СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ЛИПОФИЛЬНОЙ И ГИДРОФИЛЬНОЙ ФРАКЦИЙ ПЛАЦЕНТЫ СВИНОЙ

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ЛИПОФИЛЬНОЙ И ГИДРОФИЛЬНОЙ ФРАКЦИЙ ПЛАЦЕНТЫ СВИНОЙ


RU (11) 2237486 (13) C1

(51) 7 A61K35/50 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 17.09.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2004.10.10 
(21) Регистрационный номер заявки: 2003124738/15 
(22) Дата подачи заявки: 2003.08.07 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2003.08.07 
(45) Опубликовано: 2004.10.10 
(56) Аналоги изобретения: UA 15241 С2, 15.09.2000. GB 1082782 Al, 13.09.1967. US 4054648 А, 18.10.1977. US 6183987 А, 06.02.2001. JP 6234798 Al, 23.08.1994. JP 3141299 А1, 17.06.1991. RU 2036651 С1, 09.06.1995. RU 2066189 С1, 10.09.1996. 
(72) Имя изобретателя: Шабунин С.В. (RU); Востроилова Г.А. (RU); Мещеряков Н.П. (RU); Курило Николай Федорович (UA); Конев Владимир Федорович (UA); Гребенщиков Виктор Ефимович (UA); Бондарь Лариса Александровна (UA); Филатов Владимир Антонович (UA); Осецкий Александр Иванович (UA); Федченко Юрий Григорьевич (UA); Осецкая Мария Александровна (UA); Лысенко Татьяна Михайловна (UA) 
(73) Имя патентообладателя: Закрытое акционерное общество научно-производственное предприятие "Агрофарм" (RU) 
(98) Адрес для переписки: 394087, г.Воронеж, ул. Ломоносова, 114б, ЗАО НПП "Агрофарм", директору П.А. Паршину 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ЛИПОФИЛЬНОЙ И ГИДРОФИЛЬНОЙ ФРАКЦИЙ ПЛАЦЕНТЫ СВИНОЙ 
Изобретение относится к медицине, ветеринарии и косметологии. Способ заключается в том, плаценту отмывают, фрагментируют, подвергают замораживанию парами жидкого азота до температуры (-80)-(-120)С, проводят измельчение в криомельнице при охлаждении парами жидкого азота до температуры (-80)-(-120)С до размера частиц 20-30 мкм, полученный порошок лиофилизируют при температуре (-10)-(-20)С до размера частиц 20-30 мкм и при давлении не выше 0,1 мм рт.ст. липофильную фракцию экстрагируют с помощью хладоновых растворителей под давлением 6-8 атм и температуре 30-35С, а гидрофильную фракцию получают экстрагированием с помощью изотонического водного раствора хлорида натрия при температуре 25-30С в течение 3-4 часов. Технический результат: способ обеспечивает разделение фракций плаценты свиной с сохранением их нативной структуры и уменьшением посторонних примесей, а также максимальный выход биологически активных веществ и усиление их специфической биологической активности. 5 табл. 



ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Изобретение относится к области ветеринарии, медицины, косметологии.

Прототипом изобретения является способ переработки плаценты, включающий измельчение, экстракцию с помощью органических реагентов и разделение экстракта на фракции с применением раствора хлорида натрия, отличающийся тем, что экстракцию проводят 10-18-кратным объемом хлороформа и этанола в соотношении 1:2, а разделение экстракта на фракции проводят путем введения 0,1-0,2-кратного объема 0,1-0,15 раствора хлорида натрия, после чего из хлороформной фракции упариванием получают липидный комплекс, а из водно-этанольной фракции после упаривания и сушки получают концентрат аминокислот и пептидов. /Патент UA 15241, МПК 6 А 61 К 35/50, дата публикации формулы изобретения 15.09.2000. Бюл. №4, 2000 г./.

Недостатками данного способа являются:

- невозможность полного разделения липофильной и гидрофильной фракций;

- экстракция органическими растворителями ведет к химическому взаимодействию с биологически активными компонентами плаценты вызывая их деструктивные изменения и снижая биологическую активность;

- невозможность полного удаления органических растворителей ведет к побочным токсическим воздействиям на организм.

Технический результат изобретения - разделение фракций плаценты свиной, с сохранением их нативной структуры и уменьшением посторонних примесей.

Технический результат достигается использованием современной технологии переработки тканей плаценты свиной по следующей методике.

1. Криоконсервирование тканей плаценты свиной.

Свиную плаценту промывают проточной водой, фрагментируют и подвергают быстрому замораживанию в парах жидкого азота до температуры (-80)-(-120)С со скоростью 30 градусов в минуту.

2. Криоизмельчение и криосублимирование тканей плаценты свиной.

Криоизмельчение плаценты свиной ведут на криомельнице при охлаждении парами жидкого азота до температур (-80)-(-120)С. Степень измельчения ткани составляет 20-30 мкм. Полученный порошок из тканей плаценты подвергают лиофилизации при температурах в диапазоне (-10)-(-20)С и давлении в камере не выше 0,1 мм рт. ст. в течение 16-20 часов. В результате получают порошок с влажностью 3-5%.

3. Извлечение липофильной фракции из модифицированного порошка плаценты свиной.

Экстрагирование лиофилизированного порошка плаценты свиной производят на установке низкотемпературной экстракции с помощью хладона, который абсолютно инертен к извлекаемой фракции. (Использование хладонов в качестве экстрагентов обусловлено выдерживанием приемлемых технологических параметров - температур, давлений. Выполнение тех же технологических операций с иными экстрагентами, например углекислотой, связаны с рядом технических трудностей. Так, использование углекислоты в качестве экстрагента позволяет проводить процесс экстракции в зоне температур от -40С до +31С и давлении 70-75 атм, что технически крайне сложно. Кроме того, при взаимодействии с водой двуокись углерода образует угольную кислоту, которая повышает кислотное число липофильной фракции /Молчанов Г.И. Интенсивная обработка лекарственного сырья. - М.: Медицина, 1981. - 208 с./ Хладоны инертны к большинству химических реагентов так как представляют собой фтор, хлор, предельные углеводороды и устойчивы к большинству факторов внешней среды и изменениям температуры (Полинг А. Общая химия. - М.: Мир, 1974. - С.209). Жидкий хладон подается из напорных емкостей под давлением 6-8 атм и температуре 30-35С в экстратор №1, где находится предварительно высушенный порошок. Растворитель проходит через слой сублимированного порошка плаценты свиной и извлекает из нее жирорастворимые вещества, затем через фильтр тонкой очистки сливается в испаритель. В испарителе за счет уменьшения давления до атмосферного, учитывая низкую температуру кипения хладонов (-20)–(-40)С и их летучесть, удается полностью удалить растворитель (он направляется на регенерацию и повторное использование). В результате данной стадии удается получить чистый липофильный комплекс, сохраняя стабильность извлекаемых веществ и их нативный комплекс. Выход липофильной фракции составляет 2-3% от загружаемого лиофилизированного порошка. Липофильная фракция представляет собой коричнево-бурую массу, размягчающуюся при комнатной температуре. Хранят ее в морозильной камере при температуре -18С.

4. Извлечение гидрофильной фракции.

Выделение гидрофильного комплекса плаценты свиной осуществляют экстрагированием обезжиренного порошка остатка после липофильной экстракции в изотоническом растворе натрия хлорида при температуре 25-30С в течение 3-4-х часов при постоянном перемешивании. Экстрагирование повторяют дважды. Полученный экстракт фильтруют и получают гидрофильную фракцию плаценты свиной. Раствор хранят в морозильной камере при температуре -18С. Обращает на себя внимание эффективность и быстрота процесса получения гидрофильной фракции методом водно-солевой экстракции. В отличие от аналогов, где применяются способы экстрагирования водно-солевым раствором, выделение гидрофильного комплекса осуществляется после получения однородного диспергирования, лиофилизации и полного удаления жирорастворимых веществ, а также ведется при низких температурах, позволяющих сохранить все действующие вещества. Полученная фракция плаценты свиной содержит в своем составе ряд природных аминокислот и микроэлементов, адаптированных к организму животных, что выгодно отличает ее от препарата-аналога.

Сущность способа поясняется примерами.

Пример 1.

С целью определения оптимального режима экстракции липофильной фракции проводились опыты по изменению параметров. Установка для экстракции и сам процесс являются низкотемпературными, так как в качестве экстрагента используются хладоны, в частности хладон-12, представляющий собой дифтордихлорметан, температура кипения которого равна -29,8C. Низкая температура кипения хладонов и высокая их летучесть позволяет проводить экстракцию в интервале низких температур, как например у хладона-12 +30-35С. В связи с этим процесс носит название низкотемпературного.

Результаты опыта представлены в таблице 1.



Из данных, представленных в таблице 1, видно, что оптимальным временем экстракции липофильной фракции плаценты свиной является 4 часа (опыт 4). Дальнейшее увеличение времени ведения экстрагирования не приводит к повышению процента выхода по отношению к загружаемому сублимированному сырью.

Пример 2.

Оставшийся после выделения липофильной фракции порошок переносится в экстрактор №2. После этого добавляют 30 л 0,85% изотонического раствора натрия хлорида, приготовленного на воде дистиллированной, перемешивают в течение 3-4 часов при температуре 25-30С (таблица 2, опыты 1-10). Параллельно проводят опыт по извлечению гидрофильной фракции из тканей плаценты свиной, после криоизмельчения не подвергавшейся липофильной экстракции (таблица 2, опыт 11).

В качестве критерия проведения полноты экстрагирования гидрофильных веществ, содержащихся в плаценте, взято содержание ионов Fe3+. Все опыты проводились в одном температурном режиме 25-30С



На основании данных, представленных в таблице 2, выбран оптимальный режим водно-солевого экстрагирования с целью получения гидрофильной фракции и показано в опыте №11, что проведение экстрагирования гидрофильной фракции без первоначального выделения жирорастворимых компонентов в 5,9 раз снижает эффективность водно-солевой экстракции.

Пример 3.

С целью определения состава липофильной фракции был проведен биохимический анализ фракции, который показал:

Содержание общих липидов, г/л 462

Содержание триглицеридов, ммоль/л 31

Холестерин, ммоль/л 11,5

Цинк, мкМ/л 24,95

Медь, мкМ/л 19,2

Марганец, мкМ/л 0,36

Пример 4.

С целью определения содержания аминокислот и микроэлементов в гидрофильной фракции, был проведен анализ, результаты которого представлены в таблице 3.



Данные, представленные в таблице 3, позволяют сделать следующие выводы. Наличие в составе фракций плаценты свиной полипептидов, аминокислот, микро- и макроэлементов, оксикислот и др. биологически активных веществ вызывает нормализацию метаболических процессов в организме, оказывает иммуномоделирующее и адаптогенное влияние.

Пример 5.

При испытаниях фракций, полученных по заявляемому способу, в производственных условиях был установлен их широкий спектр действия и высокая эффективность для профилактики и лечения различных заболеваний у коров, свиней и молодняка сельскохозяйственных животных.

В результате проведенных испытаний в хозяйствах Воронежской области и отдельных хозяйствах Харьковской области получен высокий эффект лечебного и профилактического действия, превышающий по эффективности прототип. Данные представлены в таблицах 4, 5.





Заявляемый способ позволяет реализовать последовательное качественное разделение липофильной и гидрофильной фракций плаценты свиной с максимальным выходом биологически активных веществ. Это усиливает их специфическую биологическую активность. Полученные фракции являются ценной основой для создания лекарственных форм. 



ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


Способ получения биологически активных липофильной и гидрофильной фракций плаценты свиной, включающий измельчение, поэтапную экстракцию фракций органическим растворителем и водным раствором хлорида натрия, фильтрование и сушку, отличающийся тем, что плаценту отмывают, фрагментируют, подвергают замораживанию парами жидкого азота до температуры (-80) - (-120)С, измельчение проводят в крио-мельнице при охлаждении парами жидкого азота до температуры (-80) - (-120)С до размера частиц 20-30 мкм, полученный порошок лиофилизируют при температуре (-10) - (-20)С до размера частиц 20-30 мкм и при давлении не выше 0,1 мм рт.ст., липофильную фракцию экстрагируют с помощью хладоновых растворителей под давлением 6-8 атм и температуре 30-35С, а гидрофильную фракцию получают экстрагированием с помощью изотонического водного раствора хлорида натрия при температуре 25-30С в течение 3-4 ч.