СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА (ВАРИАНТЫ)

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА (ВАРИАНТЫ)


RU (11) 2200327 (13) C2

(51) 7 G01N33/543, G01N33/571 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 10.08.2007 - прекратил действие 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2003.03.10 
(21) Регистрационный номер заявки: 99124840/14 
(22) Дата подачи заявки: 1999.11.25 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 1999.11.25 
(45) Опубликовано: 2003.03.10 
(56) Аналоги изобретения: ОВЧИННИКОВ Н.М. и др. Лабораторная диагностика заболеваний, передающихся половым путем. - М.: 1987. RU 2138813 C1, 27.09.1999. RU 2139539 C1, 10.10.1999. RU 2137138 C1, 10.09.1999. ЕР 0139373 A1, 02.05.1985. WO 97/13151 A1, 10.04.1997. ДМИТРИЕВ Г.А. Тест-системы в лабораторной диагностике сифилиса. - Вестник дерматологии и венерологии, 1996, №6, с.34-37. 
(71) Имя заявителя: Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт 
(72) Имя изобретателя: Базиков И.А.; Тюменцева И.С.; Ефременко В.И.; Афанасьев Е.Н.; Жарникова И.В. 
(73) Имя патентообладателя: Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт 
(98) Адрес для переписки: 355106, г. Ставрополь, ул. Советская, 13-15, СтавНИПЧИ 

(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА (ВАРИАНТЫ) 

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологическим методам исследования. Способ может быть осуществлен методом иммуноферментного или количественного иммунофлюоресцентного анализа с использованием ультраозвученного афинно-очищенного поливалентного трепонемного антигена, который инкубируют с исследуемой сывороткой. Способ характеризуется использованием твердофазного носителя, а именно модифицированного полиглюкином композиционного алюмосиликатного магноиммуносорбента. Предлагаемые варианты способа позволяют повысить чувствительность и специфичность диагностики, сократить время и трудоемкость анализа. 2 с.п. ф-лы. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к микробиологическим методам исследования и может быть использовано при диагностике сифилиса методами иммуноферментного анализа (ИФА) и количественного иммуноферментного анализа (КИФА).

Сложность диагностики сифилиса обусловлена свойствами возбудителя заболевания - спирохеты Treponema pallidum, которая плохо культивируется на питательных средах in vitro и не окрашивается при микроскопии. В настоящее время разработан ряд методов для идентификации инфекционного процесса на разных стадиях. Существующие лабораторные тесты можно разделить на несколько групп: прямая визуализация бледных трепонем при наличии очагов поражения; нетрепонемные тесты, используемые для отбора; трепонемные подтверждающие тесты.

При прямой визуализации микроорганизмов и реакции связывания комплемента (РСК) с использованием в качестве антигена кардиолипина, зачастую наблюдаются ложноотрицатильные и ложноположительные результаты, особенно при наличии побочных инфекционных заболеваний.

В последнее время активно внедрен н диагностику сифилиса метод ИФА с использованием в качестве антигенов как патогенных, так и непатогенных трепонем. Известны коммерческие ИФА тест-системы зарубежного и отечественного производства с набором материалов и реагентов, необходимых для постановки реакции, учет которой проводится в двух вариантах автоматически и визуально. Результаты испытаний этих тест-систем на различных стадиях и формах заболевания показали значительные возможности повышения чyвcтвитeльнocти и специфичности диагностики сифилиса (Г.А.Дмигрисв, Е.Е.Брагина, Современные методы лабораторной диагностики сифилиса. Вестник дерматологии и венерологии, 2, 1996, с. 29-30, там же, 3, 1996, с. 33-34).

Однако при различных формах заболевания чувствительность и специфичность методов неоднозначны, проблематична дифференциация антител при ряде аутоиммунных заболеваний.

Чувствительность и специфичность ИФА обусловлены не только степенью чистоты используемых ингредиентов, но и свойствами твердой фазы, которая должна сохранять иммунологические свойства и стабильность иммобилизованных лигандов, обладать минимальной способностью неспецифически связывать компоненты анализируемой системы и быть удобной при разделении фаз.

При использовании в качестве иммуносорбента наиболее широко распространенных полистироловых микропланшет возникают проблемы с их недостаточной сорбционной способностью или наличием эллюирующих несвязанных антител (антигенов), приводящие к снижению специфичности и чувствительности метода.

Чувствительность иммуноанализа также определяется чистотой и активностью используемых антигенов (АГ) и антител (AT). (Иммуноферментный анализ: современное состояние и тенденции развития. Обзорная информация. Серия "Медицинская генетика и иммунология" В.И.Покровский и др., вып. 3, М., 1986, с. 4-5).

Известен способ диагностики сифилиса иммунофлюоресцентным методом, согласно которому с целью повышения чувствительности метода в случаях врожденного заболевания, при серорезистентных формах в качестве сорбента на предметное стекло наносят ультраозвученный трепонемный антиген, а из исследуемой сыворотки выделяют иммуноглобулин М. (Mullеr F., Immun. Infeet., 1977, р. 109-113).

Способ недостаточно надежен при низком содержании в сыворотке крови противотрепонемных антител, а также недостаточно экспрессен.

В результате установления того факта, что сенсибилизация нейтрофилов периферической крови к трепонемному антигену вызывает выраженные изменения клеточной поверхности и внутриклеточных структур, предложены тестированные признаки повреждения нейтрофилов при воздействии на них ультраозвученной бледной трепонемой для дифференциальной диагностики заболеваний в ранней стадии (а.с. СССР 833206, A 61 B 10/00, G 01 N 38/16, от 30.05.81, Бюл. 20).

Применение этого способа в клинических лабораториях при массовых обследованиях достаточно сложно.

При выявлении малых количеств патогенных микроорганизмов в исследуемых материалах используют метод избирательной сорбции микробов на иммуносорбенте с последующей их иммунофлюоресцентной и иммуноферментной индикацией. Получение иммуносорбентов осуществляется следующими методами: физической адсорбцией АГ или AT на эритроцитах, частицах целлюлозы, сефарозы и др.; химическими реакциями присоединения белковых молекул AT, полисахаридно-протеиновых молекул АГ к твердофазным сорбентам; поликонденсацией белковых молекул AT или белковых, липополисахаридных молекул АГ с помощью глютаральдегида, этилхлорформиата, борофторида, родаминизотиоцианата В, диазолил-черного С и других, веществ (В.М.Никитин, Справочник методов иммунологии, Кишинев, 1982, с.233-235).

Представляет интерес интенсивно развивающийся в области эпидемиологического мониторинга объектов внешней среды способ селективного концентрирования микроорганизмов на поверхности магноиммуносорбентов (МИС). При этом решается задача выявления возбудителя инфекции при низкой концентрации в исследуемом материале. Разработаны устройства и приспособления для манипуляций с МИС, начиная с отбора, транспортировки, хранения проб, переноса МИС, до проведения иммунологической реакции (Патент РФ 2098828, G 01 N 33/553, С 12 М 1/00, от 10.12.97, Бюл. 34).

Известна иммуноферментная диагностическая тест-система для выявления вируса гепатита А с использованием в качестве твердого носителя магносорбентов, сенсибилизированных антигепатитными (А) иммуноглобулинами (Патент РФ 2065164, G 01 N 33/53, от 10.08.96, Бюл. 22).

Достоинствами этой тест-системы по сравнению с традиционным методом ИФА является возможность выявить наличие вируса при его дискретном поступлении и малой концентрации, селективно концентрировать вирусы непосредственно из выделений больных или других загрязненных проб и сократить время проведения анализа с 4 до 1 часа за счет поэтапного переноса МИС.

Сдерживающими факторами использования МИС в диагностических тест-системах являются технологические трудности их производства.

В известных способах эпидемиологического мониторинга и диагностики вируса гепатита А используют МИС на основе полиакриламидных гранул, которые получают методом эмульсионной полимеризации смеси сомономеров полиакриламида и катализатора с магнитным порошком с последующими активацией поверхности магносорбентов глутаровым альдегидом в течение 18-20 часов и обработкой раствором альбумина в течение 1-3 часов (Патент РФ 2068703, А 61 К 39/395, С 12 N 11/00//G 01 N 33/53, от 10.11.96, Бюл. 31).

Длительность и многостадийность процесса с использованием дорогостоящих импортных токсичных реактивов сдерживает организацию производства МИС. К тому же глутаровый альдегид гидролизуется в вoднoй среде, что приводит к неспецифической сорбции и снижению стабильности в биоспецифических процессах.

Известен способ получения иммуносорбента, в котором в качестве носителя используется силохром, обработанный аминопропилтриэтоксисиланом и активированный n-бензохиноном, с последующей иммобилизацией аминоацилазы и дополнительной стабилизирующей обработкой раствором глиоксала. А.С. СССР 1060676, С 12 N 11/14; C 12 N 9/78, от 15.12.83, Бюл. 46).

Способ не предусматривает получение иммуносорбента с магнитными свойствами.

Наиболее близкой к заявляемому способу является иммуноферментная тест-система для выявления антител к возбудителю сифилиса в сыворотке крови человека (Овчинников Н. М., Беднова В.Н., Делекторский В.В. Лабораторная диагностика заболеваний, передающихся половым путем. - М., 1987. - 303 с.).

Диагностическая тест-система осуществляется следующим образом. В лунки полистироловых планшет, сенсибилизированных ультраозвученным антигеном из патогенных бледных трепонем, вносят исследуемую сыворотку, параллельно контрольные растворы и ингибируют в течение 30 минут при 37oС, отмывают, вносят конъюгат ферментный антиивидовой и выдерживают в термостате в течение 30 минут, промывают лунки и вносят субстрат - индикаторный реагент, планшет выдерживают в течение 1 часа при комнатной температуре в затемненном месте. Учет результатов реакции проводят по изменению окраски субстратной смеси.

Достоинства диагностической тест-системы по прототипу проявляются в повышении ее чувствительности за счет ферментного конъюгата, способного выявлять в сыворотке крови больных сифилисом антитела к Тrероnеmа Pallidum, которые аффинно взаимодействуют с высокоспецифичными клеточными структурами трепонемного антигена, сорбированного на поверхности полистиролового планшета.

Однако иммуносорбент, которым является сенсибилизированная антигеном полистироловая планшета, не обладает достаточной для надежной индикации микроорганизмов в малых количествах сорбционной емкостью. Кроме того, повышенная концентрация иммуноглобулинов на твердой фазе приводит к адсорбции свободносвязанных антител, которые элюируют на последующих стадиях инкубирования и отмывки и тем самым снижают чувствительность и специфичность диагностики. Процесс сорбции обратим, поэтому сенсибилизированные антигеном планшеты не подлежат долгому хранению (срок их хранения 20 дней на холоде в условиях герметизации).

ИФА тест-система не обеспечивает достаточной экспрессности диагностики, необходимой для массовых обследований. Продолжительность анализа без учета подготовительных мероприятий составляет более 2 часов.

Целью изобретения является повышение чувствительности и специфичности диагностики на всех стадиях заболевания сифилисом, обеспечение надежности выявления инфекции при малом содержании антител в исследуемой сыворотке больного, сокращение времени анализа и снижение его трудоемкости.

Поставленная цель достигается двумя вариантами: ИФА и КИФА. По первому варианту, ИФА включает сенсибилизацию твердофазного носителя ультраозвученным аффинно-очищенным поливалентным трепонемным антигеном, инкубацию его с исследуемой сывороткой, а затем с моноклональными антивидовыми иммуноглобулинами пероксидазными с последующим нанесением субстрат-индикаторного реагента и промежуточные отмывки носителя при поэтапном переносе твердофазного носителя и учет результатов реакции.

По второму варианту, КИФА включает сенсибилизацию твердофазного носителя ультраозвученным аффинно-очищенным поливалентным трепонемным антигеном, инкубацию его с исследуемой сывороткой, а затем с иммуноглобулинами, люминесцирующими против глобулинов человека, и промежуточные отмывки носителя при поэтапном переносе твердофазного носителя и учет результатов реакции.

По отношению к прототипу заявляемый способ диагностики, по первому варианту, имеет следующие отличительные признаки. Использование в качестве твердофазного носителя магноиммуносорбентов, сенсибилизированных трепонемным антигеном, обеспечивает селективное концентрирование на них антител против инфекции, в том числе при их малой концентрации в исследуемом материале.

Выбор органокремнеземного сорбента - алюмосиликата с рыхлой структурой и хорошо развитой поверхностью обеспечивает в процессе гелеобразования с декстраном достаточно стабильное внедрение магнитных частиц в структуру сорбента и большую реакционную поверхность и сорбционную емкость. В совокупности с использованием для иммобилизации высокоспецифичного трепонемного антигена и конъюгата иммунопероксидазного моноклонального против глобулинов человека для образования иммунного комплекса предлагаемые твердофазные носители обеспечивают повышение надежности, чувствительности и специфичности диагностики. Возможность поэтапного переноса твердофазного носителя в исследуемый материал, конъюгирующий и субстратные реагенты, в промывочные растворы за счет их магнитных свойств обеспечивает сокращение времени анализа и снижение трудоемкости.

Кроме того, используемые композиционные магноиммуносорбенты (КМИС) при их лиофильном высушивании гораздо стабильнее в хранении, чем полистироловые планшеты.

Способ получения КМИС заключается в следующем: смесь, состоящую из 2,5 г алюмосиликатного наполнителя и 0,5 г магнитного порошка, суспендировали в 40 мл 0,2-0,4%-ного водного раствора полиглюкина и далее выдерживали при комнатной температуре один час. Полученный сорбент высушивали при 100-110oС в течение 30 минут. К одному грамму полученного препарата добавляли 12 мл 23%-ного раствора хлорида натрия и 1 мл вторичного алкилсульфата натрия. Смесь инкубировали 1-2 часа при температуре 37oС, затем сорбент отмывали 100 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида и 100 мл дистиллированной воды. К 0,1 г активированною сорбента приливали 1 мл УЗТА с содержанием белка 3,5 мг/мл. Смесь оставляли при 37oС в течение одного часа. Далее надосадочную жидкость удаляли, а носитель промывали 0,9%-ным раствором натрия хлорида до "0" экстинции на спектрофотометре. Магноиммуносорбенты подвергали лиофилизации.

Полученные композиционные алюмосиликатные магноиммуносорбенты представляли собой высокодисперсные микрогранулы неправильной формы с ярко выраженными магнитными свойствами, обладающие хорошей смачиваемостью и эффективным оседанием в растворе, отсутствием склонности к конгломерации. Сорбенты имели размеры гранул от 20 до 100 мкм. Среднее значение их удельной поверхности 117 м/г, средний радиус пор 35 нм, объем пор - 1,7 см/г.

Способ диагностики сифилиса осуществляют следующим образом: по первому варианту - во флаконы (типа пенициллиновых) вносили по 0,1 мл 10%-ной взвеси Треп-КМИС. Зачем в опытные флаконы вносили по 0,2 мл исследуемых сывороток, во флаконы с отрицательным контролем - 0,2 мл фосфатно-солевого буферного раствора (ФСБ), во флаконы с положительным контролем - 0,2 мл положительно реагирующей сыворотки. Через 20-30 мин инкубации при температуре 37oС после тщательной промывки гранул сорбента с помощью постоянного магнита во все флаконы (опытные и контрольные) вносили по 0,2 мл конъюгата иммунопероксидазного моноклонального против глобулинов человека в рабочем разведении. Через 20-30 минут после отмывки гранул во флаконы вносили по 0,2 мл субстрат-индикаторного раствора (на 10 мл цитратного буферного раствора 10 мг орто-фенилендиамина и 40 мкл 33%-ной перекиси водорода). Реакцию останавливали внесением во флаконы 0,05 мл 2М серной кислоты. Учет результатов проводили визуально через 1-5 минут. При положительном результате происходило оранжево-коричневое окрашивание, при отрицательном раствор ингредиентов реакции оставался бесцветным. Для учета результатов на сканирующем устройстве "Мультискап" содержимое флаконов после остановки реакции переносили в микропланшеты и снимали показания прибора при 492 нм. Положительным считали пробы, показатели цвета которых в 1,5 и более раз превышали контрольные.

Таким образом, магноиммуносорбенты при контакте со специфическими антителами осуществляли динамическое, селективное их концентрирование, образуя иммунный комплекс, в дальнейшем определяемый пероксидазной реакцией.

Сравнительную оценку эффективности и чувствительности разработанной тест-системы проводили с 539 сыворотками крови больных различными формами сифилиса: до лечения, в процессе и по окончании лечения. Треп-КМИС при серодиагностике сифилиса в ИФА на 0,9% выше по полному расхождению результатов и на 2,3% - по степени позитивности теста по сравнению с ультраозвученным трепонемным антигеном в реакции связывания комплемента (РСК). В том числе, при первичном серонегативном сифилисе полное расхождение результатов в пользу Треп-КМИС составило 8,3% случаев, а при сифилисе первичном серопозитивном - 1,8% случаев.

При исследовании 230 сывороток больных сифилисом в процессе и по окончании лечения удалось установить, что позитивность теста при использовании Треп-КМИС в ИФА выше на 4,3% случаев по сравнению с РСК и на 1,7% выше по полному расхождению результатов.

Контрольной группой служили сыворотки крови 209 лиц, свободных oт сифилитической инфекции. Установлена специфичность теста 99,7%, в то время как исследуемые сыворотки в РСК с УЗТА были специфичны в 99,2% случаев.

Способ диагностики сифилиса по второму варианту (КИФА) во флаконы (типа пенициллиновых) вносили по 0,1 мл 10% взвеси Треп-КМИС. Затем в опытные флаконы вносили по 0,2 мл исследуемых сывороток, во флаконы с отрицательным контролем - 0,2 мл фосфатно-солевого буферного раствора (ФСБ), во флаконы с положительным контролем - 0,2 мл положительно реагирующей сыворотки. Через 20-30 минут инкубации при температуре 37oС после тщательной промывки гранул сорбента с помощью постоянного магнита во все флаконы (опытные и контрольные) вносили по 0,2 мл иммуноглобулинов, люминесцирующих против глобулинов человека. Инкубировали 30 минут, отмывали ЗФР трижды и один раз в дистиллированной воде, переносили содержимое флаконов на стекло и проводили учет результатов.

Количественный учет интенсивности флуоресценции гранул магнитных сорбентов осуществляли с помощью люминесцентного микроскопа с фотометрической насадкой. Разницу свечения гранул и фона, определяемую с помощью зонда, последовательно наведенного на гранулы сорбента, и промежуток между ними выражали в относительных единицах и принимали за величину, характеризующую интенсивность флуоресценции гранул. Положительным результатом считали разницу в интенсивности флюоресценции гранул магнитных сорбентов и контрольных проб более чем в два раза.

Таким образом, преимущества заявляемого способа диагностики в сопоставлении с коммерческими тест-системами для диагностики сифилиса проявляются в повышении чyвcтвитeльнocти на 1,5-1,7%, специфичности на 0,4-0,6%. Время анализа сокращено с 2 до 1 часа. Используемые КМИС позволят организовать выпуск высокочувствительных и специфичных тест-систем для диагностики сифилиса методами ИФА и КИФА. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



1. Способ диагностики сифилиса методом иммуноферментного анализа (ИФА), включающий сенсибилизацию твердофазного носителя ультраозвученным аффинно-очищенным поливалентным трепонемным антигеном, инкубацию его с исследуемой сывороткой, а затем с антивидовыми моноклональными иммуноглобулинами пероксидазными, нанесение субстрат-индикаторного реагента и промежуточные отмывки носителя с последующим учетом результатов реакции, отличающийся тем, что в качестве твердофазного носителя используют модифицированный полиглюкином композиционный алюмосиликатный магноиммуносорбент, который помещают во флаконы, куда последовательно вносят исследуемую сыворотку, конъюгирующий реагент, субстрат-индикаторный раствор, совершая при этом промежуточные отмывки гранул сорбента с помощью постоянного магнита, при этом положительными считают пробы, в которых происходит оранжево-коричневое окрашивание, отрицательными - где раствор остается бесцветным.

2. Способ диагностики сифилиса методом количественного иммунофлюоресцентного анализа (КИФА), включающий сенсибилизацию твердофазного носителя ультраозвученным афинно-очищенным поливалентным трепонемным антигеном, инкубацию его с исследуемой сывороткой, а затем с люминесцирующей античеловеческой сывороткой, промежуточные отмывки носителя с последующим учетом результатов реакции, отличающийся тем, что в качестве твердофазного носителя используют модифицированный полиглюкином композиционный алюмосиликатный магноиммуносорбент, который помещают во флаконы, куда последовательно вносят исследуемую сыворотку, люминесцирующую античеловеческую сыворотку, совершая при этом промежуточные отмывки гранул сорбента с помощью постоянного магнита, после чего переносят содержимое флаконов на стекло и проводят количественный учет интенсивности флуоресценции гранул магнитных сорбентов с помощью люминесцентного микроскопа с фотометрической насадкой, при этом положительным результатом считают разницу в интенсивности флюоресценции гранул магнитных сорбентов и контрольных проб более чем в два раза.