СПОСОБ ПОПЕРЕЧНОГО СШИВАНИЯ КАРБОКСИЛИРОВАННЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ

СПОСОБ ПОПЕРЕЧНОГО СШИВАНИЯ КАРБОКСИЛИРОВАННЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ


RU (11) 2230073 (13) C2

(51) 7 C08B11/12, C08B15/00, C08B37/04, C08B37/08 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 17.09.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2004.06.10 
(21) Регистрационный номер заявки: 2001112487/04 
(22) Дата подачи заявки: 1999.11.09 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 1999.11.09 
(31) Номер конвенционной заявки: MI98A002443 
(32) Дата подачи конвенционной заявки: 1998.11.11 
(33) Страна приоритета: IT 
(43) Дата публикации заявки: 2003.08.20 
(45) Опубликовано: 2004.06.10 
(56) Аналоги изобретения: WO 9808897 A, 06.03.1998. US 4772419 A, 20.09.1988. RU 2017751 C1, 15.08.1994. US 4716154 A, 29.12.1987. US 4716224 A, 29.12.1987. 
(72) Имя изобретателя: БАРБУЧЧИ Роландо (IT); СПОРТОЛЕТТИ Джанкарло (IT) 
(73) Имя патентообладателя: ФАРМИЛА-ТЕА ФАРМАСЬЮТИЧИ С.П.А. (IT) 
(74) Патентный поверенный: Лебедева Наталья Георгиевна 
(85) Дата соответствия ст.22/39 PCT: 2001.05.10 
(86) Номер и дата международной или региональной заявки: EP 99/08480 (09.11.1999) 
(87) Номер и дата международной или региональной публикации: WO 00/27886 (18.05.2000) 
(98) Адрес для переписки: 129010, Москва, ул. Б. Спасская, 25, стр. 3, ООО "Юридическая фирма Городисский и Партнеры", Н.Г.Лебедевой 

(54) СПОСОБ ПОПЕРЕЧНОГО СШИВАНИЯ КАРБОКСИЛИРОВАННЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ 

Изобретение относится к способу поперечного сшивания карбоксилированных полисахаридов и может быть применено в медицинской и фармацевтической областях и в косметологии. Способ получения включает активирование карбоксильных групп полисахарида путем взаимодействия с пригодными активирующими карбоксильные группы агентами в безводном апротонном растворителе. После чего следует стадия взаимодействия полисахарида с активированными карбоксильными группами и полиамина общей формулы: R1-NH-A-NHR2, где А является С2-С10 алкиленовой цепью или полиоксиалкиленовой цепью [ (СН2)n-О-(СН)2] м, где n-равно 2 или 3, м - от 2 до 10. R1 и R2 являются одинаковыми или различными и представляют собой водород, С1-С6 алкил, фенил или бензил. Поперечносшитые полисахариды получают вышеуказанным способом. Изобретение позволяет получить соединения с высокой биосовместимостью, улучшенной устойчивостью к ферментативным системам. Из полученных полисахаридов можно сформировать различные формы (гели, пленки), а также достигается возможность стерилизоваться химически или физически без изменения структуры продукта. 2 с. и 8 з.п.ф-лы., 3 табл. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Настоящее изобретение относится к способу поперечного сшивания карбоксилированных полисахаридов.

Способ по изобретению обеспечивает высокую степень воспроизводимости полученных продуктов в плане степени поперечного сшивания, однородности распределения поперечносшитых цепей и химико-физических характеристик продуктов и технологических характеристик изделий, получаемых из них.

Воспроизводимость особенно важна для применений в медицинской, фармацевтической областях, в дерматологии и косметологии.

Изобретение дополнительно относится к продуктам, получаемым указанным способом, и их применениям в медицинской, фармацевтической областях, дерматологии и косметологии.

Предпосылки изобретения

Применение макромолекул в медицинской/фармацевтической области и, позднее, в дерматологической-косметологической области хорошо известно. Макромолекулы используют при приготовлении фармацевтических композиций в качестве загустителей, смазывающих веществ, агентов для пленочных покрытий, устойчивых в желудке, в частности, при получении капсул, гелей, коллоидов и различных устройств (например, контактных линз, предметов из марли и т.д.). Макромолекулы также используются при получении композиций с контролируемым высвобождением активных ингредиентов.

Обзоры по их характеристикам и фармацевтическим применениям имеются у 1) C.Hansch et al., Editors - "Comprehensive Medicinal Chemistry" - Pergamon Press, Oxford, 1990, Vol.1-6; 2) A.Wade and P.J.Wellers Editors - "Handbook of Pharmaceutical Excipients" - Ed. 1994, The Pharmaceutical Press.

Указанные макромолекулы принадлежат к различным химическим семействам и могут быть синтетическими или натуральными, или полусинтетическими.

Примеры синтетических макромолекул включают поливинилпирролидон, полиоксиэтиленалкильные эфиры, поливиниловые спирты, полиметакрилаты. Примеры натуральных макромолекул включают натуральную гиалуроновую кислоту (HY) и целлюлозу.

Примеры полусинтетических макромолекул включают карбок-сиалкилцеллюлозы, широко используемые в производстве продуктов питания и предметов личной гигиены. Эти макромолекулы характеризуются линейной или слабо разветвленной структурой.

Очень важная модификация для увеличения химической, ферментативной и механической устойчивости обеспечивается поперечным сшиванием, которое можно проводить как на синтетических, так и на натуральных (уже более или менее модифицированных) полимерах.

Примеры поперечносшитых полимеров включают полимеры, используемые для защиты таблеток или капсул в желудке (полиметакрилаты), а также полимеры, используемые в качестве эмульгаторов, суспендирующих агентов, отвердителей таблеток (карбопол), поперечносшитые гиалуроновые кислоты, обсуждаемые здесь ниже.

Для рассматриваемых применений и, в частности, для получения инвазивных медицинских устройств, которые должны вводиться парентерально, указанные полимеры должны отвечать ряду требований технического или регламентного типа.

Технические требования включают:

1) высокую биосовместимость;

2) устойчивость к ферментным системам, как тканевым, так и плазматическим (для инъекцируемых композиций), и желудочно-кишечным (для пероральных композиций).

В некоторых случаях может быть желательна постепенная деградация, например, для контролируемого высвобождения лекарственного препарата.

Данная устойчивость особенно важна, когда макромолекула находится в композициях/изделиях, которые должны существовать в течение длительного периода времени, например заменители синовиальной жидкости, пленки, тампоны или гели в качестве средств против слипания тканей при операциях различных видов; в тканевой инженерии (искусственные органы); искусственная кожа при лечении ожогов и широко в эстетической хирургии;

3) способность формироваться в различные формы (гели, пленки, тампоны и т.д.);

4) возможность стерилизоваться химически или физически без изменения структуры продукта.

Согласно регламентным требованиям состав различных производственных партий должен поддерживаться постоянным внутри узких пределов; это предполагает, что способы производства стандартизируются и что основные компоненты имеют очень низкую внутреннюю вариабельность.

Возможная причина неоднородности макромолекул происходит от разброса молекулярных масс. Указанная неоднородность становится даже выше в результате поперечного сшивания. Это может быть серьезным недостатком в зависимости от области применения и применительных целей конечного продукта.

ЕР-А-566118 (Kimberly-Clark) раскрывает поперечносшитые полисахариды для использования в качестве суперабсорбентов для пеленок и других изделий.

Описываемый в ней способ основан на поперечном сшивании целлюлозы путем образования межмолекулярных амидов, сложных эфиров и простых эфиров между полиаминами, полиолами и их смесями и карбоксильной группой полисахаридов.

Реакцию проводят нагреванием при 80 С смеси полисахарида с полиолом и/или полиамином. Этот способ несомненно является экономичным и пригоден для крупномасштабного производства, где требования по воспроизводимости являются менее строгими.

В патенте США 5465055 раскрываются поперечносшитые полисахариды (гиалуроновая кислота и альгиновая кислота), полученные этерификацией СООН-групп полисахарида и ОН-групп других молекул, без вставки поперечносшивающих "ветвей".

В WO 91/9119 раскрываются микрокапсулы в качестве биогибридных органов для островков Лангерганса, состоящих из альгиновой кислоты, поперечносшитой ионами бария.

В ЕР 190215 раскрывается поперечное сшивание различных полимеров (карбоксилированных крахмалов, декстрана, целлюлоз) ди- или полифункциональными эпоксидами.

Предлагались следующие агенты для поперечного сшивания гиалуроновых кислот:

полифункциональные эпоксиды раскрываются в патентах США 4716224, 4772419, 4716154;

полиспирты раскрываются в патенте США 4957744;

дивинилсульфон раскрывается в патентах США 4605691, 4636524;

альдегиды раскрываются в патентах США 4713448 и 4582865;

карбоксамиды раскрываются в патенте США 5356833;

поликарбоновые кислоты раскрываются в ЕР-А-718312.

Раскрытие изобретения

Изобретение относится к способу получения поперечносшитых полисахаридов, содержащих карбоксильные группы, позволяющему осуществлять полный контроль степени поперечного сшивания, а также высокую воспроизводимость в плане постоянных характеристик конечного продукта.

Способ по изобретению включает:

a) активирование карбоксильных групп полисахарида взаимодействием с пригодными активирующими карбоксильные группы агентами в безводном апротонном растворителе;

b) взаимодействие полисахарида с активированными карбоксильными группами с полиамином.

Полученный поперечносшитый полисахарид, если желательно, можно подвергнуть сульфатированию или гемисукцинилированию свободных гидроксильных групп.

Продукты, получаемые способом по изобретению, можно также подвергнуть комплексообразованию с ионами металлов, такими как ионы цинка, меди или железа.

Полисахарид, содержащий карбоксильные группы, который можно использовать по изобретению, может быть натурального, синтетического или полусинтетического происхождения. Примеры указанных полисахаридов включают гиалуроновые кислоты (полученные из тканей или бактерий), карбоксиметилдекстран, карбоксиметилцеллюлозу, карбоксиметилкрахмал, альгиновые кислоты, целлюлозную кислоту, N-карбоксиметил- или бутилглюканы или хитозаны, гепарины различной молекулярной массы, необязательно десульфатированные или сукцинилированные, дерматансульфаты, хондроитинсульфаты, гепарансульфаты, полиакриловые кислоты.

Гиалуроновые кислоты, карбоксиметилцеллюлоза, гепарины, альгиновые кислоты и полиакриловые кислоты являются особенно предпочтительными.

Указанные поперечносшитые полимеры, полученные другими способами, известны и предложены для различных применений (смотри, например, ЕР 566118, WO 91/9119, патент США 5465055, ЕР 190215, ЕР 718312, патент США 4716224, обсуждаемые выше).

Агенты, активирующие карбоксильные группы, обычно представляют таковые, которые используются в химии пептидов: примеры подобных агентов включают карбонилдиимидазол, карбонилтриазол, хлорметилпиридилий йодид (CMP-J), гидроксибензотриазол, п-нитрофенол+п-нитрофенилтрифторацетат, N-гидроксисукцинимид и тому подобное. Применение хлорметилпиридилия йодида является особенно предпочтительным.

Полиамины предпочтительно имеют следующую общую формулу:

R1-NH-A-NH-R2

где R1 и R2, которые являются одинаковыми или различными, представляют водород, радикалы C1-C6 алкил, фенил или бензил, А представляет С2-С10 алкиленовую цепь, предпочтительно С2-С6 алкиленовую цепь, необязательно замещенные гидроксильной, карбоксильной, галогеном, алкоксильной, аминогруппами; полиоксиалкиленовую цепь формулы

[(CH2)n-O-(CH2)n]m

где n равно 2 или 3 и m равно целому числу от 2 до 10; радикал C5-C7 циклоалкил; радикал арил или гетарил, предпочтительно 1,3- или 1,4-двузамещенный бензол. А предпочтительно представляет C2-С6 нормальный алкилен или цепь формулы

[(СН2)n-O-(СН2)n]m.

Реакцию поперечного сшивания предпочтительно проводят в растворителе, выбранном из тетрагидрофурана, диметилформамида или диметилсульфоксида, и полисахарид предпочтительно образует соль с липофильным катионом, например трибутил- или тетралкиламмонием или другим липофильным органическим основанием.

Превращение неорганических солей, таких как соли натрия, в пригодные органические липофильные соли можно проводить известными ионообменными способами в гомогенной фазе или осаждением кислотного компонента с последующим выделением последнего и образованием соли с желаемым органическим основанием.

Реакцию активирования карбоксильных групп проводят в гомогенной фазе и в безводном полярном апротонном растворителе.

Полиамин, разбавленный в том же безводном растворителе, добавляют к раствору активированного эфира, поддерживая температуру от 0 до 30 С. Время реакции поперечного сшивания находится в пределах от 1 до 12 ч, также в зависимости от необязательного присутствия пригодных основных веществ (например, триэтиламина).

В основном конечный продукт выделяют осаждением органической соли, добавляя другой растворитель к реакционному растворителю, или отгонкой последнего с последующим центрифугированием, промыванием дистиллированной водой, повторным диспергированием в растворах желаемой щелочи (например, натрия, калия), последующим промыванием водой и конечным высушиванием основной соли в вакууме или лиофилизацией.

Степень поперечного сшивания (CLD) может находиться в широких пределах и может регулироваться изменением количества агентов, активирующих карбоксильные группы, поскольку активирование и реакция поперечного сшивания являются в основном количественными.

Поперечносшитые полисахариды, полученные по изобретению, можно подвергнуть сульфатированию возможно присутствующих гидроксильных групп обычно взаимодействием с комплексом пиридина-трехокиси серы в диметилформамиде.

Реакцию проводят в гетерогенной фазе при температуре 0-10 С в течение периода времени в пределах примерно от 0,5 до примерно 6 ч.

Полученная степень сульфатирования находится внутри широких пределов в отношении к гидроксильным группам в целом и может регулироваться изменением температуры и времени реакции. В основном степень сульфатирования (определенная в виде эквивалентов сульфатных групп/г) может находиться в пределах от 1 10-6 до 6 10-6 экв/г при степени поперечного сшивания, равной 0,5.

Поперечносшитые полимеры, полученные по изобретению, необязательно сульфатированные, способны образовать комплекс с ионами металлов, такими как ионы цинка, меди или железа.

Указанные комплексы можно получить растворением или диспергированием до полного набухания продукта в воде и добавлением при перемешивании предпочтительно при комнатной температуре концентрированного раствора органической или неорганической соли металла, например CuCl2, ZnCl2, Fe2(SO4)3; после перемешивания в течение 12-24 ч комплекс выделяют центрифугированием или осаждением после добавления другого растворителя (например, этанола или ацетона) или отгонкой в вакууме; выделенный сырой продукт тщательно промывают дистиллированной водой так, чтобы удалить избыточные ионы. Затем комплексы лиофилизуют. Содержание ионов металлов варьирует в зависимости от используемых рабочих условий, в частности молярных соотношений полимера к ионам; концентрации и рН растворов; времени реакции и, особенно, степени сшивания.

Способ по изобретению с помощью пригодной регуляции степени поперечного сшивания и/или сульфатирования позволяет получать поперечносшитые карбоксилированные полисахариды в широких пределах форм, отличающихся различными свойствами, такими как вязкоупругость, степень гидратации, способность образовывать комплексы с ионами металлов, способность образовывать гидрогели, способность к формированию в пленки или тампоны, механическая прочность конечных материалов.

Это позволяет применять их во многих медицинских областях, в области гуманной и ветеринарной медицины и в дермокосметологии.

Следующие примеры иллюстрируют изобретение.

ПРИМЕР 1: Гель карбоксиметилцеллюлозы, 100% поперечносшитой 1,3-диаминопропаном.

1,2 10-3 моль соли ТВА и карбоксиметилцеллюлозы по отношению к дисахаридной единице растворяют в 30 мл ДМФА в атмосфере N2 и при перемешивании. 0,32 г хлорметилпиридилия йодида (1,2 10-3 моль), растворенного в 2 мл ДМФА, добавляют по каплям к раствору, поддерживая при температуре 0 С на льду.

Молярное соотношение было 1 к 1, поскольку карбоксиметилцеллюлоза имеет одну функциональную карбоксильную группу на дисахаридную единицу. Через 20 мин к раствору добавляют 2 мл поперечносшивающего 1,3-диаминопропана (0,006 моль) и после сразу же также 0,5 мл триэтиламина. Получают твердый желеобразный продукт, который промывают ДМФА, затем помещают в H2O до полного набухания.

Затем проводят чередующиеся промывания EtOH и Н2О. После последнего промывания EtOH продукт высушивают вымораживанием.

- ИК (пленка; см-1): 1650 ; без изгиба примерно при 1400.

- SD (степень набухания в воде и при комнатной температуре через 15 мин; гравиметрическое определение; высчитано по:



где Ws = масса гидратированного геля; Wd = масса сухого геля): 7,000.

- СЭМ (сканирующая электронная микроскопия): структура выглядит компактной с порами размером 15-35 мк.

- Площадь продукта при воздействии кроличьей PRP (плазма, обогащенная тромбоцитами) показывает очень пониженное наличие тромбоцитов или агрегатов по сравнению с эквивалентным продуктом, полученным с полипропиленом низкой плотности (ЕС стандарт).

ПРИМЕР 2: Гель карбоксиметилцеллюлозы, 50% поперечносшитой 1,3-диаминопропаном

1,2 10-3 моль карбоксиметилцеллюлозы по отношению к диса-харидной единице растворяют в 30 мл ДМФА в атмосфере N2 и при перемешивании. 0,24 г хлорметилпиридилия йодида (1,2 10-3 моль), растворенного в 2 мл ДМФА, добавляют по каплям к раствору, поддерживая при температуре 0 С на льду. Молярное соотношение равняется 2:1.

Через 20 мин к раствору добавляют 2 мл поперечносшивающего 1,3-диаминопропана (3 10-3 моль) и после сразу же также 0,5 мл триэтиламина. Получают твердый желеобразный продукт, который промывают ДМФА, затем помещают в H2O до полного набухания.

Затем проводят чередующиеся промывания EtOH и Н2О. После последнего промывания EtOH продукт высушивают вымораживанием.

- ИК (пленка; см-1): 1650; без изгиба примерно при 1400.

- SD: 8,000.

- СЭМ: наличие пор размером 13-25 мк.

- Адгезия тромбоцитов: как сообщено в примере 1.

ПРИМЕР 3: Гель альгиновой кислоты, 50% (100% по отношению к дисахаридным единицам), поперечносшитой 1,3-диаминопропаном

Соль ТВА и альгиновой кислоты получают из соли натрия ионообменом на сильной катионообменной смоле (Dovex) в Н+-форме (т.е. кислотной форме) с последующей нейтрализацией гидроокисью тетрабутиламмония (ТВА-ОН) и конечной лиофилизацией.

1,2 10-3 моль по отношению к моносахаридной единице растворяют в 30 мл ДМФА в атмосфере N2 и при перемешивании. 0,36 г хлорметилпиридилия йодида (1,2 10-3 моль), растворенного в 2 мл ДМФА, добавляют по каплям к раствору, поддерживая при температуре 0 С на льду. Молярное соотношение равняется 1:1.

Через 20 мин к раствору добавляют 6 10-3 моль поперечносшивающего 1,3-диаминопропана (0,024 моль) и после сразу же также 0,5 мл триэтиламина. Получают твердый желеобразный продукт, который промывают ДМФА, затем помещают в Н2О до полного набухания.

Затем проводят чередующиеся промывания EtOH и Н2О. После последнего промывания EtOH продукт высушивают вымораживанием.

- ИК (пленка; см-1): 1635 (широкий) : 1400, примерно .

-SD: 5,000.

- СЭМ: структура выглядит компактной и без пор.

ПРИМЕР 4: Получение гиалуроновой кислоты, поперечносшитой с CLD=0,05 (5% имеющихся карбоксильных групп). Поперечносшивающий агент: 1,3-пропандиамин.

Натриевую соль гиалуроновой кислоты (1 10-3 моль по отношению к дисахаридной единице) переводят в соль ТВА одним из следующих способов:

a) 1% водный раствор гиалуроната натрия переводят в Н+-форму с помощью сильной Н+-катионообменной смолы (Amberlite IR 120); конечный раствор обрабатывают 0,5% раствором ТВА-ОН до рН примерно 9;

b) 1% водный раствор гиалуроната натрия переводят в соль ТВА обработкой слабой катионной смолой в ТВА+-форме (Amberlite IRC 50).

В обоих случаях конечные растворы лиофилизуют. Затем соль ТВА растворяют в 15 мл безводного ДМФА, в атмосфере N2 и при 0 С, к хранившемуся раствору соли ТВА добавляют по каплям 0,02 г хлорметилпиридилия йодида (CMPJ) в 2 мл безводного ДМФА.

Затем к реакционной смеси добавляют 0,1 мл триэтиламина и затем добавляют по каплям раствор 1,3-диаминопропана (d=0,88 в большом избытке так, чтобы легче провести поперечное сшивание активированных карбоксильных групп) в 2 мл безводного ДМФА. Когда добавление закончено, реакционную смесь перемешивают по меньшей мере в течение 30 мин и растворитель удаляют при пониженном давлении, затем остаток переводят в ДМФА, который затем удаляют отгонкой; остаток обрабатывают этанолом, этанолом-водой и в конце водой.

Затем продукт лиофилизуют и остаток подвергают анализу.

- ИК (пленка; см-1): 1630 ; 1740 , полисахарид); 3200 (-NH-).

- SD (степень набухания в воде и при комнатной температуре через 15 мин; гравиметрическое определение; высчитано по:



где Ws = масса гидратированного геля; Wd = масса сухого геля): 31,000.

- Степень поперечного сшивания: 0,05 (5% первоначально имеющихся карбоксильных групп).

ПРИМЕР 5: Получение гиалуроновой кислоты, сшитой с CLD=0,05 (5% имеющихся карбоксильных групп). Поперечносшивающий агент: 1,6-диаминогексан. Активатор: хлорметилпиридилий йодид.

Поперечносшитое производное получают способом и в условиях, описанных в примере 4, используя ту же HY и тот же активатор, но вместо 1,3-диаминопропана - 1,6-диаминогексан.

- ИК (пленка; см-1): 1630 (--NH-); 1740 (-ОН, полисахарид); 3200 (--).

ПРИМЕР 6: Получение поперечносшитой гиалуроновой кислоты с CLD=0,05 (5% имеющихся карбоксильных групп). Поперечиосшивающий агент: 0,0’-бис-(2-аминопропил) ПЭГ 500. Активатор: хлорметилпиридилий йодид.

Поперечносшитое производное получают способом и в условиях, описанных в примере 4, и используя тот же активатор, но вместо 1,3-диаминопропана - 0,0’-бис-(2-аминопропил) ПЭГ 500.

- ИК (пленка; см-1): 1630 ; 1740, полисахарид); 3200 ).

- SD: 31,000.

ПРИМЕР 7: Получение поперечносшитых гиалуроновых кислот с CLD=0,3 (30% имеющихся карбоксильных групп). Поперечносшивающий агент: 1,3-пропандиамин. Активатор: хлорметилпиридилий йодид.

0,6 г соли гиалуроновой кислоты и трибутиламмония (1 10-3 моль по отношению к дисахаридной единице) растворяют при перемешивании в 30 мл ДМФА в атмосфере азота. К перемешиваемому раствору добавляют по каплям 0,08 г хлорметилпиридилия йодида (3,5 10-4 моль), растворенного в 2 мл ДМФА, поддерживая при 0 С. Следовательно, молярное соотношение равняется примерно 3:1.

Через 20 мин добавляют 2 мл 1,3-диаминопропана (0,024 моль), затем сразу же 0,5 мл триэтиламина. Получают твердый желатинообразный продукт, затем продукту дают набухнуть в воде и вновь промывают этанолом.

Конечный продукт после лиофилизации показывает под сканирующим микроскопом неоднородный образец с гладкими зонами, чередующимися с пористыми зонами.

- Степень поперечного сшивания составила 0,3 (30% от первоначально имеющихся карбоксильных групп).

- ИК (пленка; см-1): 1740; 1630 ; 1610 ; 1560 (.

ПРИМЕР 8: Получение гиалуроновой кислоты, поперечносшитой с CLD=0,5 (50% имеющихся карбоксильных трупп). Поперечносшивающий агент: 1,3-пропандиамин. Активатор: хлорметилпиридилий йодид.

0,6 г соли гиалуроновой кислоты и трибутиламмония (НУ ТВА) (1 10-3 моль по отношению к дисахаридной единице) растворяют при перемешивании в 30 мл ДМФА в атмосфере азота. 0,15 г хлорметилпиридилия йодида (CMPJ) (6 10-6 моль), растворенного в 2 мл ДМФА, добавляют по каплям к раствору, поддерживая при 0 С. Молярное соотношение составляет 2HY.TBA:1 CMPJ. Через 20 мин к раствору добавляют 2 мл 1,3-диаминопропана (0,024 моль). Затем добавляют 0,5 мл триэтиламина. Получают твердый желеобразный продукт и его тщательно промывают ДМФА. После отгонки ДМФА продукту дают набухнуть в воде и промывают этанолом перед лиофилизацией.

Полученный продукт имеет степень поперечного сшивания 0,5 и он показывает под сканирующим микроскопом зернистый внешний вид с крупными отверстиями в промежутках. При большем увеличении две морфологические картины одинаковы и показывают наличие выпячиваний округлой формы диаметром несколько микрон.

-ИК (пленка; см-1): 1740 ; 1630 ; 1610 ; 1560 .

Гели подвергают набуханию в PBS и оценивают максимальную способность к набуханию.

- SD = 23,500.

- ЯМР = (13С; ppm): 29,3 и 39,3 (связь –СН2-СН2-СН2-пропандиамин); 172,5 

Реологические свойства, оцененные на реометре Bohlin VOR при температуре 23±0,1 С, показали, что динамический модуль упругости G’ (100 Па при 10 Гц), одинаковый при двух рассматриваемых концентрациях (10 и 20 мг/мл), всегда выше, чем динамический коэффициент вязкости (G” 40 Па для 20 мг при 10 Гц и 20 Па для 10 мл при 10 Гц).

Примеры 9-12

Способами, раскрытыми в предыдущих примерах, получают поперечносшитые производные гиалуроновой кислоты, имеющие характеристики, обобщенные в следующей таблице 1, начиная с 10-3 моль (0,6 г) соли гиалуроновой кислоты и трибутиламмония.

Полученные производные имели следующие характеристики (см. таблицу 1).

Пример 13: Сульфатирование 50% поперечносшитой HY

Производное, полученное в примере 8, диспергируют в 5 мл ДМФА при энергичном перемешивании в атмосфере азота. Добавляют раствор 1 г SО3/пиридина в моль ДМФА при 0 С и перемешивают в течение 3 ч. Реакцию гасят добавлением избытка Н2О (50 мл) и рН доводят до 9 0,1 М NaOH.

Продукт тщательно промывают этанолом и Н2O и затем лиофилизуют.

ИК-спектр показывает в дополнение к полосам исходного продукта пик при 1260 см-1 и более сильную полосу при 1025 см-1.

Гель набух в PBS с SD=33,000. 13С-ЯМР высокого разрешения показывает сигналы в Н2О при 37 С, приведенные в таблице 2. Интенсивность ЯМР-сигналов при 29,3 и 38,8 ppm (-CH2-) и сигнала при 172,5 ppm (CONH) подтверждает степень поперечного сшивания, равную примерно 50%.

Реологические свойства характеризуются динамическими модулями упругости G’ (2500 Па с 20 мг и 1000 Па с 10 мг при 10 Гц), которые всегда выше, чем динамические коэффициенты вязкости G” (600 пА с 20 мг и 150 Па с 10 мг при 10 Гц), и значительно выше, чем соответствующие значения, полученные с несульфатированной HY (13 при 50% - пример 5). Это соединение имеет время свертывания (ТТ) выше (61±5 с), чем в контроле (14,0 с) и соответствующего соединения без поперечного сшивания (14,6 с).

Соединение также активно в тесте PRP при использовании кроликов в состоянии стресса.

ПРИМЕР 14: Сульфатирование геля альгиновой кислоты

Поперечносшитый продукт после обработки EtOH высушивают вымораживанием для полного удаления влаги и подвергают сульфатированию спиртовых групп.

К 100 мл поперечносшитого продукта, диспергированного в 5 мл ДМФА, добавляют раствор SО3-пиридина (800 мг в 2 мл ДМФА). Реакцию следует проводить при 0 С в атмосфере азота и при постоянном перемешивании в течение 2 ч.

Является обязательным не дать продукту адсорбировать влагу, поскольку она ингибирует реакцию.

Через 2 ч добавляют воду, рН доводят до 9 1 М раствором NaOH, посредством этого удалив пиридин.

Сульфатированный таким образом продукт очищают в EtOH.

Анализ очищенных продуктов показал:

- ИК (пленка; см-1) 1263 (растянутый SO).

- Эквиваленты SО3-групп/г геля (в комплексах с толуидином):

5% поперечносшитый гель: 6 10-5

50% поперечносшитый гель: 2 10-5

100% поперечносшитый гель: 3 10-5

SD:

5% поперечносшитый гель: 19 10-3

50% поперечносшитый гель: 9 10-3

100% поперечносшитый гель: 7 10-3

ПРИМЕР 15

Используя ту же методологию, синтезируют сульфатированные производные 50% поперечносшитых продуктов из примеров 10, 11 и 12.

Колориметрические характеристики сульфатированных производных представлены в таблице 3 наряду с продуктами, происходящими из примеров 8 и 13.

ПРИМЕР 16: Сульфатирование геля карбоксиметилцеллюлозы.

Следуя способу и условиям, описанным в примере 14, получают сульфатированное производное.

Эквиваленты SО3-групп/г:

а - CMC 5% поперечносшитая: 8 10-6

b - CMC 50% поперечносшитая: 7 10-6

с - CMC 100% поперечносшитая: 4 10-6

SD:

а: 20 10-3

b: 12 10-3

с: 9 l0-3 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



1. Способ получения поперечно-сшитых полисахаридов, содержащих карбоксильные группы, включающий а) активирование карбоксильных групп полисахарида путем взаимодействия с пригодными активирующими карбоксильные группы агентами в безводном апротонном растворителе; b) взаимодействие полисахарида с активированными карбоксильными группами с полиамином, где полиамин имеет следующую общую формулу:

R1-NH-A-NH-R2,

где R1 и R2, которые являются одинаковыми или различными, представляют водород, радикалы С1-С6 алкил, фенил или бензил;

А представляет С2-С10 алкиленовую цепь, предпочтительно С2-С6 алкиленовую цепь, необязательно замещенные гидроксильной, карбоксильной, галогеном, алкоксильной, аминогруппами; полиоксиалкиленовую цепь формулы

[(CH2)n-O-(CH2)n]m,

где n равно 2 или 3, m равно целому числу от 2 до 10; радикал С5-С7 циклоалкил; радикал арил или гетарил, предпочтительно 1,3- или 1,4-двузамещенный бензол.

2. Способ по п.1, где полисахарид выбирают из гиалуроновых кислот, полученных из тканей или бактерий, карбоксиметилдекстрана, карбоксиметилцеллюлозы, карбоксиметилкрахмала, альгиновых кислот, целлюлозной кислоты, N-карбоксиметил- или бутилглюканов или хитозанов; гепаринов различной молекулярной массы, необязательно десульфатированных или сукцинилированных, дерматансульфатов, хондроитинсульфатов, гепарансульфатов, полиакриловых кислот.

3. Способ по п.1 или 2, где агент, активирующий карбоксильные группы, выбирают из карбонилдиимидазола, карбонилтриазола, хлорметилпиридилия йодида, гидроксибензотриазола, п-нитрофенола, п-нитрофенилтрифторацетата, N-гидроксисукцинимида.

4. Способ по одному из пп.1-3, где полисахарид образует соль с липофильными катионами.

5. Способ по п.4, где липофильный катион представляет трибутил- или тетралкиламмоний.

6. Способ по одному из пп.1-5, где реакцию поперечного сшивания проводят в безводном диметилформамиде или тетрагидрофуране.

7. Способ по одному из пп.1-6, где полученный поперечно-сшитый полисахарид дополнительно подвергают сульфатированию гидроксильных групп путем взаимодействия с комплексом пиридина/трехокиси серы.

8. Способ по п.7, где реакцию сульфатирования проводят в диметилформамиде в гетерогенной фазе при 0-10С в течение периода времени примерно от 0,5 до примерно 6 ч.

9. Способ по одному из пп.1-8, где поперечно-сшитый, необязательно сульфатированный, полисахарид дополнительно подвергают реакции образования комплекса с водными растворами ионов меди, цинка или железа.

10. Поперечно-сшитые полисахариды, полученные способом по пп.1-9.