СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ САРКОМЫ КАПОШИ

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ САРКОМЫ КАПОШИ


RU (11) 2234097 (13) C1

(51) 7 G01N33/542, C12Q1/68 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 10.08.2007 - прекратил действие, но может быть восстановлен 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2004.08.10 
(21) Регистрационный номер заявки: 2003106131/15 
(22) Дата подачи заявки: 2003.03.05 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2003.03.05 
(45) Опубликовано: 2004.08.10 
(56) Аналоги изобретения: КАЗАНЦЕВА И.А. Саркома Капоши: этиология, патогенез, гистогенез, патоморфологическая диагностика. Рос. Журнал кожных и венерических болезней, 1998, № 1, с.6-9. RU 2177950 С2, 17.10.1997. US 6150093 А, 21.11.2000. US 5863787 А, 26.11.1999. MOORE et al. Primary characterization of herpesvirus agent associated with Kaposcis sarcoma. J. Virol, 1996, v.70, p.549-558. 
(72) Имя изобретателя: Молочков А.В. (RU); Казанцева И.А. (RU); Гурцевич В.Э. (RU); Молочков В.А. (RU); Шаталова О.А. (RU); Карташова М.Г. (RU) 
(73) Имя патентообладателя: Московский областной научно-исследовательский клинический институт (RU) 
(98) Адрес для переписки: 129110, Москва, ул. Щепкина, 61/2, МОНИКИ, патентная группа 

(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ САРКОМЫ КАПОШИ 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в дерматологии и онкологии. В способе диагностики саркомы Капоши, включающем микроскопическое исследование биоптата очага поражения, предложено исследовать биоптат в полимеразной цепной реакции (ПЦР) на наличие ДНК-последовательностей вируса герпеса человека 8-го типа. Дополнительно исследуют сыворотку крови методом непрямой иммунофлюоресценции (НИФ) при стандартных сериях разведения на наличие антител класса IgG к вирусу герпеса человека 8-го типа. При положительном значении ПЦР и любом показании НИФ, а также отрицательном значении ПЦР и положительном показании НИФ в разведении 1:120 и выше диагностируют саркому Капоши. Преимущество изобретения заключается в повышении точности диагностики на ранних стадиях заболевания. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в дерматологии и онкологии.

Известен способ диагностики саркомы Капоши (СК), включающий микроскопическое исследование патоморфологического строения биоптата очага поражения (Казанцева И.А. Саркома Капоши: этиология, патогенез, гистогенез, патоморфологическая диагностика. Рос. Ж-л кожных и венерических болезней. №1, 1998 г., с.6-9, прототип). Для выявления характерных гистологических признаков размер биоптата обычно составляет в диаметре не менее 1 см, о результатах исследования судят по наличию веретенообразных клеток, диффузной сосудистой пролиферации и иммуноклеточного инфильтрата. При невыявлении типичных гистологических признаков проводят иммуногистохимическое исследование биоптата.

Недостатком этого способа является сложность установления диагноза на ранних стадиях заболевания, в случаях ангиоматозного варианта саркомы Капоши, в случаях инвалюцирующих элементов и при проведении дифференциального диагноза с группой сосудистых пролифераций (псевдосаркома Капоши, кавернозная гемангиома и т.д.). Способ травматичен, при иммуногистохимическом исследовании требует дорогостоящих реактивов.

Задачей настоящего изобретения является устранение указанных недостатков за счет выявления маркеров этиологического агента саркомы Капоши, которые позволяют более точно и в ранние сроки установить диагноз и проводить его при всех вариантах гистологического строения элементов заболевания.

Для этого в способе диагностики саркомы Капоши, включающем микроскопическое исследование биоптата очага поражения, предложено исследовать биоптат в полимеразной цепной реакции (ПНР) на наличие ДНК-последовательностей вируса герпеса человека 8-го типа и дополнительно исследовать сыворотку крови методом непрямой иммунофлюоресценции (НИФ) при стандартных сериях разведения на наличие антител класса IgG к вирусу герпеса человека 8-го типа и при положительном значении ПЦР и любом показании НИФ, а также отрицательном значении ПЦР и положительном показании НИФ в разведении 1:120 и выше диагностировать саркому Капоши.

Совокупность предлагаемых исследований позволяет значительно повысить точность диагностики как на ранних стадиях саркомы Капоши, так и в случаях, сложных для патоморфологической верификации диагноза.

Осуществление способа показано на конкретных клинических примерах.

Пример 1.

Больной Ж., 68 лет, болен с 62-летнего возраста, когда на коже правой стопы заметил появление пятна красного цвета размером 0,3х0,5 см, не сопровождавшегося субъективными ощущениями. В течение года пятно увеличивалось в размере, появились новые очаги на левой голени, затем процесс распространился на стопы. Через три года после начала заболевания на коже левой голени стали появляться узелки полушаровидной формы красно-коричневого цвета. При поступлении: патологический процесс симметричный, представлен красно-синюшными пятнами и бляшками неправильной формы размером от 12 см до 57 см, которые располагались на обеих нижних конечностях, а также узелками полушаровидной формы диаметром от 0,5 до 1 см в области правой стопы. При УЗИ внутренних органов патологии не выявлено. Клинический диагноз - идиопатический тип саркомы Капоши, хроническая форма.

При гистологическом исследовании узелкового элемента: элемент опухоли представлен тонкостенными сосудистыми полостями, разделенными соединительно-тканными прослойками, располагающимися в ретикулярной дерме ассоциирующимися с придатками кожи и предсуществующими кровеносными сосудами. Сосудистые пространства заполнены эритроцитами.

Заключение: данные гистологического исследования не противоречат диагнозу саркомы Капоши, но подобные изменения могут наблюдаться и при кавернозной гемангиоме.

Для последующей верификации диагноза было проведено исследование биоптата очага поражения: выявление в образцах ДНК последовательностей вируса герпеса человека 8-го типа (предполагаемого этиологического агента саркомы Капоши) размером 233 п.н. проводили в ПЦР с использованием специфических праймеров KS 330233 (5'-AGCCGAAAGGANNCCACCAT-3' и 5'-TCCGTGTGTCTACGTCCAG-3'). ПЦР ставили в термосайклере РТС-200 фирмы MJ Research, Inc. Кроме того, сыворотка крови больного была исследована в реакции непрямой иммунофлюоресценции (нИФ) на наличие антител класса IgG к вирусу герпеса человека 8-го типа с определением их титра. Для исследования использовали клетки линии BCBL, продуктивно инфицированные этим вирусом. Реакцию нИФ ставили по методу Henle и Henle. Для чтения реакции использовали люминесцентный микроскоп фирмы “Орton” (Германия). Присутствие антител в исследуемой сыворотке определяли по ярко-зеленому свечению клеток на фоне негативных клеток, окрашенных в красновато-коричневый цвет. Титром сыворотки считали последнее разведение, дававшее свечение не менее 0,5% слабо светящихся клеток в препарате.

В результате проведенных исследований биоптата был получен ПЦР-положительный сигнал, в сыворотке крови обнаружены вирус-специфические антитела в титре 1:320.

На основании проведенных исследований больному был установлен диагноз идиопатического типа СК и проведена специфическая противоопухолевая терапия, позволившая добиться ремиссии патологического процесса.

Пример 2.

Больной Т., 72 лет, болен с 66-летнего возраста, когда отметил развитие плотного отека в области левой стопы и левого голеностопного сустава. В течение последующего года отек нарастал, появилось ограничение подвижности левого голеностопного сустава, в связи с чем обратился к хирургу по месту жительства. Получал местное лечение гелем троксевазина, компрессами с 30% ДМСО, но существенного эффекта не было. Через 3 года после начала заболевания отметил появление синюшных пятен неправильной формы размером от 0,30,3 до 12 см на коже обеих стоп и левой голени, что было расценено дерматологом как "трофические нарушения" и к лечению добавлены ксантинола никотинат, инъекции витамина В6. Патологический процесс постепенно прогрессировал: пятна увеличивались в размерах, кожа в области отека приобрела бугристость, стала диффузно-инфильтрированной, синюшно-фиолетового цвета. Через 5 лет после начала заболевания обратился в клинику дерматовенерологии и дерматоонкологии МОНИКИ.

При поступлении на фоне отеков стоп и нижней трети левой голени имеются множественные пятна и бляшки синюшно-буроватой окраски с четкими границами диаметром от 2 до 5 см. На поверхности бляшек выражен гиперкератоз. При ультразвуковом обследовании внутренних органов патологии не выявлено.

При гистологическом исследовании биоптата очага поражения была выявлена диффузная пролиферация капилляров вокруг предсуществующих сосудов. При иммуногистохимическом исследовании выраженная экспрессия CD31. Заключение: изменения могут соответствовать саркоме Капоши или псевдосаркоме Капоши.

При исследовании биоптата очага поражения в ПЦР получен ПЦР-отрицательный сигнал; при исследовании сыворотки крови в нИФ выявлены вирус-специфические антитела в титре 1:640.

На основании данных молекулярно-биологического исследования больному установлен диагноз саркомы Капоши и проведено специфическое лечение, позволившее добиться выраженного клинического эффекта.

Пример 3.

Больной К., 63 лет, болен с 53-летнего возраста, когда на коже правой стопы заметил появление пятна красного цвета диаметром около 1,0 см, без субъективных ощущений. В течение последующих трех лет процесс медленно прогрессировал: пятно увеличивалось в размере, появились плотный отек правой стопы и новые пятна на левой стопе и в области голеностопных суставов. Через шесть лет после начала заболевания на коже левой стопы впервые заметил возвышающиеся над уровнем кожи бляшки. Через 8 лет после начала заболевания обратился в клинику дерматовенерологии и дерматоонкологии МОНИКИ.

При поступлении патологический процесс распространенный и симметричный, был представлен красно-фиолетовыми пятнами и бляшками неправильных очертаний размером от 12 см до 57 см, располагающимися на обеих нижних конечностях, а на левой стопе и голени узелками полушаровидной формы диаметром 0,5-1 см, некоторые из которых изъязвлялись. Поражение кожи стоп сопровождается плотным отеком мягких тканей, кожа над областью отека инфильтрирована, бледно-фиолетовой окраски, местами с мелкопластинчатым шелушением.

При ультразвуковом обследовании внутренних органов патологии не выявлено.

Клинический диагноз: саркома Капоши, идиопатический тип, хроническая форма.

При гистологическом исследовании биоптата очага поражения была выявлена диффузная пролиферация капилляров, не позволяющая установить нозологический диагноз.

При исследовании биоптата очага поражения в ПЦР получен ПЦР-положительный сигнал; при исследовании сыворотки крови в нИФ вирус-специфические антитела не выявлены.

На основании данных молекулярно-биологического исследования больному установлен диагноз саркомы Капоши и проведено специфическое лечение, позволившее добиться выраженного клинического эффекта.

Пример 4.

Больной X., 32 лет, обратился в клинику дерматовенерологии и дерматоонкологии МОНИКИ с жалобами на множественные высыпания в области нижних конечностей. Болен около 2 лет, со времени появления на своде стопы пятна красного цвета размером 0,7 см, субъективно не беспокоившего больного. В течение 3 последующих месяцев такие же пятна появились в области обеих стоп и голеней. К врачу не обращался, ни чем не лечился. В дальнейшем размер очагов медленно увеличивался.

При осмотре кожные покровы бледные. Патологический процесс распространенный с локализацией на стопах и голенях представлен пятнами размером от 22 см до 57 см синюшно-розового цвета.

При ультразвуковом обследовании внутренних органов патологии не выявлено. Клинический диагноз: саркома Капоши, идиопатический тип, хроническая форма.

При гистологическом исследовании биоптата очага поражения: разветвленная сеть капилляров в верхней части дермы с бледноокрашенным эндотелием обычного вида. Вокруг скоплений новообразованных капилляров незначительный инфильтрат из лимфоцитов. Заключение: процесс необходимо дифференцировать между саркомой Капоши и псевдосаркомой Капоши.

При исследовании биоптата очага поражения в ПНР получен ПЦР-отрицательный сигнал; при исследовании сыворотки крови в нИФ вирус-специфические антитела не выявлены.

На основании данных молекулярно-биологического исследования больному установлен диагноз псевдосаркомы Капоши. Дальнейшее лечение по поводу сопутствующей артериовенозной недостаточности привело к полному разрешению высыпаний.

Предлагаемый способ позволяет устанавливать диагноз на ранних стадиях заболевания, что повышает эффективность лечения и уменьшает время его проведения, снижает вероятность диагностических ошибок. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



Способ диагностики саркомы Капоши, включающий микроскопическое исследование биоптата очага поражения, отличающийся тем, что исследуют биоптат в полимеразной цепной реакции (ПЦР) на наличие ДНК-последовательностей вируса герпеса человека 8-го типа и дополнительно исследуют сыворотку крови методом непрямой иммунофлюоресценции (нИФ) при стандартных сериях разведения на наличие антител класса IgG к вирусу герпеса человека 8-го типа и при положительном значении ПЦР и любом показании нИФ, а также при отрицательном значении ПЦР и положительном показании нИФ в разведении 1:120 и выше диагностируют саркому Капоши.