СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДНК-ПОВРЕЖДАЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ ЭСТРОГЕНОВ

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДНК-ПОВРЕЖДАЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ ЭСТРОГЕНОВ

RU (11) 2223503 (13) C2

(51) 7 G01N33/74 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 28.06.2007 - прекратил действие, но может быть восстановлен 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2004.02.10 
(21) Регистрационный номер заявки: 2001101708/15 
(22) Дата подачи заявки: 2001.01.17 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2001.01.17 
(43) Дата публикации заявки: 2002.11.27 
(45) Опубликовано: 2004.02.10 
(56) Аналоги изобретения: WEIDERPASS E et al Risk of endometrial cancer following estrogen replacement with and without progestins. J Nati Cancer Inst, 1999, Jul 7; 91(13), p.1131-1137. БЕРШТЕЙН Л.М. Роль экстрагонадных эстрогенов и гормональный канцерогенез. Вестник РАМН, 1997, № 8, с.54-58. HUNDAL BS et al Genotoxic potential of estrogens. Mutat Res, 1997, Mar 17; 389(2-3), p.l73-181. 
(72) Имя изобретателя: Берштейн Л.М.; Порошина Т.Е.; Цырлина Е.В. 
(73) Имя патентообладателя: НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова 
(98) Адрес для переписки: 197758, Санкт-Петербург, Песочный 2, ул. Ленинградская, 68, НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова 

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДНК-ПОВРЕЖДАЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ ЭСТРОГЕНОВ 

Изобретение относится к области медицины, в частности к эндокринологии и онкоэндокринологии. Сущность изобретения - определение ДНК-повреждающей способности эстрогенов на фоне введения животным этилового спирта по отношению числа ДНК-комет к весу матки или к содержанию в ней рецепторов прогестерона. Техническим результатом является разработка способа, позволяющего оценить ДНК-повреждающую способность эстрогенов под влиянием этилового спирта. 3 з.п.ф-лы, 3 табл. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к медицине, в частности к эндокринологии и онкоэндокринологии.

Женские половые гормоны оказывают биологический эффект на гормонозависимые ткани (эндометрий, слизистая влагалища и шейки матки, молочные железы). Избыточная гормональная стимуляция может быть одним из факторов возникновения опухолей в эстрогензависимых тканях-мишенях. Уровень эстрогенных гормонов остается достаточно значительным на протяжении жизни женщины, завися в то же время от ее возраста. Помимо признания роли основного источника продукции эстрогенных гормонов - яичников известно, что эстрогены могут секретироваться и внегонадно, в частности в эпителиальных клетках молочной железы, жировой ткани, клетках лимфоцитарно-макрофагального ряда и др. (Л.М. Берштейн, 1988; R. Santen, 1998). Кроме анализа особенностей продукции эстрогенов существенную важность для понимания многих нормальных и патологических процессов имеет и оценка эффектов этих гормонов на ткани, часть из которых может подвергаться неопластической трансформации.

На современном уровне развития онкологии выделяют два основных механизма вовлечения эстрогенов в процесс канцерогенеза. Первый из них связывают с усилением пролиферации клеток-мишеней в ответ на гормональную стимуляцию. Эстрогены выступают в данном случае как агент, способствующий увеличению пула делящихся клеток. Считается, что усиленно пролиферирующие клетки быстрее" накапливают" ошибки и более склонны к малигнизации под влиянием истинных канцерогенов. Этот путь проведения сигнала осуществляется через взаимодействие эстрогенов со специфическими рецепторами и таким образом реализуются многие гормональные эффекты эстрогенов, включая индукцию под их влиянием рецепторов прогестерона в ткани матки и т.д.

Второй тип воздействия эстрогенов на ткани-мишени опосредуется при участии продуктов их метаболизма - катехолэстрогенов (B.T. Zhu and A.H. Conney, 1998; И.Г. Коваленко и др., 1997) и образующихся в результате дальнейших биохимических реакций свободно - радикальных продуктов. Последние выступают в роли факторов, воздействующих на ДНК и способных ее модифицировать вплоть до образования аддуктов и нерепарируемых повреждений. Следуя вышесказанной терминологии, данный вариант гормонального канцерогенеза обозначается как генотоксический; при этом эстрогены и их дериваты выступают в роли непосредственных повреждающих агентов (Л.М. Берштейн, 2000).

По-видимому, в организме имеет место или создается возможность некого выбора для реализации того или иного варианта гормонального канцерогенеза. Вариант, связанный с повреждением на уровне ДНК, результируется в менее благоприятном клиническом течении заболевания, чем в ситуации, когда гормон выступает лишь как стимулятор пролиферации чувствительных к нему клеток. В последнем варианте развития гормонального канцерогенеза опухолевые клетки более склонны к сохранению своего эндокринного потенциала и реакции на гормон. Этот факт отмечен в литературе (C. Osbome et al., 1987; V.C. Jordan, 1997) и показано, что результаты лечения гормонозависимых опухолей эффективней и что такие опухоли чаще имеют благоприятный прогноз. С другой стороны, выявлен ряд условий и факторов, под влиянием которых эндокринный эффект гормона (эстрогена) ослабевает, но при этом усиливается его генотоксический потенциал. Иными словами, происходит так называемый "феномен переключения (перенацеливания) эстрогенного эффекта" (Л.М. Берштейн и др., 2000), важные последствия которого заставляют самым серьезным образом относиться к его методологической оценке.

Тенденцию увеличения роста заболеваемости раком тела матки и другими гинекологическими заболеваниями, а также раком молочной железы можно связать как с экзогенными факторами: влияние окружающей среды, накопление ксеноэстрогенов, распространение вредных привычек (переедание, снижение физической активности, потребление алкоголя и др.), так и с эндогенными, связанными, в частности, как с гиперсекрецией эстрогенов, синтезом их in situ и внегонадным синтезом эстрогенов (Л.М. Берштейн, 1998; W.R. Miller, 1996), так и с образованием свободных радикалов. Принимая во внимание сведения о способности эстрогенов индуцировать повреждения ДНК и увеличивать пролиферативную активность эстрогензависимых клеток, а также данные об увеличении числа заболевающих раком эндометрия не только в пожилом, но и в более молодом возрасте, мы пришли к выводу о целесообразности разработки способа оценки соотношения эндокринного и генотоксического эффекта эстрогенов, который со временем может быть использован и в клинической практике. Данный подход направлен на то, чтобы выявить, какой из эффектов эстрогенов в конкретном случае преимущественно ответственен за создание пробластомогенной ситуации. Выявление на основе такого подхода ведущих факторов, способных изменить поведение гормонозависимых клеток в ответ на изменение эстрогенного эффекта, позволит в дальнейшем проводить необходимые корригирующие мероприятия.

Конкретной задачей заявляемого изобретения является установление условий более "жесткого" воздействия эстрогенов на ткань-мишень, обусловленного ослаблением эндокринных свойств этих гормонов и усилением (приобретением ими) ДНК-повреждающего (генотоксического) действия.

Указанная задача достигается путем определения степени усиления под влиянием какого-либо агента ДНК-повреждающей способности эстрогенов по отношению к их гормональному действию.

В качестве прототипа предлагаемого изобретения можно рассматривать изменения в соотношении смертности от рака эндометрия и сердечно-сосудистых заболеваний у женщин, получающих эстрогензаместительную терапию в менопаузе по сравнению с женщинами, ее не получавшими (Е. Weiderpass et al.: Risk of endometrial cancer following estrogen replacement with and without progestins// J.Nat. Cancer inst., 1999, v. 91, p. 1131-1137).

Предлагаемый способ разработан и представлен в модельном эксперименте на крысах, подвергшихся двухсторонней овариэктомии (что сделано с целью стандартизации эстрогенного фона). В течение всех 11 дней после операции вплоть до дня, предшествующего дню окончания эксперимента, животные получают заместительную терапию эстрадиолом (в/м, по 2 мкг/день). При этом они подразделяются на группы. В контрольной группе крысы находятся на питьевой водопроводной воде. В опытных группах в качестве повреждающего агента, способного модифицировать ответ на эстроген, применяют этиловый спирт двух концентраций (5 и 15% на питьевой воде), спаивание которого начинается за 1 мес до овариэктомии.

В качестве параметров оценки эндокринного (гормонального) эффекта эстрогенов используют показатели веса матки животных (в мг) и концентрацию рецепторов прогестерона в матке (в фМ/мг белка) (S. Saez et al., 1978). ДНК-повреждающий (генотоксический) эффект эстрогенов оценивают методом ДНК-комет (single cell gel electrophoresis), позволяющим по длине электрофоретического следа ДНК оценить степень ее повреждения в клетках эндометрия (определяют число "комет" на 100 клеток в %). В этих целях применяют тот вариант этого метода, который пригоден для клеток, изолированных из солидных тканей (S. Tsuda, 1998).

Описываемый способ определения ДНК-повреждающей способности эстрогенов представляет собой расчет отношения (К) числа "комет" (в %) в эндометрии крыс к весу матки (в мг) или к содержанию рецепторов прогестерона в матке (в фМ/мг белка). Затем по соотношению выражаемой в условных единицах величины К у крыс, которым вводился эстрадиол в сочетании со спаиванием спирта, к величине К у крыс, получавших только эстрадиол, определяют степень усиления ДНК-повреждающей способности эстрогенов по отношению к их гормональной (эндокринной) активности.

Приводим пример упомянутого расчета по средним величинам полученных показателей (табл. 1). Кроме того, при необходимости можно определять отношение ДНК-повреждающей способности эстрогенов к их эндокринному эффекту в каждом отдельном конкретном случае (индивидуальный показатель эффекта повреждения - сравни результаты в табл. 2-3), что может представить особую важность при переходе к работе в клинических условиях.

Из табл. 1, в частности, следует, что введение эстрадиола совместно со спиртом существенно увеличивает величину К по сравнению с крысами, получавшими только эстрадиол, причем в тем большей степени, чем большей была концентрация спаиваемого спирта. Из таблиц же 2 и 3 (индивидуальная оценка результатов) следует, что только у одной крысы в группе "эстрадиол" (номер 3-2) величина К не уступала или превосходила отдельные значения этого показателя в группе "эстрадиол + 15%-ный спирт", свидетельствуя о том, что предлагаемый способ может быть использован и "на индивидуальном уровне". (Следует отметить, что избранный методологический подход не позволяет оценить самостоятельное ДНК-повреждающее действие спирта (или иного агента), так как размеры маток у крыс, подвергнутых овариэктомии и не получавших затем эстрадиола, малы и получить из них количество материала, достаточное для оценки "комет", не представляется возможным).

Таким образом, используя предложенный способ оценки соотношения эндокринного и генотоксического эффекта эстрогенов, можно определить степень усиления ДНК-повреждающей способности эстрогенов по отношению к их гормональному (эндокринному) действию - причем, как в среднем на группу, так и индивидуально (для каждого отдельного случая) и под влиянием того или иного повреждающего агента. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



1. Способ определения ДНК-повреждающей способности эстрогенов, отличающийся тем, что экспериментальным животным с овариэктомией осуществляют введение эстрогенов, животных делят на контрольную и испытуемые группы для изучения ДНК-повреждающей способности эстрогена на фоне введения испытуемым животным этилового спирта, определяют следующие показатели: вес матки (в мг), содержание в ней рецепторов прогестерона (в фМ/мг белка), число ДНК-комет на 100 клеток эндометрия (в %) и по отношению (К) числа ДНК-комет к весу матки или к содержанию в ней рецепторов прогестерона оценивают ДНК-повреждающее действие эстрогенов.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что изучение проводят на крысах, а в качестве эстрогена используют эстрадиол, который вводят внутримышечно по 2 мкг/день.

3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что в испытуемых группах крыс применяют этиловый спирт в двух концентрациях: 5% и 15% на питьевой воде.

4. Способ по пп.1-3, отличающийся тем, что в испытуемых группах животных наблюдают усиление ДНК-повреждающего действия эстрогенов.