СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЛАЗМАТИЧЕСКОГО КЛИРЕНСА ПОЧЕК

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЛАЗМАТИЧЕСКОГО КЛИРЕНСА ПОЧЕК


RU (11) 2222811 (13) C2

(51) 7 G01N33/50 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 05.10.2007 - прекратил действие 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2004.01.27 
(21) Регистрационный номер заявки: 2000122022/15 
(22) Дата подачи заявки: 2000.08.17 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2000.08.17 
(43) Дата публикации заявки: 2002.09.27 
(45) Опубликовано: 2004.01.27 
(56) Аналоги изобретения: DEDERDING J.P. et al. Influence of chronic renal failure on the D-xylose test in man. Gastroenterol Clin Biol, 1988, 12(6-7), р.542-547. SU 1659853 Al, 30.06.1991. Руководство по клиническим лабораторным исследованиям. /Под ред. Е.А.Кост, Л.Г.Смирновой. - М.: Медицина, 1964, с.466-469. 
(71) Имя заявителя: Дагестанская государственная медицинская академия 
(72) Имя изобретателя: Гарунова Р.Э.; Гасанова П.О.; Мусалов Г.Г.; Сулаквелидзе Т.С. 
(73) Имя патентообладателя: Дагестанская государственная медицинская академия 
(98) Адрес для переписки: 367012, г.Махачкала, пл. Ленина, 1, ДГМА, патентный отдел 

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЛАЗМАТИЧЕСКОГО КЛИРЕНСА ПОЧЕК 

Изобретение относится к медицине, а именно к нефрологии и может быть использовано при клинических и экспериментальных исследованиях. Сущность способа состоит в том, что микрометодом определяют концентрацию Д-ксилозы через 5 мин после внутривенного введения (P1), через 25 мин (P2), а общий плазматический клиренс определяют по формуле



где Y - внутривенно введенная доза Д-ксилозы; t1 и t2 - промежутки времени, через которые определяют концентрацию Д-ксилозы. Техническим результатом является получение количественной характеристики состояния фильтрационной способности почек без измерений объема и анализа мочи. 1 табл. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к медицине, а именно нефрологии, урологии и при клинических и экспериментальных исследованиях, где необходимо определить фильтрационную способность почек без измерения и анализа состава мочи.

При оценке "очищения" плазмы от какого-либо вещества (клиренса) падение плазматической концентрации исследуемого вещества может носить различный характер:

1 - линейное падение концентрации исследуемого вещества после однократного внутривенного введения;

2 - неправильное падение уровня концентрации исследуемого вещества при однократном внутривенном введении

3 - экспоненциальное падение. (Шюк О. Функциональные исследования почек, 1981; Dederding J. P. et al. Influence of chronic renal failure on the D-xylose test in man. - Gastroenterol. Clin. Biol., 1988, 12(6-7), p.542-547).

При линейном падении плазматической концентрации исследуемого вещества в единицу времени из соответствующего пространства распределения каждый раз теряется одинаковое количество внутривенно введенного вещества. Плазматический клиренс определяют по количеству вещества, исчезающего в единицу времени из соответствующего пространства распределения.

Этот способ имеет следующие недостатки:

- расчеты, производимые при этом, не всегда точны;

- сам процесс определения пространства распределения трудоемкий;

- нет возможности определить константу скорости исчезновения.

Неправильное падение плазматической концентрации исследуемого вещества наблюдается, к примеру, при введении инулина. Инулин после внутривенного введения выделяется практически только почками, поэтому можно рассчитать плазматическое очищение за определенный промежуток времени.

Этот способ имеет следующие недостатки:

- требует поддержания постоянного уровня инулина в крови;

- отсюда необходимо дополнительное в/в введение его для обеспечения постоянства при названных условиях уровня инулинемии;

- выделение инулина не всегда адекватно тяжести патологического процесса.

Прототип. Способ определения плазматического клиренса после однократного внутривенного введения стерильного раствора инулина наиболее близок к предлагаемому нами, поэтому он взят в качестве прототипа (Шюк О. Функциональное исследование почек, 1981).

Принцип метода по прототипу состоит в том, что после однократного внутривенного введения стерильного раствора инулина в соответствующие промежутки времени определяют концентрацию его в крови. Исследования проводят следующим образом: сначала берут 0,3 мл крови (контроль), затем однократно внутривенно вводят стерильный раствор инулина из расчета 30 мг на кг веса и снова производят забор крови в соответствующие промежутки времени через 5, 25, 45, 65 мин вплоть до полного исчезновения инулина из крови.

Расчет производят по формуле Стр=Y/8, где Y-внутривенно введенная доза, S - пространство (площадь) распределения ограниченной кривой плазматических концентраций инулина в крови и осью X. Для определения S пространство, ограниченное кривой плазматических концентраций и осью X, делят на простые геометрические фигуры (треугольники, трапеции) которые они образуют. Вычисляют площади каждой фигуры и суммируют их.

Этот способ имеет следующие недостатки:

- одним из условий является забор образцов до полного исчезновения инулина из крови, что усложняет проведение исследования;

- инулин выделяется почками не экспоненциально, а кривая падения плазматической концентрации носит неправильный характер;

- при некоторых патологических состояниях почек результаты не всегда адекватны тяжести патологического процесса.

При экспоненциальном падении плазматическая концентрация исследуемого вещества за одинаковый промежуток времени снижается во всех случаях на одинаковую долю исходной концентрации.

Целью изобретения является получение количественной характеристики состояния фильтрационной способности почек без измерений объема и анализа мочи.

Сущность изобретения

Предлагаемый способ основан на том, что после однократного внутривенного введения раствора Д-ксилозы падение ее плазматической концентрации носит экспоненциальный характер. Это дает возможность определить скорость исчезновения и соответственно плазматический клиренс. Предлагаемый способ выполняют следующим образом. Сначала берут из вены 0,3 мл крови для контроля. Затем одномоментно внутривенно вводят стерильный 20%-ный раствор Д-ксилозы из расчета 125 мг на кг веса Через 5 минут и 25 минут после введения Д-ксилозы производят заборы крови по 0,3 мл. Концентрацию Д-ксилозы в крови определяют микрометодом, разработанным Гасановой П.О. и Шамовым И.А., удостоверение 02930 отраслевого значения.

Микрометод определения содержания Д-ксилозы в крови.

Принцип метода основан на образовании фурфурола при нагревании Д-ксилозы в присутствии ледяной уксусной кислоты. Фурфурол с параброманилином дает розовое окрашивание, интенсивность которого определяется на ФЭКе или спектрофотометре при длине волны 540 нм.

Реактивы: 1) П-броманилин, 2) ледяная уксусная кислота, х/ч, 3) тиомочевина, 4) трихлоруксусная кислота (крист.), 5) NaOH (крист.), 6) Д-ксилоза.

Приготовление реактивов

1. 2%-ный параброманилиновый реактив. В 100 мл ледяной уксусной кислоты тщательно растворить 500 мг тиомочевины и добавить 2 г п-броманилина. Хранить в темной посуде, срок годности 1 неделя.

2. 16%-ный раствор ТХУ (трихлоруксусная кислота). Взвесить 8 г ТХУ и поместить в 50 мл колбу и долить дистиллированной водой до метки.

3. 1%-ный раствор NaOH. Взвесить 2 г NaOH поместить в мерную колбу емкостью 50 мл и долить дистиллированную воду до метки. Хранить в прохладном месте, срок годности 1 неделя.

4. Стандартный раствор 100 г/л (0,1 мг/мл). Взвесить 10 мг Д-ксилозы, поместить в 100 мг колбу и налить дистиллированной воды до метки. Хранить в прохладном месте, срок годности 1 неделя.

Условия для измерения

В помещении не должно быть сквозняков и температура должна быть не менее +19oС, потому что ледяная уксусная кислота кристаллизуется при +18oС.

Проведение анализа (см. таблицу).

Содержимое пробирок перемешивают. Пробу и контроль центрифугируют при скорости 3000 об/мин, осторожно берут 0,2 мл прозрачной надосадочной жидкости помещают в чистую пробирку. В пробу и контроль прибавляют 0,1 мл NaOH и 0,4 мл дистиллированной воды и во все пробирки по 1 мл п-броманилинового реактива. Все пробирки помещают в кипящую водяную баню на 20 минут, затем на 80 минут помещают в темное место. Интенсивность полученной окраски измеряют на ФЭКе или спектрофотометре: пробу против контроля, стандартный раствор против дистиллированной воды. Расчет содержания Д-ксилозы производят по формуле:



По данному способу общий плазматический клиренс определяют по формуле:

,

где Y - внутривенно введенная доза Д-ксилозы;

t1 и t2 - промежутки времени, через которые определяют концентрацию Д-ксилозы;

Р1 - концентрация Д-ксилозы в крови через 5 минут после внутривенного введения;

P2 - концентрация Д-ксилозы в крови через 25 минут после внутривенного введения.

В норме падение плазматической концентрации носит экспоненциальный характер, т. е. за одинаковый промежуток времени концентрация вещества уменьшается на одинаковую величину. Это обусловлено тем, что скорость экскреции величина постоянная.

При патологии, соответственно тяжести патологического процесса уменьшается скорость экскреции, длительнее держится ксилоземия, и соответственно уменьшается плазматический клиренс. Так как внутривенное введение Д-ксилозы не введено в фармакопею, хотя прием внутрь широко применяется для исследования всасывательной способности кишечника у больных, апробация нового способа была проведена на собаках. В дальнейшем после введения в фармакопею способа внутривенного введения Д-ксилозы, исследование планируется провести на больных.

Пример конкретного выполнения

В качестве примера конкретного выполнения взяты исследования, проведенные на собаках (лабораторный журнал, протоколы экспериментов от 21.09.99; 10.10.99; 20.10.99; 28.10.99; 12.11.99). Исследования проводились в три этапа: контрольный период - до дачи наркоза, период после наркоза и после полной поперечной перерезки спинного мозга. О функциональном состоянии почек судили по общему анализу мочи, креатинину и мочевине в крови.

В качестве примера приводим исследование, проведенное на собаке весом 8 кг (вводили 5 мл 20%-ного раствора Д-ксилозы внутривенно).

Контрольный период; общий анализ мочи: цвет соломенно-желтый, белок - нет, удельная плотность 1025, лейкоциты 0-1, эритроцитов - нет, креатинин крови 86,3 мкмоль/л, мочевина 8,2 млмоль/л, клиренс инулина 82 мл/мин, общий плазматический клиренс Д-ксилозы 80 мл/мин.

Исследования, проведенные после дачи наркоза тиопентала натрия из расчета 40 мг на кг веса. Общий анализ мочи: цвет соломенно-желтый, белок 0,3 г/л, удельная плотность 1020, лейкоциты 4-6, эритроцитов 8-10, креатинин крови 90,9 мкмоль/л, мочевина 9,3 млмоль/л, общий плазматический клиренс инулина 76,2 мл/мин, общий плазматический клиренс Д-ксилозы 72,3 мл/мин.

Исследования, проведенные через 10 дней после дачи наркоза, показали, что клиренс инулина и Д-ксилозы на уровне контрольных данных, как и остальные показатели. В дальнейшем этой же собаке произвели полную поперечную перерезку спинного мозга на уровне Тп7-Тп8. Общий анализ мочи: цвет мясных помоев, белок 0,9 г/л, удельная плотность 1015. лейкоциты 8-10, эритроцитов - большое количество, креатинин крови 156,0 мкмоль/л, мочевина 10,4 млмоль/л, плазматический клиренс инулина 70,2 мл/мин, плазматический клиренс Д-ксилозы 65 мл/мин.

Исследование, проведенные через 10 дней после перерезки, показали дальнейшее снижение клиренса Д-ксилозы и инулина.

Из приведенных выше примеров видно, что предлагаемый способ определения плазматического клиренса Д-ксилозы соответствует известному способу определения плазматического клиренса инулина и адекватно отражает состояние фильтрационной способности почек в норме и при патологических процессах, приводящих к изменению этой функции.

Отличительные признаки предлагаемого способа от прототипа:

1) пространство распределения по прототипу определяется суммой площади геометрических фигур, которые образованы кривой падения плазматических концентраций и осью X, что является трудоемким, пространство распределения по предлагаемому способу определяется математической формулой: тр=КДU;

2) падение плазматической концентрации Д-ксилозы в отличие от инулина происходит экспоненциально, что дает возможность определить константу скорости исчезновения;

3) Д-ксилоза в отличие от инулина после внутривенного введения быстро распределяется в организме, через 3-5 мин максимально концентрируется и выделяется соответственно концентрации ее в крови.

Положительный эффект: предлагаемый способ не требует длительного времени для проведения исследования. Микрометод для определения концентрации Д-ксилозы в крови высокочувствительный и легкодоступный. Нагрузочная доза переносится хорошо, без побочных явлений. Данный способ дает возможность получить количественную характеристику состояния начального этапа мочеобразования (фильтрации) без измерения объема и анализа состава мочи. Определение общего плазматического клиренса данным способом раскрывает новые возможности в изучении функционального состояния почек в эксперименте и в клинической практике, а также при исследованиях по изучению кинетики лекарственных веществ в организме. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



Способ определения плазматического клиренса почек по клиренсу Д-ксилозы, отличающийся тем, что микрометодом определяют концентрацию Д-клилозы через 5 мин после внутривенного введения (P1), через 25 мин (Р2), а общий плазматический клиренс определяют по формуле



где Y - внутривенно введенная доза Д-ксилозы;

t1 и t2 - промежутки времени, через которые определяют концентрацию Д-ксилозы.