микрочип. Такая модификация структуры аллергена может препятствовать связыванию в системе антитело-аллерген, что может приводить к ложным отрицательным результатам. Антитела, фрагменты антител или пептиды имеют относительно малый размер и обладают в растворе более высокой устойчивостью, чем родственные антигены. Однако при иммобилизации на твердом носителе, даже в случае антител, лишь небольшое их количество остается интактным и активным.

Статья Haab с сотр. (Genom Biology 2000, I (6): препринт 0001,1-0001,22), которая была получена 9 Ноября 2000, относится к белковым микроструктурам для детекции и количественного определения белков и антител в растворах. Результаты анализа, проведенного в соответствие с указанной публикацией, показали, что лишь 50% ранжированных антигенов и 20% ранжированных антител обеспечивают специфичное и точное измерение родственных аллергенов.

Кроме этого, разнообразие возможных аллергенов, конечно, много выше разнообразия антител в том, что касается манипулирования с белками, в особенности для иммобилизации и окрашивания отличающихся по структуре аллергенов. Однако неожиданно было установлено, что аллергены, иммобилизованные на микрочипе, проявляют высокую надежность и чувствительность в методе детекции иммуноглобулинов в образце.

Такой способ позволяет проводить анализ множества иммуноглобулинов, связанных со специфическим аллергеном в рамках одной экспериментальной стадии, причем анализ также может быть дробным: может тестироваться более 100 различных аллергенов без проведения множества отдельных экспериментальных стадий, что имеет место при использовании традиционных микротитрующих средств. Кроме этого, рассматриваемый анализ характеризуется высокой чувствительностью и надежностью. С использованием такого метода результаты теста могут быть получены за короткое время, например, в течение трех часов, что существенно уменьшает продолжительность анализа по сравнению с традиционными тестами RAST и ELISA.

Анализ с использованием микросистем характеризуется высокой воспроизводимостью при проведении повторных экспериментов с чипами, содержащими образцы от различных персон, например, при использовании маски, подобной микропланшету для титрования, в результате чего каждая лунка содержит ряд пятен различных аллергенов, и в нее добавляют образец от одного пациента. Дополнительное преимущество способа настоящего изобретения связано с тем, что большое число различных зондов занимает относительно малую площадь, создавая высокую плотность. Малая удельная площадь поверхности схемы обеспечивает чрезвычайно однородные условия связывания (температурный контроль, содержание соли и т.п.), в то время как чрезвычайно большое число зондов позволяет параллельно осуществлять массовый процессинг гибридизаций. Поскольку схемы высокой плотности содержат большое число зондов, возможен контроль большого числа параметров, например контроль вариаций или мутаций в конкретном аллергене, контроль общих условий гибридизации, регулирование условий приготовления образца, а также контроль ошибочного спаривания при неспецифичном связывании или кросс-гибридизации.

Кроме этого, для рассматриваемого анализа требуется лишь минимальное количество материала (аллергена, а также образца) по сравнению с традиционными тестовыми системами. Это означает, что при одинаковом количестве исходных материалов, при использовании микросхем может быть произведено значительно большее число испытаний и может использоваться меньшее количество образца для тестирования большого числа иммуноглобулинов, связанных с аллергенами. Кроме этого, в малых объемах связывание может происходить очень быстро.

Природные интактные «иммуноглобулины» или антитела обычно содержат Y-образную тетрамерную молекулу, имеющую сайт связывания антигена на конце каждого верхнего луча. Сайт связывания антигена состоит из вариабельного домена тяжелой цепи, связанного с вариабельным доменом легкой цепи. Более конкретно, сайт связывания антигена на антителе, в основном, состоит из 3 CDRs (гипервариабельных участков) вариабельного домена тяжелой цепи (VH) и 3 CDRs вариабельного домена легкой цепи (VL).

Обычно термин «антиген» относится к веществу, способному вызывать иммунную реакцию, и это вещество, как правило, используется для определения соответствующих антител с помощью одного из многих имеющихся in vitro и in vivo иммунологических методов демонстрации взаимодействий в системе антиген-антитело.

Аналогичным образом, термин «аллерген» используется для обозначения антигена, обладающего способностью к индукции и к связыванию со специфическими (например, IgE) антителами, ответственными за общие аллергические реакции; однако последнее определение не исключает возможности индуцирования аллергенами реактивных антител, которые могут включать виды иммуноглобулинов, отличные от IgE.

Термин «иммобилизация» в контексте белков или пептидов относится к связыванию или присоединению белка/пептида к твердым носителям, осуществляемому традиционными способами, в присутствии или отсутствии дополнительного спейсера между твердым носителем и аллергеном. В этой области техники иммобилизация пептидов/белков на носителе является хорошо известным приемом; область настоящего изобретения охватывает любую иммобилизацию, например ковалентную, нековалентную, в особенности ту, что происходит за счет гидрофобных взаимодействий, например, с мембранами и синтетическими поверхностями соответственно, и т.п.

Термин «микроструктура» относится к совокупности элементов (например, «пятен»), имеющих плотность, по меньшей мере, 16/см2, предпочтительно по меньшей мере 64/см2, еще более предпочтительно - около 96/см 2 и наиболее предпочтительно, по меньшей мере 1000/см 2. Отличительные элементы микроструктуры имеют типичные размеры, например диаметры, в интервале 10-2000 мкм, предпочтительно 50-500 мкм, еще более предпочтительно 150-250 мкм, и находятся на одинаковом расстоянии от других отличительных элементов. В связи с этим микроструктура настоящего изобретения, используемая для рутинного скрининга масс, может включать по крайней мере 500, предпочтительно по крайней мере 1000 индивидуальных пятен, содержащих аллергены, стандартные и контрольные вещества.

Используемый в настоящем изобретении термин «чип», в сущности, может иметь любую природу и представлять собой, например, предметное стекло или лунку микропланшета для титрования или даже множество поверхностей, хотя предпочтительной является плоская решетчатая поверхность.

Стадию детекции можно осуществлять традиционным способом, известным специалисту в данной области, например, физическим, ферментативным, химическим и т.п.

В соответствии с предпочтительным воплощением настоящего изобретения, IgE определяют как иммуноглобулины. IgE известен как вещество, вызывающее аллергические реакции, и вырабатывается лишь в том случае, когда человек приобретает чувствительность к какому-либо веществу, т.е. становится аллергиком. Поэтому для тестирования образца пациента с аллергической реакцией на специфический аллерген этот образец тестируют на IgE в качестве иммуноглобулина. Чем выше количество IgE в образце, тем больше вероятность того, что пациент, у которого брали образец для анализа, проявит аллергическую реакцию на специфический аллерген.

Предпочтительно, IgG детектируют как иммуноглобулины. Известно, что IgG присутствует в образце пациента с аллергией на пищевые продукты, в связи с чем определение IgG может рассматриваться как указание на отсутствие толерантности к пищевым продуктам.

Весьма полезно иммобилизовать один или более очищенных аллергенов на микроструктурном чипе. В этом случае отдельные аллергены, например, очищают от аллергенного экстракта, например от специфического пищевого или растительного продукта. Вполне понятно, что одновременно могут анализироваться один или более специфических аллергенов.

Известные специалисту в данной области способы очистки могут включать хроматографическую очистку, очистку путем разделения изотопов, очистку специфическим связыванием аллергена с твердой фазой, например, над антителом и т.п. До настоящего времени применение очищенных аллергенов для массового тестирования на аллергию не предполагалось.

Термин «очищенные» аллергены относится, в отличие от экстрактов, к отдельным аллергенам, имеющим, например, природное, рекомбинантное или синтетическое происхождение. Такие очищенные аллергены обладают рядом важных преимуществ над аллергенным экстрактом при иммобилизации на твердом носителе: В связи с тем, что в любом экстракте присутствует смесь различных белков, концентрация тестируемых аллергенов очень низка по сравнению с препаратами на основе очищенного единичного аллергена. Вследствие этого, очищенные единичные аллергены могут быть иммобилизованы на микроструктуре в очень высокой концентрации. Поскольку в препарате на основе очищенного аллергена присутствуют точно идентифицированные молекулы, на микроструктуре иммобилизуются лишь строго определенные аллергены. В связи с этим микроструктура и способ определения антител с помощью очищенных аллергенов могут быть стандартизированы и подвергнуты строгому контролю на качество.

Кроме этого, в связи с высокой концентрацией очищенных аллергенов в композиции рассматриваемые аллергены можно иммобилизовать на микроструктуре с более высокой плотностью, вследствие чего любой метод детекции с помощью такой микроструктуры характеризуется более высокой чувствительностью, чем соответствующие микроструктуры с экстрактами, содержащими аллергены. Другое преимущество очищенных единичных аллергенов над аллергенными экстрактами состоит в том, что иммобилизованные очищенные аллергены могут быть точно идентифицированы. В отличие от очищенных аллергенов, экстракты аллергенов содержат, например, два, три или более различных аллергенов от одного организма или объекта. Так например в случае яблок соответствующий экстракт будет содержать смесь различных яблочных аллергенов, тогда как композиция изобретения будет содержать один из очищенных яблочных аллергенов, или, в зависимости от задачи, установленную смесь из двух или более яблочных или других аллергенов.

Еще одно преимущество очищенных аллергенов над неочищенными аллергенами, присутствующими, например, в экстракте, состоит в том, что дополнительные примеси, присутствующие в экстракте, делают его недостаточно устойчивым вне пределов определенного отрезка времени и могут способствовать образованию плесени. Такое явление может оказывать влияние на детекцию аллергий, поскольку при аллергии на плесень могут быть получены ложные положительные результаты.

Кроме этого, из-за присутствия в экстракте протеаз, такие экстракты неустойчивы, что не имеет места в случае очищенных аллергенов.

Более того, при использовании существующих в настоящее время терапевтических методов на основе очищенных аллергенов диагностика с использованием очищенных аллергенных компонентов обладает решающим преимуществом над диагностикой с использованием неочищенных аллергенов. Такая диагностика особенно полезна при последующем терапевтическом лечении с помощью очищенных аллергенов и тестировании индивидуальной реакции на конкретную терапию, вследствие чего обеспечивается подстройка терапевтического метода под природу пациента.

По указанным выше причинам, способ детекции иммуноглобулина, связанного с аллергеном в образце, вследствие чего один или более очищенных аллергенов иммобилизуются на микроструктурном чипе, обладает особыми преимуществами.

Предпочтительно иммобилизовать на микроструктуре один или более рекомбинантных аллергенов. В течение нескольких последних лет был получен ряд рекомбинантных аллергенов. Хотя продукция рекомбинантных аллергенов, в принципе, является известной операцией в данной области техники, это обстоятельство оказывает незначительное влияние на традиционные методы тестирования аллергических реакций. В результате использования рекомбинантных аллергенов появляется возможность получения большого числа специфических аллергенов и в связи с этим - оптимизации чувствительности теста. Кроме этого, есть возможность модификации рекомбинантных аллергенов с целью получения аллергенных мутаций для определения специфических иммуноглобулинов. Более того, использование основных аллергенов в качестве рекомбинантных белков представляет собой альтернативу тестам с применением экстрактов в том, что касается стабильности анализа, а также стандартизации диагностики. Указанные выше преимущества очищенных аллергенов над неочищенными (экстракт) аллергенами в большей степени присущи рекомбинантным аллергенам, чем очищенным нативным аллергенам. Рекомбинантные аллергены могут иметь более специфичную конструкцию, чем очищенные нативные аллергены, вследствие чего возникает возможность оптимизации аффинности и специфичности теста на рекомбинантные аллергены. Кроме этого, рекомбинантные аллергены лучше поддаются стандартизации по способу их получения. Более того, партии продукции отличаются в меньшей степени при использовании рекомбинантных аллергенов, чем аллергенов из природных источников. Авторами настоящего изобретения было неожиданно установлено, что использование таких рекомбинантных аллергенов в общепринятых in vitro диагностических тестах, согласно настоящему изобретению, превосходит по результатам использование традиционных тестовых систем на основе экстракта. В отличие от рутинного серийного тестирования в соответствии с уровнем техники, современное тестирование на аллерген с использованием рекомбинантных аллергенов переводит стандартные процедуры тестирования на совершенно новый качественный уровень в плане стандартизации, регулируемости, чувствительности, воспроизводимости, способности теста к получению диагностической релевантной информации и т.д.

К рекомбинантным аллергенам относятся вещества, описанные, например, Chapman с сотр. Allergy, 52:374-379 (1997), Laffer et al. J Allergy Clin Immunol, v.98, #2 652-659 (1996), Muller et al. Clinical and Experimental Allergy vol.27 9. 915-920 (1997), Niederberger et al. J Allergy Clin Immunol vol 102, #4, part 1 579-591 (1998), Menz et al. Clinical and Experimental Allergy vol.26, 50-60 (1996) и на эти публикации ссылаются в настоящем описании. Без ограничения области изобретения примерами (рекомбинантных) аллергенов могут служить rBetv1, rBetv2, rBetv4, rJun02, Cass1, rPhlp1, rPhlp2, rPhlp4, rPhlp5a, rPhlp6, rPhlp7, rPhlp11, rPhlp12, rParj2, Artv1a, профилин Мугворта, Apig1, Apig1.0201, Dauc1.2, rArah2, rArah5, Mald1, Mald2, rPena1, recCarp, rDerp1, rDerp2.0101, rDerp2, rDerp2b, rDerp5, rDerp5a, rDerp7, rDerp8, rDerp10, rTyr2, rLepd2.01, rLepdl3, rEurm2.0101, rFeld1, rFeld1a, rBosd2, репрезентативный аллерген от кошек, репрезентативный аллерген от собак, репрезентативный аллерген от BSA, репрезентативный аллерген от мышей, репрезентативный аллерген от крыс, репрезентативный аллерген от свиней, репрезентативный аллерген от овец, репрезентативный аллерген от цыплят, репрезентативный аллерген от кроликов, репрезентативный аллерген от хомячков, репрезентативный аллерген от лошадей, репрезентативный аллерген от голубей, репрезентативный аллерген альбумина морских свинок, HSA, а-NAC, rРепс3, Penn13, rPenc19a, rPenc19b, rAspf1, rAspf1a, rAspf3, rAspf3a, rAspf4, rAspf4a, rAspf6, rAspf6a, rAspf7, rAspf8, rAlta1, rAlta2, rMalf1, rMalf5, rMalf6, rMalf7, rMalf8, rMalf9, rHevb1, rHevb1a, rHevb3, rHevb8, rHevb9, rHevb10, rHevb11, rAK, rBlag2, rBlag4, rBlag5, фосфолипаза А, гиалуронидаза, rVesv5, rVesg5.

Согласно другому полезному воплощению, один или более синтетически продуцированных аллергенов иммобилизуют на микроструктурном чипе. В этом случае имеются те же преимущества, что указаны выше для рекомбинантных аллергенов в отношении аллергенных экстрактов и очищенных нативных аллергенов. Способ синтетического получения пептидов или белков хорошо известен из литературы; синтетическая продукция аллергенов дает возможность получения большого количества высокоочищенных аллергенов низкой стоимости, поскольку для этого используются высокоавтоматизированные технологии. Кроме этого, может быть получен ряд экстрактов любого аллергена, включающего модифицированные формы или без них, что повышает чувствительность и надежность способа определения иммуноглобулинов.

В тесте настоящего изобретения также можно использовать только аллергенную детерминанту или аллергенный домен специального аллергена. В результате этого устраняются риски и недостатки, присущие использованию крупных белков, поскольку облегчаются рутинные операции с более короткими пептидными структурами при производстве биочипов. Сказанное выше применимо ко всем очищенным природным, рекомбинантным и синтетическим аллергенам. В результате становится возможной детекция единичных пептидных эпитопов, что может еще в большей степени улучшить диагностический тест и терапевтическое лечение, особенно в том, что касается специфичности действия.

Особенно выгодно, чтобы нативная форма аллергена, а также его синтетическая или рекомбинантная формы находились на одном и том же чипе. Поскольку предпочтительно использовать, главным образом, рекомбинантные или синтетические аллергены, присутствие нативной формы аллергена может быть предусмотрено, по крайней мере, как средство контроля или получения дополнительной качественной информации. В связи с этим предпочтительный чип настоящего изобретения содержит нативную и синтетическую или рекомбинантную форму по меньшей мере одного аллергена. При этом обеспечивается улучшенный контроль качества и стандартизация различных партий аллергенов.

Предпочтительно, чтобы на микроструктурном чипе в качестве аллергенов присутствовали в иммобилизованном состоянии один или более гаптенов. Термин «гаптен» относится к низкомолекулярному (обычно имеющему молекулярный вес менее 7000 Дальтонов) веществу, которое в общем случае неспособно само по себе вызывать значительную продукцию антител при применении в организме животного, включая организм человека. Такая ситуация может иметь место в связи с тем, что гаптен слишком мал для распознавания иммунной системой. Однако при соединении гаптена с более крупной молекулой носителя гаптен приобретает антигенные свойства. Другими словами, связывание гаптена с молекулой носителя (с образованием комбинированной молекулы аналит-носитель) способствует распознаванию связанного гаптена иммунной системой животного. Между гаптеном (связанным с молекулой носителя) и антителом на гаптен могут протекать реакции иммунопреципитации. В результате иммобилизации гаптена на микроструктурном чипе достигается высокая плотность размещения на чипе.

Разумеется, имеется возможность использования указанных выше различных форм аллергенов, т.е. одновременное использование рекомбинантных и (очищенных) нативных аллергенов. Комбинация таких различных форм позволяет проводить их сравнение и осуществлять контроль, например, рекомбинантных аллергенов, но, кроме этого, такая комбинация может использоваться в качестве контроля различных партий нативных аллергенов, которые могут отличаться друг от друга в связи с использованием различных биологических источников, способов получения и т.п.

Для осуществления высокоэффективного теста предпочтительно использовать аллергены, обладающие оптимальными свойствами, например высокой способностью к связыванию. Однако применение менее или по другому активных антигенов предпочтительно для детекции неэффективно связанных аллерген-вариантов, например, при использовании в гипосенсибилизационных терапиях.

В соответствии с предпочтительным воплощением настоящего изобретения, аллергены иммобилизуют в пятне на поверхности микроструктурного чипа диаметром 10-2000 мкм, предпочтительно 50-500 мкм, еще более предпочтительно 150-250 мкм. Поскольку пятна имеют малый диаметр, можно иммобилизовать большое число различных аллергенов и различные концентрации специфических аллергенов на разных пятнах микроструктурного чипа, в результате чего обеспечивается один микроструктурный чип, с помощью которого, в рамках одной автоматизированной стадии можно идентифицировать большое число аллергенов или определять их концентрации.

Предпочтительно иммобилизовать аллергены на твердом носителе, лучше всего на стеклянном, синтетическом носителе, силиконовой подложке и мембране соответственно. Такие чипы могут быть получены, например, по способам, описанным в книге Ge, Н. (2000), Nucleic Acids Research, 28, e3 (i-vii); Qian W. et. al. (2000), Clinical Chemistry, 46 (1455-1463); MacBeath G. et. al. (2000), Science, 289, (1760-1763), причем на указанные публикации ссылаются в настоящем описании. Каждый из указанных материалов обладает специфическими свойствами и преимуществами, хорошо известными специалисту. Поэтому материал для микроструктурного чипа будет выбираться в соответствии с природой тестируемого аллергена, способом детекции связанных иммуноглобулинов, типом используемых буферов. Кроме этого, выбор материала зависит также и от финансовых соображений.

Предпочтительно, химически видоизменять микроструктурный чип путем аминореактивной и карбоксиреактивной модификации. Такая операция позволяет точно определить характер связывания аллергена с микроструктурным чипом.

Лучше всего, когда аллергены ковалентно связаны с микроструктурным чипом. В этом случае происходит устойчивое связывание аллергенов с микроструктурным чипом, вследствие чего обеспечивается особенно надежный способ.

Согласно другому воплощению настоящего изобретения, иммуноглобулины определяют в сыворотке крови, используя ее как опытный образец. У пациентов, страдающих аллергическими реакциями, иммуноглобулины вырабатываются главным образом в сыворотке крови, вследствие чего анализ сыворотки крови является надежным способом определения иммуноглобулинов. Кроме этого, образцы сыворотки крови могут быть легко и просто взяты у пациента даже в домашних условиях.

Предпочтительно разбавлять сыворотку крови в соотношении 1:1-1:15, предпочтительно, 1:5. В качестве разбавителя может использоваться любой подходящий раствор, например, 1×TBST (10 мМ Tris-HCI, pH 8,0, 150 мМ NaCI, 0,5% TWEEN 20).

Предпочтительно инкубировать образец в течение от 1 минуты до 24 часов, предпочтительно, в течение 1-2 часов в присутствии аллергенов. Инкубацию образца в присутствии аллергенов можно проводить в течение вплоть до нескольких дней. Однако это не приводит к увеличению интенсивности и специфичности сигнала. Как правило, для получения надежного и чувствительного результата достаточно проводить инкубацию в течение 1 часа.

Предпочтительно инкубировать образец в присутствии аллергенов при температуре 0-60°С, предпочтительно 37°С. Инкубация при более низких температурах не приводит к увеличению сигнала, а дает начало неспецифическому связыванию и усиливает фоновый шум. Было установлено, что инкубация при 37°С обеспечивает получение точных и надежных результатов в тесте на аллергены, проводимом на людях.

Связанный иммуноглобулин определяют с помощью, по меньшей мере, одного меченого антитела на специфический иммуноглобулин. Используемый в тексте термин «антитело» относится к интактным молекулам, а также их фрагментам, таким как Fa, F(ab)2 и Fv, которые способны связываться с эпитопной детерминантой. Антитела могут быть получены с использованием интактных полипептидов или фрагментов, содержащих пептиды в качестве иммунизирующего антигена. Полипептид или пептид, используемые для иммунизации животного, могут быть производными РНК или могут синтезироваться химическими методами и, если желательно, могут быть конъюгированы с белком-носителем. Широко используемые носители, химически связанные с пептидами, включают альбумин бычьей сыворотки и тироглобулин. Затем связанный пептид используют для иммунизации животного (например, мышей, крыс или кроликов).

Используемый в тексте настоящего изобретения термин «антитело» относится к моноклональным или поликлональным антителам, вследствие чего моноклональные антитела могут быть получены с использованием техники, обеспечивающей продукцию молекул антитела непрерывной культивацией клеточных линий в культуре. Такие методы включают, но не ограничиваются ими, гибридомную технологию, технологию на основе гибридомы человеческих. В-клеток и IBV гибридомную технологию. Кроме этого, могут продуцироваться химерные антитела, одноцепные антитела, а также антитела, нарабатываемые синтетическими методами.

Антитело можно метить с помощью известных способов, что позволяет качественно и количественно характеризовать связанное антитело. Детектируемые метки, используемые в настоящем изобретении, включают любые композиции, которые можно определять с применением спектроскопических, фотохимических, биохимических, электрических, оптических или химических методов. Применяемые метки включают биотин для окрашивания меченым стрептавидиновым конъюгатом, магнитные шарики, флюоресцентные красители (например, флюоресцеин, техасский красный, родамин, зеленый флюоресцентный белок и т.п.), радиоактивные метки (например, 3H, 125I, 35 S, 14C или 32P), ферменты (например, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу и другие материалы, используемые в тесте ELISA), а также такие колориметрические метки, как коллоидное золото или окрашенное стекло или пластики (например, из полистирола, полипропиленового латекса и т.п.).

Средства для детекции таких меток хорошо известны специалисту в данной области. Так, например, радиоактивные метки можно обнаруживать с использованием фотографической пленки или сцинтилляционных счетчиков, флюоресцентные метки - с использованием фотодетектора для детекции испускаемого света. Ферментные метки обычно обнаруживают, обеспечивая субстрат для фермента и детектируя продукт реакции, продуцируемый действием фермента на субстрат, а колориметрические метки обнаруживают путем простой визуализации окрашенной метки.

Предпочтительно, связанные иммуноглобулины обнаруживают с помощью, по меньшей мере, одного флюоресцентно или радиоактивно меченного специфического антитела против иммуноглобулина. Такой прием представляет собой классический метод качественного и количественного анализа связанного антитела, обладающий высокой специфичностью и надежностью.

Другие системы детекции с использованием микроструктур описаны, например, Schult К., et al. (1999), Anal Chem, (5430-5435); Vo-D inh T. et. al. (1999), Anal Chem, 71 (358-363; Brignac SJ Jr. et al. (1999), IEEE Eng Med Biol Mag, 18 (120-122); Otamiru M. et al. (1999), Int J Biol Macromol, 26 (263-268); Wright, GL Jr. et al. (2000), Prostate Cancer and Prostatic Diseases, 2 (264-276); Nelson RL. et. al. (2000), Electrophoresis 21 (1155-1163); Rich Rl. et. al.(2000), Curr Opin Biotechnol 11 (54-61); Chen JJ. et. al. (1988), Genomics, 51 (313-324). Эти публикации приведены в настоящем описании в качестве ссылки на уровень техники.

Полезно иммобилизовать в качестве аллергенов один или более домашних аллергенов. Их примерами, не ограничивающими область изобретения, могут служить Mites, Tyr.put, Lep. Dest, или mayrei, Felis, Bos, Albumine, Pen.cit., Pen.not., Asp.fumigatus., Alt.alt., Malassezia furfur, Latex, Plodia, Blatella.

В соответствии с еще одном предпочтительным воплощением, в качестве аллергенов иммобилизуют один или более внешних аллергенов. Их примерами могут служить Betula, Juniperus, Phleum, Parietaria judicea.

В качестве аллергенов можно также иммобилизовать один или более пищевых аллергенов. Их примерами могут служить аллергены sellerie, karott, арахиса, яблок, креветок, рыбы.

В качестве аллергенов можно также иммобилизовать один или более ядовитых аллергенов. Для этого можно использовать, без ограничения области изобретения, выделения пчел или ос.

Кроме этого, в качестве аллергенов можно иммобилизовать один или более аутоаллергенов. В качестве таких аутоаллергенов могут использоваться антигены печеночной мембраны, антигены ssДНК, внутренние или внешние антигены клеток мышечного скелета и т.п.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу in vitro диагностики аллергий, в котором образец сыворотки крови пациента анализируют на наличие иммуноглбулинов, которые связываются с аллергенами в соответствие с одним из отмеченных выше способов настоящего изобретения, причем в таком способе используют микроструктурный чип, на котором иммобилизуют по меньшей мере 10, предпочтительно по меньшей мере 50, еще предпочтительнее по меньшей мере 90 аллергенов, и последующая положительная реакция между образцом и иммобилизованными аллергенами свидетельствует о наличии аллергии. Упомянутые выше определения и преимущества также относятся к рассматриваемому методу in vitro диагностики аллергий в сравнении с известными методами диагностики. Преимущество способа настоящего изобретения состоит в том, что возможна одновременная диагностика большого числа аллергий с использованием лишь одного образца, поскольку все испытуемые аллергены иммобилизованы на одном микроструктурном чипе. В связи с этим каждая стадия проводится на одном чипе, где могут находиться дополнительные пятна без иммобилизованных аллергенов, что позволяет одновременно осуществлять отрицательную детекцию. Количество испытуемых аллергенов не ограничено, и, конечно, можно использовать два или более микроструктурных чипа.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к микроструктурному чипу, на котором иммобилизованы один или более аллергенов. Указанные выше определения и преимущества относятся также и к этому аспекту изобретения.

Предпочтительно, аллергены иммобилизуют на пятне диаметром 100-500 мкм, предпочтительно 200-300 мкм.

Предпочтительный микроструктурный чип представляет собой стеклянный носитель, синтетический носитель, силиконовую пластину и мембрану соответственно.

Полезно проводить химическую модификацию микроструктурного чипа, предпочтительно по амин- или карбокси- группам.

Предпочтительно, чтобы аллерген был ковалентно связан с микроструктурным чипом.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к набору, содержащему упомянутый выше микроструктурный чип настоящего изобретения, а также первый реагент, содержащий по меньшей мере один реагент для обнаружения иммуноглобулина, предпочтительно иммуноглобулиновое антитело, предпочтительно в известной концентрации и, возможно, второй реагент в качестве положительного образца, содержащего по меньшей мере один иммуноглобулин, связанный с аллергеном. Первый реагент, содержащий по меньшей мере один реагент для обнаружения иммуноглобулина, предпочтительно иммуноглобулиновое антитело, может использоваться для детекции связанного иммуноглобулина и в этом случае предпочтительно использовать меченое, как описано выше, иммуноглобулиновое антитело. Предпочтительно, чтобы антитело присутствовало в первом реагенте в известной концентрации, что позволяет получать воспроизводимые результаты. Кроме этого, такой набор предпочтительно содержит второй реагент в качестве положительного образца, включающего, по меньшей мере, один иммуноглобулин, связанный с аллергеном. В этом случае также предпочтительно, чтобы иммуноглобулин присутствовал во втором реагенте в известной концентрации, что позволяет количественно определять иммуноглобулин в образце путем сравнения результатов анализа образца пациента с результатами положительной пробы (второй реагент).

Предпочтительно, чтобы такой набор был адаптирован для осуществления способа настоящего изобретения. Для этой цели первый и второй реагенты могут быть сконструированы таким образом, чтобы обнаруживать один специфический иммуноглобулин, связанный со специфическим аллергеном или конкретной аллергией у пациента. Однако такой набор может быть сконструирован таким образом, чтобы обнаруживать множество иммуноглобулинов, связанных со специфическими аллергенами или диагностировать множество аллергических реакций у пациента.

Далее настоящее изобретение раскрывается более подробно с помощью следующих ниже примеров и чертежей, которые не ограничивают область изобретения.

Краткое описание фигур

Фиг.1 изображает топологию аллергенной микроструктуры;

фиг.2 изображает результаты сканирования массива аллергенов, анализируемых в присутствии сыворотки аллергика;

на фиг.3а-3с представлены данные теста на разброс экспериментальных точек (Scatterplot) при осуществлении трехкратного анализа;

на фиг.4а-4с показан % флюоресценции, измеренной для иммобилизованного экстракта и иммобилизованных рекомбинантных аллергенов.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Пример 1:

Обнаружение аллергенов

Аллергены наносят с использованием устройства GMS 417 от Genetic Microsystems. Белки наносят пятнами на дериватизированное стеклянное предметное стекло. Индивидуальные аллергены наносят одним точечным прикосновением, трижды повторяя операцию. Такие точки (отличительные признаки) имели диаметр около 200 мкм.

Аллергены сортируют по следующим функциональным группам: (А) Внешние аллергены (I. Деревья [1 = rBetv1, 2 = rBetv2, 3 = rBetv4, 4 = rJun02, 5 = Cass1], II. Травы [6 = rPhlp2, 7 = rPhlp4, 8 = rPhlp5a, 9 = rPhlp1, 10 = rPhlp6, 11 = rPhlp7, 12 = rPhlp11, 13 = rPhlp12], III. Сорняки [14 = rParj2, 15 = Artv1a, 16 = профилин полыни]).

(С) Пищевые аллергены (X. Овощи [17 = Apig1, 18 = Apig1.0201, 19 = Daucl.2, 20 = rArah2, 21 = rArah5], XI. Фрукты [22 = Mald1, 23 = Mald2], XII. Креветки [24 = rPena1], XIII. Рыба [25 = recCarp]).

(В) Внутренние (IV. Клещи [26 = rDerp1, 27 = rDerp2.0101, 28 = rDerp2, 29 = rDerp2b, 30 = rDerp5, 31 = rDerp5a, 32 = rDerp7, 33 = rDerp8, 34 = rDerp10, 35 = rTyrp2], V. Животные [36 = rLepd2.01, 37 = rLepd13, 38 = rEurm2.0101, 39 = rFeld1, 40 = rFeld1a, 41 = rBosd2, 42 = репрезентативный кошачий аллерген, 43 = репрезентативный собачий аллерген, 44 = BSA, 45 = репрезентативный мышиный аллерген, 46 = репрезентативный крысиный аллерген, 47 = репрезентативный свиной аллерген, 48 = репрезентативный овечий аллерген, 49 = репрезентативный куриный аллерген, 50 = репрезентативный кроличий аллерген, 51 = репрезентативный аллерген хомячков, 52 = репрезентативный лошадиный аллерген, 53 = репрезентативный аллерген голубей, 54 = альбумин морской свинки], VI. Плесени [55 = rРеnc3, 56 = rPenc19a, 57 = rPenc19b, 58 = Penn13, 59 = rAspf1, 60 = rAspf3, 61 = rAspf4, 62 = rAspf6, 63 = rAspf1a, 64 = rAspf3a, 65 = rAspf4a, 66 = rAspf6a, 67 = rAspf7a, 68 = rAspf8a, 69 = rAlta1, 70 = rAlta2], VII. Дрожжи [71 = rMalf7, 72 = rMalf1, 73 = rMalf5, 74 = rMalf6, 75 = rMalf8, 76 = rMalf9], VIII. Латекс [77 = rHevb1, 78 = rHevb1a, 79 = rHevb3, 80 = rHevb8, 81 = rHevb9, 82 = rHevb10, 83 = rHevb11], IX. Насекомые [84 = rAK, 85 = rBlag2, 86 = rВ1аg4, 87 = rBlag5]),

(D) Яды (XIV. Пчелы [88 = Аg5, 89 = фосфолипаза А, 90 = гуалуронидаза, 91 = rVesv5, 92 = rVesg5], XV. Осы [93 = Ag5]), (E) Аутоаллергены (94 = HAS, 95 = a-NAC)

В промежутки между подгруппами аллергенов вставляют буферные точки обозначенные символом «X», служащие фоновым контролем, «ab», обозначает меченое антитело. (Фигура 1: 1864×1182 пикселей, 1,86×1,18 см, 1000 пикселей на 1 см, глубина пикселей/цветовые оттенки 8/256, 1 пиксель соответствует 10 мкм).

100 мкл аликвоты аллергенов распределяют по лункам титрометрического 96-луночного микропланшета с концентрацией ˜200 нг/мкл в споттинг-буфере (300 мМ фосфата натрия, рН 8,5). Оптимальные концентрации для иммобилизации аллергенов рассчитывают из данных титрования несколькими аллергенами в различных буферных растворах, а также на различных предметных стеклах. Анализируемые белки демонстрировали насыщение при концентрациях, равных или больших 100 нг/мкл, о чем свидетельствовал постоянно сильный белый сигнал при сканировании с использованием GMS сканера. При таких концентрациях характеристики связывания аллергенов не зависят от состава запасного, а также споттинг-буфера.

Пример 2:

SOPHIA (Твердофазный иммуносорбентный анализ)

После инкубации в течение ночи препараты, приобретенные у CEL Associates (альдегидные препараты) или полученные в комнатных условиях промывают в 1×TBST (10 мМ Трис рН 8,0/150 мМ NaCI/0,5% Tween 20) при интенсивном встряхивании в пробирке из Falcon при температуре окружающего воздуха. Для блокировки препараты переносят в раствор 1×TBST, содержащий 0,01% BSA, и выдерживают в течение 2 часов при температуре окружающего воздуха. После этого препараты в течение 15 минут промывают в 1×TBST и быстро всполаскивают дистиллированной водой.

Аллергенный массив инкубируют в присутствии разбавленной сыворотки (1:5 в 1×TBST) в течение (по меньшей мере) 60 минут при 37°С в условиях встряхивания. Тестируют образцы сыворотки с различной степенью разбавления в интервале 1:1-1:15. Наилучшие результаты обычно получают при разбавлении 1:5. 30 мкл разбавленной сыворотки добавляют к препаратам, используя камеру Press Seal Chambers от SIGMA Technologies. Работу камер проводят в соответствие с предписанием производителя. Анализы проводят после инкубации сыворотки в течение различных периодов времени, от 60 минут до инкубации в течение ночи. Однако длительная инкубация в присутствии сыворотки не приводила к увеличению интенсивности сигнала или специфичности. После инкубации с сывороткой препараты промывают 1×TBST (15 минут, температура окружающего воздуха) в условиях встряхивания.

Пять различных сывороток от аллергиков, которые исследовали методами традиционной диагностики (кожная проба на аллергию, RAST, ELISA), и сыворотка от пациента без симптомов аллергии были выбраны для стерильного теста аллергенного массива. Индивидуальные образцы сыворотки анализировали по меньшей мере дважды на аллергенных массивах из различных партий.

Флюоресцентно-меченое а IgE антитело, меченное флюоресцентным красителем AlexaFluor в соответствии с указаниями производителя (Molecular Probes), добавляют в аллергенный массив в растворе, содержащем 0,01% BSA/1×TBST и инкубируют в течение 60 минут при температуре окружающего воздуха. Используют рабочие разбавления антитела в интервале 1:1000-1:5000, в зависимости от продолжительности и интенсивности мечения. После иммунологического анализа препараты промывают 1 x TBST (15 минут, температура окружающего воздуха, встряхивание) и быстро всполаскивают дистиллированной водой.

После проведения иммуносорбентного анализа препараты оценивают с помощью GMS двухцветного сканера. Обычно наблюдались лишь незначительные изменения сигналов в различных анализах и при использовании различных препаратов. Однако фоновые значения менялись в зависимости от типа используемого препарата. Пример сканированного изображения аллергенного массива, анализируемого в присутствии сыворотки от пациента, страдающего аллергией, представлен на фиг.2. Этот пациент проявлял сильную реакцию на Phleum, клещей, Felis и пчел (см. фиг.1). Не наблюдались фоновые сигналы, связанные с неспецифическими взаимодействиями с буферными пятнами или аутоаллергенами. После завершения исследования сыворотки аллергика полученные результаты сравнивают с данными, предварительно полученными для идентичной сыворотки с использованием теста RAST. Результаты, полученные при использовании способа настоящего изобретения, хорошо согласовались с имеющимися сериями данных.

Пример 3:

Воспроизводимость теста сыворотки пациента С.

Сыворотку от пациента С трижды анализировали на индивидуально приготовленных аллергенных микроструктурах. Использовали описанную выше методику проведения эксперимента.

После завершения анализа препараты подвергали сканированию в идентичных условиях. Данные анализа обрабатывали с использованием компьютерной программы GenePix. Рассчитанные средние значения интенсивности сигналов для каждого аллергенного трипликата сравнивали между собой после трехкратного повторения опыта. Для окончательного анализа отбирали лишь те значения, которые соответствовали сигналам, по меньшей мере в 1,5 раза превышающим среднее значение сигналов от буферного пятна. В Таблице 1 приведены средние значения, стандартные отклонения и процент стандартного отклонения для релевантных сигналов.

Таблица 1 
Аллерген Тест 1 Тест 2 Тест 3 Среднее значение Стандартное отклонение % стандартного отклонения 
rBet v 1 20731 21325 25060 22372.00 1916.11 8.56 
rPhl p 2 17176 15529 14227 15644.00 1206.67 7.71 
rPhl p 4 36134 33511 29328 32991.00 2802.76 8.50 
rPhl p 5a 56600 53068 55594 55087.33 1485.77 2.70 
rPhl p 6 56244 51959 37625 48409.33 7882.14 16.28 
rPhl p 12 6291 7003 12289 8527.67 2675.50 31.37 
rPar j 2 7552 7678 9444 8224.67 863.73 10.50 
Art v 1a 6997 7931 11258 8728.67 1828.70 20.95 
Mugwort profilin 7901 7669 9260 8276.67 701.74 8.48 
Mal d 1 9890 15295 8176 11120.33 3033.74 27.28 
HSA 9868 8732 10708 9769.33 809.71 8.29 
Sheepal-bumin 9858 8295 10222 9458.33 835.92 8.84 
Horseal-bumin 9602 9061 10559 9740.67 619.37 6.36 
rAsp f 1 (b) 12216 10129 10781 11042.00 871.77 7.90 
rMal f 5 13459 11018 12035 12170.67 1001.14 8.23 
rAK 20680 14202 19978 18286.67 2902.48 15.87 


Среднее стандартное отклонение, рассчитанное из значений, полученных после проведения трех индивидуальных анализов, составило 12,36%. Полученный результат означает, что иммунологический анализ с использованием чипа, предназначенный для решения вопроса о наличии IgE в сыворотке крови пациента, характеризуется высокой воспроизводимостью. Это также следует из рассмотрения разброса данных на графиках, построенных по результатам тройного анализа 3, см. фиг.3а-3с, где фиг.3а изображает разброс точек корреляционной зависимости данных теста 1 от теста 3, фиг.3b изображает разброс точек корреляционной зависимости данных теста 2 от теста 3, а фиг.3с

разброс точек корреляционной зависимости данных теста 1 относительно Теста 2; символ А обозначает аллергены, a FI - интенсивность флюоресценции.

Пример 4:

Сравнение различных микроструктур

С целью тестирования оптимального препарата настоящего изобретения индивидуально приготовленные препараты оценивали с использованием ряда указанных ниже критериев:

- Способ получения: Приготовленные препараты оценивали по ряду параметров, включающих требования, касающиеся химической безопасности и длительность производства.

- Стоимость производства: Проводили сравнение стоимости препаратов, полученных в лабораторных условиях и приобретенных коммерческим путем.

- Способность к связыванию: Различные препараты оценивали по способности связываться с флюоресцентно меченым белком.

- Воспроизводимость: Проводили серийные эксперименты с использованием препаратов с различной предобработкой и оценку в соответствии с общими характеристиками анализа.

- Общий фон: До и после анализа на аллергию все препараты оценивали на систематический базовый фон, который способен уменьшать сигнал до значений относительной шумовой мощности.

- Пределы обнаружения: Производили оценку всех препаратов на минимальную концентрацию белка, которая может быть обнаружена в пятне при скрининге аллергенов.

- Толерантность к сыворотке: Обычно сыворотка пациента представляет собой сложную смесь белков, которая часто оказывает негативное влияние на результаты иммунологического анализа на основе микроструктур при использовании различных партий сыворотки пациентов.

- Блокировка: Все препараты оценивались на необходимость проведения стадии блокировки до проведения анализа на аллергию.

Хранение: Все препараты оценивались на длительность хранения после получения аллергенного чипа.

В Таблице 2 представлены результаты описанного выше оценочного исследования:



Таблица 2. В таблице представлены результаты оценочного исследования, описанного в тексте. (++) обозначает отличный результат, (+) - хороший, (-) - средний, (--) - плохой. Значок (/) обозначает, что в данной конкретной категории препараты не анализировались. (1) Препараты, содержащие функциональную поверхность с альдегидными группами. (2) Препараты, содержащие аминореактивную поверхность, точные химические свойства которой не известны. (3) Препараты, полученные в лабораторных условиях, содержащие функциональные группы, указанные в Таблице 2. (4) Препараты, содержащие мембрану для иммобилизации белков. ProteoBind - рабочее обозначение дериватизации поверхности, адаптированной для оптимального использования в диагностике аллергий с использованием микроструктур, и это название относится к применению (1-[3''-[триметоксисилил)пропил]-1'(4''-изотио-цианатофенил) тиомочевины), которую получали по методу, описанному Chen с сотр. (Nucleic Acids Research,199, vol.27, #2), причем на эту работу ссылаются в настоящей заявке как на уровень техники.

В соответствии с результатами оценочного исследования, представленными выше, ProteoBind был выбран как наилучший агент для дериватизации поверхности с целью получения аллергенных микроструктур.

Пример 5:

Сравнение определения иммуноглобулина в образце с иммобилизованными рекомбинантными аллергенами и с иммобилизованными экстрактами.

Для тестирования чувствительности и диагностической релевантной информации очищенных рекомбинантных аллергенов, иммобилизованных на микроструктуре и аллергенных экстрактов, иммобилизованных на микроструктуре, специфические аллергены из одного источника сравнивали с аллергенным экстрактом из того же источника.

После иммобилизации аллергенной композиции на микроструктуре различные образцы, содержащие указанную специфическую сыворотку, добавляют в микроструктуру и измеряют флюоресценцию, соответствующую количеству антител, связанных с аллергенами. Полученные результаты представлены в таблицах 3, 4 и 5, а также на фигурах 4а, 4b и 4с, где сокращение "FL" обозначает % флюоресценции. Из полученных результатов следует, что при использовании рекомбинантных аллергенов может быть осуществлено значительно более чувствительное обнаружение и количественное определение, чем в случае аллергенных экстрактов. Интенсивность флюоресценции одного рекомбинантного антигена явно выше интенсивности флюоресценции экстракта. Кроме этого, в отличие от детекции с помощью рекомбинантных аллергенов, при использовании экстракта может обнаруживаться только источник экстракта и отсутствует возможность обнаружения специфического антигена из источника, ответственного за аллергию.

В связи с этим способ настоящего изобретения, в котором используются отдельные очищенные аллергены, в особенности рекомбинантные аллергены, обладает очевидными преимуществами над способами с использованием экстрактов, содержащих аллергены.

Таблица 3 
График 1 Сыворотка 4-Sp Сыворотка 4-Sp Сыворотка 19-S Сыворотка 30-S 
Bet v 1a 52028 62529 62932 18847 
Bet v 1a Mut 6590 237 905 139 
Bet v 1d 1576 14352 252 89 
Bet v 2 2196 1408 273 1253 
ВР-экстракт 21013 39438 11390 3174 


Таблица 4 
График 2 Сыворотка 5-Sp Сыворотка 7-Sp Сыворотка 9-S Сыворотка 17-S Сыворотка 18-S Сыворотка 40-S 
Phl p I 45611 12148 21588 5838 23497 23424 
Phl p II 209 52043 814 2562 10984 14753 
Phl p V 64005 63481 62953 40770 63530 62029 
Phl - экстракт 63987 40318 14505 10183 44405 19798 
Таблица 5 
График 3 Сыворотка 11-Sp Сыворотка 16-Sp Сыворотка 39-S Сыворотка 40-S 
Hev b 3 416 387 108 235 
Hev b 5-Mal 350 519 30601 63897 
Hev b 8 11146 7977 134 853 
Heb b 9 460 631 105 188 
Hev b 10 360 429 73 152 
Латекс В-экстракт 264 202 80 3426 
Латекс С-экстракт 769 866 5343 30790 





ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


1. Способ обнаружения иммуноглобулина, способного связываться с аллергеном образце, включающий иммобилизацию одного или более аллергена на микроструктурном чипе, затем инкубацию образца в присутствии иммобилизованных аллергенов, при этом иммуноглобулины, обладающие специфичностью в отношении аллергенов, связываются со специфичными аллергенами, и затем обнаружение иммуноглобулинов, связанных со специфическими иммобилизованными аллергенами.

2. Способ по п.1, в котором в качестве иммуноглобулинов обнаруживают IgE.

3. Способ по п.1, в котором в качестве иммуноглобулинов обнаруживают IgG.

4. Способ по любому из пп.1-3, в котором на микроструктурном чипе иммобилизуют один или более очищенных аллергенов.

5. Способ по любому из пп.1-4, в котором на микроструктурном чипе иммобилизуют один или более рекомбинантных аллергенов.

6. Способ по любому из пп.1-5, в котором на микроструктурном чипе иммобилизуют один или более аллергенов, полученных синтетическим методом.

7. Способ по любому из пп.1-6, в котором в качестве аллергенов на микроструктурном чипе иммобилизуют один или более гаптенов.

8. Способ по любому из пп.1-7, в котором аллергены иммобилизуют в пятне на микроструктурном чипе, имеющем диаметр 10-2000 мкм, предпочтительно, 50-500 мкм, еще более предпочтительно 15-250 мкм.

9. Способ по любому из пп.1-8, в котором аллергены иммобилизуют на твердом носителе, используемом в качестве микроструктурного чипа.

10. Способ по любому из пп.1-8, в котором аллергены иммобилизуют на стекле и синтетическом носителе, соответственно используемых в качестве микроструктурного чипа.

11. Способ по любому из пп.1-8, в котором аллергены иммобилизуют на силиконовой пластинке, используемой в качестве микроструктурного чипа.

12. Способ по любому из пп.1-8, в котором аллергены иммобилизуют на мембране, используемой в качестве микроструктурного чипа.

13. Способ по любому из пп.1-12, в котором микроструктурный чип химически модифицируют, предпочтительно используя соответственно аминореактивную и карбоксиреактивную модификации.

14. Способ по любому из пп.1-13, в котором аллергены ковалентно связаны с микроструктурным чипом.

15. Способ по любому из пп.1-14, в котором в качестве образца для обнаружения иммуноглобулинов применяют сыворотку крови.

16. Способ по п.15, в котором сыворотку крови разбавляют в соотношении 1:1-1:15, предпочтительно, 1:5.

17. Способ по любому из пп.1-16, в котором образец инкубируют в присутствии аллергенов в течение времени от 1 мин до 24 ч, предпочтительно, в течение 1-2 ч.

18. Способ по любому из пп.1-17, в котором образец инкубируют в присутствии аллергенов при температуре 0-60°С, предпочтительно, при 37°С.

19. Способ по любому из пп.1-18, в котором связанные иммуноглобулины обнаруживают с помощью, по меньшей мере, одного меченого специфического иммуноглобулинового антитела.

20. Способ по п.19, в котором связанные иммуноглобулины детектируют с помощью, по меньшей мере, одного флуоресцентно меченого специфического иммуноглобулинового антитела.

21. Способ по п.19, в котором связанные иммуноглобулины детектируют с помощью, по меньшей мере, одного радиоактивно меченого специфического иммуноглобулинового антитела.

22. Способ по любому из пп.1-21, в котором в качестве аллергенов иммобилизуют один или более внутренних аллергенов.

23. Способ по любому из пп.1-21, в котором в качестве аллергенов иммобилизуют один или более внешних аллергенов.

24. Способ по любому из пп.1-21, в котором в качестве аллергенов иммобилизуют один или более пищевых аллергенов.

25. Способ по любому из пп.1-21, в котором в качестве аллергенов иммобилизуют один или более ядовитых аллергенов.

26. Способ по любому из пп.1-21, в котором в качестве аллергенов иммобилизуют один или более аутоаллергенов.

27. Способ in vitro диагностики аллергий у пациента, включающий взятие образца сыворотки крови пациента, анализ образца на наличие иммуноглобулинов, которые связываются с аллергенами, в соответствии со способом, охарактеризованном в пп.1-26, для чего используют микроструктурный чип, на котором иммобилизуют, по меньшей мере, 10, предпочтительно, по меньшей мере, 50 и более предпочтительно, по меньшей мере, 90 различных аллергенов, при этом положительная реакция между образцом и иммобилизованными аллергенами диагнозицируется как аллергия.

28. Микроструктурный чип, на котором иммобилизован один или более аллергенов.

29. Микроструктурный чип по п.28, в котором аллергены иммобилизуют на пятне диаметром 100-500 мкм, предпочтительно, 200-300 мкм.

30. Микроструктурный чип по п.28 или 29, который представляет собой стеклянный носитель.

31. Микроструктурный чип по п.28 или 29, который представляет собой синтетический носитель.

32. Микроструктурный чип по п.28 или 29, который представляет собой силиконовую пластинку.

33. Микроструктурный чип по п.28 или 29, который представляет собой мембрану.

34. Микроструктурный чип по п.28, который химически модифицирован предпочтительно путем аминореактивной или карбоксиреактивной модификации соответственно.

35. Микроструктурный чип по п.28, с которым ковалентно связаны аллергены.

36. Набор, отличающийся тем, что он содержит микроструктурный чип по любому из пп.28-35 и первый реагент, включающий, по меньшей мере, один реагент для обнаружения иммуноглобулина, предпочтительно иммуноглобулиновое антитело, предпочтительно в известной концентрации, и при необходимости второй реагент, используемый в качестве положительного образца, включающий, по меньшей мере, один иммуноглобулин, связывающийся с аллергеном.

37. Набор, охарактеризованный в п.36, предназначенный для осуществления способа, охарактеризованного в пп.1-27.