СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ХРОНИЧЕСКОГО ГЕПАТИТА ИЛИ ЦИРРОЗА ПЕЧЕНИ

СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ХРОНИЧЕСКОГО ГЕПАТИТА ИЛИ ЦИРРОЗА ПЕЧЕНИ


RU (11) 2295351 (13) C1

(51) МПК
A61K 35/14 (2006.01)
A61P 1/16 (2006.01) 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 29.08.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(14) Дата публикации: 2007.03.20 
(21) Регистрационный номер заявки: 2006101926/14 
(22) Дата подачи заявки: 2006.01.17 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2005.06.14 
(45) Опубликовано: 2007.03.20 
(56) Аналоги изобретения: WO/2005/007073, 27.01.2005. RU 2160112 C1, 10.12.2003. СЕЧКИН А.В. Переход на молекулярно-генетические методы HLA-селекции донора и новые перспективы клинической трансплантологии. Текст, док. Найдено из Интернет: <URL: www.immune.umos.ru/magazine/allg/allg0001.htm 30.01.2003. ДОЛБИН А.Г. и др. Обследование донора и реципиента в клинике
трансплантации органов. Текст, док. Найдено из Интернет: <URL: http://compaq.viniti.ru/biolweb/el_journ/allg/allg0010.doc 06.11.2000. ISHKAWA F. et al. Transplanted human cord blood cells give rise to hepatocytes in engrafted mice. Ann N Y Acad Sci. 2003 May; 996: 174-85. LEE E. et al. Recombinant human (rh) stem cell factor and rhIL-4 stimulate differentiation and proliferation of CD3+ cells from umbilical cord blood and CD3+ cells enhance FcepsilonR1 expression on fetal liver-derived mast cells in the presence of rhIL-4. Cell Immunol. 2003 Nov; 226(1): 30-6.

(62) Сведения о предыдущих заявках: 2005118850 14.06.2005 
(72) Имя изобретателя: Генкин Дмитрий Дмитриевич (RU); Сурков Кирилл Геннадиевич (RU) 
(73) Имя патентообладателя: Генкин Дмитрий Дмитриевич (RU); Сурков Кирилл Геннадиевич (RU) 
(98) Адрес для переписки: 192007, Санкт-Петербург, а/я 146, ООО "АИС поли-ИНФОРМ-патент", пат.пов. О.Л.Синдигурскому 

(54) СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ХРОНИЧЕСКОГО ГЕПАТИТА ИЛИ ЦИРРОЗА ПЕЧЕНИ
Изобретение относится к медицине, в частности, к гастроэнтерологии, и касается лечения хронического гепатита или цирроза печени. Для этого осуществляют введение в кровь больного таких мононуклеарных клеток пуповинной крови донора, которые имеют набор антигенов HLA-A, HLA-B, HLA-DR, отличный от набора антигенов HLA-A, HLA-B, HLA-DR реципиента не менее, чем по четырем антигенам. При этом количество вводимых клеток составляет от 2,5×10 6 до 10×106 клеток на кг массы тела в сутки. Курс введения мононуклеарных клеток пуповинной крови донора составляет от 2 до 10 раз с интервалом 10-60 дней. При введении меньших, по сравнению с известными, доз мононуклеарных клеток пуповинной крови, способ обеспечивает нормализацию клинико-биохимических показателей и эффективное снижение копий вируса гепатита в крови больных и уменьшение токсических или иммунопатологических реакций. 2 з.п. ф-лы, 1 табл.




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Изобретение относится к медицине и может быть использовано для лечения заболеваний печени, а именно хронического гепатита или цирроза печени различной этиологии.

Пуповинная кровь представляет собой кровь новорожденного, остающуюся в плаценте и пуповине после родов. Эта кровь богата мононуклеарными клетками, среди которых значительную часть составляют так называемые стволовые клетки, то есть клетки, находящиеся на ранних этапах дифференцировки и дающие начало развитию многих органов и тканей. Выделение и использование этих клеток в медицине связано в первую очередь с тем, что мононуклеарные клетки пуповинной крови содержат большое количество клеток-предшественников гемопоэза - гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). Фракция мононуклеарных клеток, выделенных из пуповинной крови, используется как альтернативный источник ГСК при пересадке (трансплантации) костного мозга. Клетками, ответственными за замещение больных клеток реципиента при трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), считаются так называемые CD 34 - позитивные клетки, то есть клетки, содержащие на своей поверхности маркер-антиген CD 34, и обладающие наибольшим клоногенным (колониеобразующим) потенциалом. Как известно, стволовые клетки пуповинной крови морфологически относятся к так называемым мононуклеарным клеткам (МНК), которые, в свою очередь, являются частью пула ядросодержащих клеток (ЯСК) пуповинной крови. Мононуклеарные клетки (лимфоциты и моноциты в сумме) составляют примерно 1/3 часть от всех ядросодержащих клеток (лейкоцитов) пуповинной крови.

Пересадка (трансплантация) мононуклеарных клеток пуповинной крови применяется в медицинской практике с 80 годов XX века. Основным показанием для пересадки стволовых клеток пуповинной крови являлись заболевания крови, вызванные врожденным (генетическим) дефектом поли-, плюро-, или олигопотентных клеток кровяного ростка костного мозга и/или их злокачественной трансформацией, а также преодоление последствий тяжелой миелосупрессии различного генеза. Для достижения репопуляции при пересадке пуповинных клеток донора (замещении своих больных клеток чужими здоровыми) применяются два основных приема:

- подбор пары "донор-реципиент" по совпадению антигенов основного комплекса гистосовместимости человека (HLA) и системе групп крови АВО и резус-фактору;

- подавление иммунологического ответа самого реципиента для приживления чужих пересаженных клеток.

Однако в случае успешной репопуляции клеток донора чужие пересаженные клетки могут вызвать тяжелые иммунопатологические явления, в частности, реакцию «трансплантат против хозяина» (РТПХ).

Таким образом, подбор пары "донор-реципиент" является с одной стороны, определяющим успех приживления, а, с другой стороны, самым сложным в техническом плане, поскольку даже у идентичных по HLA типу людей может возникнуть реакция отторжения трансплантата и\или РТПХ.

Таким образом, современные представления диктуют необходимость наибольшего совпадения антигенов основного комплекса гистосовместимости человека как основы эффективной трансплантации аллогенных клеток.

В течение последних лет предлагались методы лечения различных заболеваний мононуклеарными клетками пуповинной крови, основанные на замещении этими донорскими клетками погибших и/или не способных к регенерации клеток реципиента.

Известен способ лечения расстройств кровообращения, в том числе инфаркта миокарда, путем введения клеток пуповинной крови человека US 2004/0197310 А1. В способе предложено введение «эффективных» количеств мононуклеарных клеток из пуповинной крови человека либо непосредственно в зону инфаркта, либо в системный кровоток. Лечебный эффект при этом основан на приживлении пуповинных клеток донора в организме хозяина и их дифференцировке в кардиомиоциты. Однако при этом необходима высокая степень иммунологической совместимости клеток донора с клетками реципиента, что делает способ технически малоосуществимым. Согласно US 2004/0197310 А1 рекомендуется сопровождение введения пуповинных клеток подавлением иммунного ответа реципиента.

Известен также способ лечения заболеваний с воспалительным компонентом, к которым относятся цирроз и хронический гепатит, путем введения в кровь ядросодержащих стволовых клеток пуповинной крови или клеток, происходящих из пуповинной крови, в количестве не менее 5×109 ядросодержащих клеток, WO 2004/071283. Данный способ наиболее близок к заявляемому изобретению и принят в качестве его прототипа.

При реализации способа-прототипа не требуется предварительного подавления иммунного ответа больного, не требуется предварительного HLA-типирования (изучения гистосовместимости) донора и реципиента. Однако для его осуществления необходимы чрезвычайно большие количества клеток (не менее 5×10 9 ядросодержащих клеток). Количество ядросодержащих клеток в порции пуповинной крови от одного новорожденного не превышает 2,8×109, причем клетки собственной пуповинной крови можно взять у человека (донора) только один раз (при его рождении). Этого количества недостаточно для реализации способа-прототипа. Таким образом, реализация способа-прототипа требует не только одномоментного введения в организм значительного количества чужеродных клеток (несущих чужеродные антигены), но и клеток пуповинной крови от разных доноров, т.е сложного «коктейля» чужих антигенов. Не учитывается степень соотношения иммуногенности/иммунотолерантности вводимых клеток по отношению к пациенту, обусловленная степенью гистосовместимости тканей пациента и донора. При этом резко возрастает риск аллергических, в том числе анафилактических реакций, а также риск развития других иммунопатологических состояний, включаю иммунодепрессию, вызванную атакой чужих клеток белой крови против собственной иммунной системы больного. В способе-прототипе для того, чтобы добиться клинического эффекта с помощью стволовых клеток пуповинной крови, необходимо одномоментно вводить значительное количество ядросодержащих клеток. Если же объединять стволовые клетки от разных доноров, то резко возрастает риск возникновения иммунопатологических реакций на такой сложный спектр антигенов, в том числе «минорных» антигенов гистосовместимости. Кроме того, одновременная иммунизация клетками (антигенами) различных доноров, как это предполагается при осуществлении способа-прототипа, приводит к невозможности повторного применения метода у того же больного. Попытки реализации способа-прототипа для лечения названных заболеваний в 5 случаях из 10 привели к токсическим и аллергическим реакциям с развитием у всех больных иммуносупрессии в течение 7-30 дней после введения. Попытка повторного применения способа-прототипа у больных приводила к токсико-аллергическим реакциям у большинства пациентов, у которых способ-прототип уже был ранее применен.

Задачей настоящего изобретения является снижение риска токсических и иммунопатологических осложнений.

Согласно изобретению в способе лечения хронического гепатита или цирроза печени вводят в кровь мононуклеарные клетки пуповинной крови донора, имеющие набор антигенов HLA-A, HLA-B, HLA-DR, отличный от набора антигенов HLA-A, HLA-B, HLA-DR реципиента не менее, чем по четырем антигенам. Количество вводимых клеток составляет от 2,5×10 6 до 10×106 клеток на кг массы тела пациента в сутки; введение таких клеток может быть повторено от 2 до 10 раз с интервалом 10-60 дней.

Система распознавания «свой-чужой» у человека представлена белками основного комплекса гистосовместимости (ОКГ), которые обозначаются в литературе аббревиатурой HLA (Human Leukocyte Antigens - система лейкоцитарных антигенов). Основной иммунологической задачей этих поверхностных белков является участие в распознавании чужеродного антигена иммунной системой организма. Белки HLA связываются с антигеном и представляют («презентируют») его на поверхности клетки. Только в таком виде Т-лимфоцит человека узнает чужой антиген. При этом индуцируется иммунный ответ, призванный элиминировать чужеродный антиген из организма. Часть белков ОКГ (так называемый класс I) представляет собой одноцепочечные аминокислотные цепи, которые прикрепляются к поверхности клетки с помощью молекулы ( 2 - микроглобулина. К белкам этого класса относятся белки HLA-A, HLA-В и HLA-С. Один такой белок кодирован соответственно одним геном. Другой класс белков (класс II) относится к двуцепочечным димерным молекулам, состоящим из альфа- и бета-цепей. Таким образом, для кодирования каждой молекулы II класса ОКГ требуются 2 отдельных гена. Существует также и III класс белков ОКГ. Гены, кодирующие белки основного комплекса гистосовместимости, тесно сцеплены и находятся на коротком плече 6-й хромосомы.

Белки ОГК не только отвечают за презентацию чужеродных белков защитной (иммунной) системе организма, но и сами являются сильнейшими антигенами в отношении другого организма, на которые развивается иммунный ответ при введении их в этот другой организм. Нужно подчеркнуть, что белки (антигены) ОКГ продуцируются также и самими антигенпрезентирующими клетками - В-лифоцитами, активированными макрофагами, дендритными клетками.

Гены HLA принято обозначать так же, как антигены HLA. Названия генов и антигенов HLA состоят из одной или нескольких букв и цифр, например A3, В18, DR13, DQ4. Буква означает ген, а цифра означает аллель этого гена.

Гены HLA обладают высоким полиморфизмом. Вся совокупность генов HLA одного индивидуума нередко обозначается как генотип HLA. Вся совокупность антигенов HLA, представленных на поверхности клеток, обозначается как фенотип HLA.

Белки (антигены) I класса ОГК - HLA-A, HLA-B и HLA-C - кодируются тремя отдельными парами генных локусов. Белки I класса представлены на клеточной поверхности клеток практически всех тканей организма. Продукт (белок) гена четвертого локуса I класса (HLA-G) продуцируется только клетками трофобласта.

Область генома, где находятся гены, кодирующие белки ОКГ II класса, носит название D-области и подразделяется на DP, DQ и DR районы, каждый из которых кодирует двухцепочечный поверхностный белок в виде альфа- и бета-цепей. Соответственно, белки (антигены), кодированные этими генами, носят название HLA-DP, HLA-DQ и HLA-DR и выводятся на поверхность клетки в виде DP-альфа-бета, DQ альфа-бета и DR-альфа-бета белков.

Гены HLA наследуются кодоминантно (т.е. каждый из генов вносит вклад в появление признака, т.е. особенность соответствующего белка) и передаются потомству двумя блоками - по одному от каждого родителя. Такой блок называется гаплотипом HLA. Таким образом, все ядросодержащие клетки человека имеют четыре пары антигенов (А, В, С и D), - по 8 HLA антигенов (белков) на клетку, из которых 4 белка унаследованы от одного, а 4 от другого родителя. Локусы HLA генов расположены близко по отношению друг к другу и обычно наследуются от каждого родителя практически без рекомбинаций (реарранжировок) внутри блока (гаплотипа). Частота рекомбинаций внутри гаплотипа HLA оставляет около 1%, и поэтому среди потомства двух родителей имеется приблизительно 25% случаев полного диплоидного совпадения HLA антигенов, 50% случаев одно-гаплотипного сходства HLA антигенов и 25% случаев полного несоответствия HLA антигенов.

Поскольку набор антигенов (белков) ОГК главного комплекса гистосовместимости у разных индивидуумов различен, то при введении клеток одного человека (донора) в организм другого (реципиента) возникает несовместимость клеток донора с клетками реципиента. Преодоление барьера гистонесовместимости всегда являлось главным стимулом исследования генов и белков ОГК, а разработка методов ее преодоления - основным ключом к проблеме отторжения пересаженных чужеродных органов, тканей и клеток в трансплантологии и клеточной инженерии человека.

Понятно, что обеспечить полную совместимость по всем известным антигенам HLA невозможно. Однако многолетний опыт трансплантологии показал, что различия не всех антигенов (белков) имеют клиническое значение, т.е. несовпадение не по всем белкам ОКГ оказывает одинаковое влияние на вероятность приживления трансплантата. Оказалось, что порой необходимо и достаточно для успешной пересадки тканей и клеток подобрать донора и реципиента, совместимых по 3-4 антигенам системы HLA, несмотря на то, что другие антигены гистосовместимости, называемые «минорными», могут вызывать реакцию отторжения со стороны иммунной системы реципиента, хотя и менее сильную. В случае неудачного сочетания нескольких таких «минорных» антигенов может возникнуть острая реакция отторжения. Молекулярная основа несоответствия по «минорным» антигенам неизвестна, но предполагается, что она связана с полиморфизмом нормальных, непатологических собственных антигенов. При пересадке чужих иммунокомпетентных клеток донора (или их предшественников) в иммунокомпрометированный организм реципиента возникает другая серьезная проблема - так называемая «реакция трансплантации против хозяина (РТПХ)». Опасность РТПХ актуальна особенно в тех случаях, когда для успешной трансплантации организм реципиента предварительно подвергается иммуносупресии. Ослабленная иммунная система реципиента не может отторгнуть иммунокомпетентные Т-клетки донора, которые приживляются и начинают вызывать собственный иммунный ответ против клеток реципиента, реагируя на различия по белкам - антигенам ОКГ. РТПХ может быть острой или хронической. Вероятность развития и течение РТПХ зависит от генетических различий между клетками донора и реципиента, количества донорских клеток и их фенотипа. Даже если донор и реципиент являются сиблингами, то есть они полностью генотипически HLA - совместимы по всем определяемым локусам, частота РТПХ остается весьма высокой (от 30-70%), что также связано с различиями по «минорным» антигенам.

Все же, в клинике максимальную тканевую совместимость удается достичь подобрав пару донор-реципиент, идентичную по ОКГ класса II, в частности белку HLA-DR, а также двум других белкам, относящимся к классу I, а именно HLA-А и HLA-B. Такое предварительное определение набора белков ОКГ у донора или реципиента получило название HLA-типирование. С учетом того, что каждый индивидуум имеет две разновидности каждой из этих молекул (одну от матери, другую от отца) HLA-типирование может быть представлено как определение характеристик каждого из 6-ти белков ОКГ на поверхности клеток, то есть по одной паре видов каждого из трех белков: HLA-А, HLA-B и HLA-DR. При полном совпадении всех 6-ти антигенов донора с 6-ю антигенами реципиента пара донор-реципиент считается «совместимой по 6-ти антигенам». Соответственно, если говорить о генах, кодирующих эти белки, то в таком случае 6 аллелей донора совпадают с 6 аллелями реципиента. Если клетки донора и реципиента совпадают по 4 из 6-ти (HLA-А, HLA-B и HLA-DR) возможных аллелей (и соответственно, по 4 из 6 белков, которые эти аллели кодируют), то такие индивидуумы имеют «несовместимость по двум антигенам». Такое разнообразие вариантов наборов белков (и соответственно генов) ОКГ называется полиморфизмом ОКГ. Технологически типирование осуществляется либо серологическими методами (путем иммунологической детекции с помощью антител против конкретного белка - антигена ОКГ) либо молекулярными методами (путем распознавания самого гена, кодирующего данный белок в геноме клетки индивидуума). HLA - тип для индивидуума выражается набором букв и цифр. Сначала следует буквенное обозначение (белка) гена и затем цифровое обозначение варианта белка (аллеля этого гена), затем обозначение следующего белка (гена) и его вариантов (аллелей гена) и т.д. Например, А 2,3 В 5,15 DR 01,15. Совершенствование методов распознавания различий между белками ОКГ (и соответственно аллелей их генов) приводит к дальнейшему «дроблению» обозначений аллелей. Аллель, первоначально обозначенный и серологически определяющийся как В15, впоследствии на самом деле оказался совокупностью двух аллелей В62 и В75.

После введения стволовых клеток донора в организм реципиента, с одной стороны, происходят процессы, направленные на интеграцию этих клеток в ткани реципиента с их дальнейшим размножением и/или дифференцировкой в функционально зрелую ткань, а, с другой стороны, происходит процесс, направленный на элиминацию введенных клеток из организма. При пересадке, например, чужого костного мозга донора, содержащего гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) ставится совершенно определенная задача: новые клетки должны прижиться в новом для них организме и дать начало кроветворному ростку (репопулировать костный мозг). Результирующая этих двух процессов (репопулирования и элиминации) определяет дальнейшую судьбу введенных стволовых клеток. Сами же стволовые клетки донора, попав в организм реципиента, выделяют огромное количество факторов роста, гормонов и цитокинов, совокупность действия которых приводит к тем или иным биологическим (в том числе лечебным) эффектам. Иммунологический ответ организма хозяина на чужие клетки вызывает выброс большого количества медиаторов иммунного ответа, то есть сами чужие стволовые клетки являются мощными иммуномодуляторами. Кроме того, стволовые клетки донора могут сами созревать до иммунокомпетентных клеток и вырабатывать собственный иммунный ответ на клетки хозяина, вызывая среди прочего иммуносупрессию. Весь комплекс многофакторных динамических взаимоотношений между клетками донора и организмом реципиента определяется, в первую очередь, степенью иммунологической совместимости клеток донора и клеток хозяина (реципиента). С одной стороны, чем больше стволовая клетка донора по антигенам ОКГ похожа на клетку хозяина, тем дольше она будет циркулировать в его организме и у нее больше шансов на приживление и дальнейшее размножение. С другой стороны, иммунная реакция организма реципиента на эти клетки будет невелика, что ведет к отсутствию необходимого иммуномодулирующего эффекта. Таким образом, биологический эффект от введения чужих стволовых клеток определяется параллельным развитием следующих процессов.

1. Развитие иммунного ответа реципиента на клетки донора.

2. Индукция клетками донора репопуляции собственных стволовых клеток реципиента как путем прямого контакта, так и через гуморальные воздействия на клетки реципиента.

3. Выделение введенными стволовыми клетками биологически активных веществ, в том числе факторов роста, цитокинов, тканевых гормонов, метаболитов.

4. Развитие иммунной реакции клеток донора против клеток реципиента.

5. Репопуляцией клетками донора тканей организма реципиента.

Терапия того или иного конкретного заболевания (с преобладанием конкретного патологического компонента - воспалительного, аутоиммунного, дистрофического, ишемического или фиброзного) с помощью стволовых клеток требует определенного баланса указанных процессов.

Определяющими факторами при этом является следующее.

1. Степень несовместимости по системе ОКГ вводимых стволовых клеток донора и клеток реципиента.

2. Количество введенных чужих стволовых клеток.

Авторами настоящего изобретения обнаружено, что при высокой степени совместимости типов HLA (совпадения по многим HLA-антигенам) между донором стволовых клеток пуповинной крови и реципиентом не удается достичь необходимого терапевтического эффекта при лечении хронического гепатита или цирроза печени.

При этом важную роль в патогенезе играют нарушения функции печени, связанные с расстройством микроциркуляции долек паренхимы печени.

Иммунная система (в том числе моноциты и тканевые макрофаги) играет огромную роль в индукции дифференцировки собственных стволовых клеток организма в клетки вновь образующихся сосудистых коллатералей. При введении клеток донора, совместимых с клетками реципиента более, чем по 2 антигенам (из 3 пар антигенов HLA-A, HLA-В, HLA-DR) не происходит адекватного иммунного ответа на вводимые клетки. При реализации способа-прототипа без учета соотношения потенциальной иммуногенности/иммунотолерантности (обусловленной в, первую очередь, антигенами ОКГ) вводится огромное число клеток, в том числе клеток - предшественников имуннокомпетентных клеток. Это неизбежно приводит либо к иммуносупрессии собственной иммунной системы реципиента, либо к возникновению иных нежелательных иммунопатологических реакций.

Как неожиданно оказалось, для достижения значимого клинического эффекта при названных заболеваниях печени стволовые клетки пуповинной крови донора должны отличаться от клеток реципиента как минимум по 4 антигенам из 6 антигенов (3 пары: HLA-А, HLA-B и HLA-DR). То есть донор и реципиент должны быть «несовместимы как минимум по четырем антигенам». Серия выполненных авторами тестов «в смешанной культуре лимфоцитов», которая широко используется при выявлении совместимости тканей донора и реципиента, показала, что только при указанном антигенном различии в среде культивирования нарабатывается достаточное количество трофических и ростовых факторов, биологически активных веществ, способных влиять на образование и рост сосудов. Лимфоциты реципиента и мононуклеарные клетки пуповинной крови донора культивировали совместно при 37 градусах Цельсия 5 дней, отделяли клетки центрифугированием и определяли in vitro ангиогенную активность культуральной жидкости с использованием модели культивируемых клеток аорты быка, внедренных в фибриновый гель, поддерживаемый нейлоновой мембраной. Пробы культуральной жидкости вносились в среду культивирования клеток аорты, и определялась скорость роста сосудистого диска (пятна сосудообразования) в фибриновом геле. Ангиогенная активность культуральной жидкости смешанной культуры лимфоцитов проявлялась лишь в том случае, если клетки донора и реципиента различались как минимум по 4 антигенам из 6 антигенов (3 пары: HLA-А, HLA-B и HLA-DR). Если клетки донора отличались от клеток реципиента только на 3, 2 или 1 антиген из 6, ангиогенный эффект не проявлялся.

При клиническом применении мононуклеарных клеток пуповинной крови лечебный эффект при циррозе печени и хроническом гепатите проявлялся только в том случае, если клетки донора и реципиента различались минимум по 4 антигенам из 6 антигенов. Авторами настоящего изобретения установлено, что если донор и реципиент были совместимы более, чем по 2 антигенам (т.е. по 3, 4, 5 или 6 антигенам из 3 пар: HLA-А, HLA-B и HLA-DR), то введение стволовых клеток пуповинной крови не приводило к лечебному эффекту при названных заболеваниях.

При использовании заявляемого способа эффективная доза мононуклеарных клеток пуповинной крови составляет при введении в кровоток от 2,5×106 до 10×10 6 МНК на 1 кг веса человека, что соответствует не более 1×109 МНК или не более 3×10 9 ЯСК на пациента. Таким образом, используется в 3 раза меньше клеток, чем в способе-прототипе. Это позволяет использовать для лечения клетки пуповинной крови только одного донора, так как количество пуповинной крови одного донора и соответственно количество стволовых клеток пуповинной крови одного донора ограничено.

При применении заявляемого способа ни в одном случае не возникло токсических или иммунопатологических реакций

Настоящее изобретение иллюстрируется следующими примерами.

ПРИМЕР 1. Лечение хронического гепатита

Больной И., 26 лет. Поступил в стационар с жалобами на слабость, ноющие боли в правом подреберье, интенсивную желтуху. По данным биохимического анализа крови обнаружено повышение содержание билирубина - 184,5 мкмоль/л (норма: 6,5-20,5 мкмоль/л), активности аланиновой (АлАТ) - 1280 ед/л (норма: 5-40 ед/л) и аспарагиновой (АсАТ) - 1400 ед/л (норма: 5-40 ед/л) аминотрансфераз, щелочной фосфатазы (ЩФ) - 304,2 МЕ/л (норма: <117 МЕ/л), гамма-глютамилтранспептидазы (ГГТП) - 125 МЕ/л (норма: <50 МЕ/л). Обращали на себя внимание жалобы астенического характера и наличие желтухи.

Пять лет назад перенес острый вирусный гепатит С, после чего неоднократно госпитализировался с признаками внутрипеченочного холестаза, лихорадкой и ломотой в суставах. Клинический диагноз (верифицирован морфологически): хронический гепатит С, активный, HCV RNA (+). Больной дважды за время болезни подвергался лечению рекомбинантным человеческим интерфероном (по 3 млн. ME три раза в неделю) с рибавирином (1000 мг/сут), курс продолжительностью 4 недели. Однако, несмотря на некоторое уменьшение числа копий вируса в крови (до 0,5 млн/мл), нормализации биохимических показателей достигнуть не удалось, гистологическое исследование биоптата печени показало наличие умеренного портального воспаления и очагового некроза, с признаками фиброза некоторых портальных зон. С согласия пациента ему было проведено лечение заявленным способом. Установленный HLA-тип больного A 3,28 В 13,40 DR 01,07. Введение клеток повторяли несколько раз следующим образом (см. Таблицу 1):

Таблица 1. 
Доза клеток (×106/кг массы тела) HLA-тип клеток донора Интервал после предыдущего введения, дни Количество отличных антигенов HLA-А, HLA-В, HLA-DR донора и реципиента. 
2,5 А 1,3 В 13,35 DR 01,07 - 4 из 6 
3,2 A 1,3 В 13,35 DR 01,07 10 4 из 6 
4,5 A 1,2 В 14,44 DR 02,07 34 5 из 6 
5,0 A 11,23 В 8,14 DR 02,15 22 6 из 6 
5,6 A 11,30 В 2,17 DR 01,02 30 5 из 6 
6,7 A 3,11 В 08,44 DR 01,15 31 4 из 6 
7,0 A 1,28 В 7,40 DR 02,05 30 4 из 6 
8,6 А 3,11 В 14,44 DR 02,07 25 4 из 6 
9,0 А 2,30 В 14,18 DR 02,08 34 6 из 6 
10,0 А 2,3 В 27,35 DR 08,15 60 5 из 6 


Взвесь мононуклеарных клеток пуповинной крови вводили путем внутривенной инфузии.

В процессе проведения лечения отмечалось: улучшение самочувствия, нормализация биохимических показателей. Выявлено существенное уменьшение числа копий вируса гепатита С в крови (менее 100 копий на мл). При контрольном обследовании через 6 месяцев после последнего введения клеток состояние больного остается удовлетворительным. Функциональные пробы печени в норме.

ПРИМЕР 2. Лечение цирроза печени.

Пациент С., 52 года, поступил на стационарное лечение с жалобами на периодические боли в правом подреберье тянущего характера, появляющиеся при сидении, не связанные с приемом пищи. Отмечал также постоянные ноющие боли в левом подреберье, не связанные с приемом пищи и положением тела, временем суток. Повышенная утомляемость, немотивированная слабость, снижение работоспособности, вялость. Уменьшение массы тела. Чувство быстрого насыщения и переполнения желудка, тяжесть в верхнем отделе живота, метеоризм, неустойчивый стул. Тошнота, горечь во рту, сухость, непереносимость жирной пищи, свежеиспеченной сдобы, отрыжка. Снижение либидо.

Болен в течение 3 лет, когда стал отмечать тяжесть и боли в правом подреберье, тошноту, расстройство аппетита, общее недомогание. В этот же период отмечал резкое похудение около 35 кг. После проведенной в тот период биопсии печени поставлен диагноз цирроз печени, активная фаза, декомпенсация по сосудистому типу и субкомпенсация по паренхиматозному типу. Проведено лечение препаратами мембраностабилизирующего и липотропного действия (эссенциале форте), флавоноидами (силимарин), гепабене. Больному была присвоена вторая группа инвалидности. После проведенного лечения (приема верошпирона и церукала) больному стало лучше, но спустя 6 месяцев после проведенного лечения у больного произошел эпизод кровотечение из вен пищевода. Ежегодно лечился в стационаре. Последняя госпитализация в гастроэнтерологическое отделение около года назад с диагнозом: цирроз печени, активная фаза, декомпенсация по сосудистому типу.

При объективном физикальном, инструментальном и лаборантом обследовании выявлен повышенный общий билирубин за счет непрямого, снижение гемоглобина до 82 г/л, и количества эритроцитов 2,84×10 12/л, цветной показатель на нижней границе нормы (0,9), лейкопения (лейкоциты 4,0×107/л), гепатомегалия (край печени выступает за пределы реберной дуги на 3 см, болезненный. При перкуссии выявлено значительное увеличение размеров печени), спленомегалия, синдром портальной гипертензии: расширенные околопупочные вены. Присутствовали асцит - жидкость в брюшной полости, субэктеричность склер, «печеночные ладони», бледно-желтая окраска кожи. При ЭКГ исследовании: горизонтальное положение электрической оси, синусовая тахикардия (ЧСС 107 в минуту), в остальном ЭКГ без изменений. Снижен вольтаж в V, VI отведении.

При биопсии печени выявлен фиброз большинства портальных зон, с небольшим фиброзом долек печени (2 стадия нарушений архитектоники печени по Knodell).

Клинический диагноз: цирроз печени, активная фаза.

Осложнения: спленомегалия, гепатомегалия, портальная гипертензия.

С согласия пациента ему было проведено лечение заявленным способом. Установленный HLA-тип донора А 2,29 В 13,35 DR 02,08, a HLA-тип больного А 1,2 В 7,35 DR 01,07. Таким образом, набор антигенов HLA-A, HLA-B, HLA-DR клеток донора отличался от набора антигенов HLA-A, HLA-B, HLA-DR пациента (реципиента) по 4 антигенам из 6 антигенов. Мононуклеарные клетки пуповинной крови донора вводились в количестве 2,5×10 6 клеток/кг путем внутривенной инфузии, введение клеток (от этого же донора) было повторено через 10, 20, и 60 дней после первого введения. После начала лечения и до выписки больного из стационара, каких-либо негативных сдвигов в клинико-лабораторных показателях не наблюдалось. Больной продолжал принимать гепатопротекторы (эссенциале форте, силимарин, витамины) в обычном режиме. Спустя 4 месяца после выписки больной был повторно обследован. Отмечает улучшение самочувствия, боли в правом подреберье почти не беспокоят, увеличился аппетит, исчезла вялость, масса тела увеличилась на 8 кг. Усилилось либидо. Нормализовался уровень билирубина, исчез асцит, увеличился уровень гемоглобина до 128 г/л, количество эритроцитов до 4,6×1012/л, уровень лейкоцитов крови до 6,1×107/л. При биопсии печени выявлено уменьшение количества фиброзных портальных зон. За время после проведенного лечения кровотечений из расширенных вен не наблюдалось. Уменьшились размеры селезенки, гепатомегалия уменьшилась - край печени выступает на 1,5 см.

ПРИМЕР 3. Лечение хронического вирусного гепатита В.

Больной Н., 38 лет. Поступил в стационар с жалобами на слабость, утомляемость, периодическую тошноту по утрам, кровоточивость десен. За год до этого перенес острый вирусный гепатит В. Проходил лечение в областной клинической больнице. В течение месяца после выписки из стационара сохранялась желтуха. В последующем отмечена нормализация биохимических показателей крови, однако сохранялась виремия. Наблюдался у терапевта поликлиники и в связи с выявленными изменениями биохимических показателей (увеличение уровней аланинаминотрансферазы (АлАТ) до 132 ед/л, асппартатаминтрансферазы (АсАТ) до 56 ед/л, щелочной фосфатазы (ЩФ) до 238 МЕ/л). При поступлении в стационар состояние удовлетворительное. В легких и сердечно-сосудистой системе патологических изменений не обнаружено. Живот в правом подреберье умеренно болезненный. Печень по среднеключичной линии выступает на 2,5 см из-под правого края реберной дуги, эластичной консистенции, безболезненная. Общий анализ крови и мочи не изменены. В БАК найдены следующие отклонения: билирубин - 20,5 мкмоль/л, АлАТ - 123 ед/л, АсАТ - 62 ед/л, ЩФ - 188 МЕ/л. Выявлен методом ПЦР РНК вируса гепатита В. Маркеры других вирусных гепатитов не обнаружены. Отмечено также увеличение IgM - 4 г/л, IgG - 28 г/л, IgA - 9 г/л. По данным УЗИ органов брюшной полости - признаки хронического диффузного заболевания печени. В биопсийном препарате печени: имеется небольшой обрывок инфильтрированного портального тракта, поля светлых гепатоцитов, мелкие зерна бурого пигмента выявляется в цитоплазме некоторых гепатоцитов, расположенных цетролобулярно. Заключение: морфологическая картина умеренно выраженного портального гепатита. Заключительный клинический диагноз: хронический гепатит В, умеренной активности, HBV DNA (+). Хронический гастродуоденит в стадии ремиссии. Больному было назначено лечение рекомбининтным интерфероном - альфа по 5 млн ME 3 раза в неделю подкожно на протяжении 24 недель. Проведенное лечение не привело к нормализации биохимических маркеров заболевания, уровень ДИК вируса гепатита В уменьшился только на одну треть, сохранялись слабость, недомогание, тошнота. С согласия больного ему была проведена терапия заявленным способом. Установленный HLA-тип больного А 1,24 В 35,37 DR 01,07, а HLA-тип донора тип А 3,28 В 7,13 DR 01,08. Таким образом, набор антигенов HLA-A, HLA-B, HLA-DR клеток донора отличался от набора антигенов HLA-A, HLA-B, HLA-DR пациента (реципиента) по 5 антигенам из 6 антигенов. Мононуклеарные клетки вводились в дозе 10,0×10 6 клеток/кг массы тела однократно, путем внутривенной инфузии в течение 2,5 часов со скоростью 10 мл/ч. Непосредственных и отдаленных побочных реакций на лечение заявленным способом не наблюдалось. Проведенные через 21 день после проведения лечения заявленным анализы крови показали практически полное исчезновение ДНК вируса гепатита В из крови, нормализацию уровней ферментов крови.




ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


1. Способ лечения хронического гепатита или цирроза печени, включающий введение в кровь мононуклеарных клеток пуповинной крови донора, отличающийся тем, что имеют набор антигенов HLA-A, HLA-B, HLA-DR, отличный от набора антигенов HLA-A, HLA-B, HLA-DR реципиента не менее чем по четырем антигенам.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что количество вводимых клеток составляет от 2,5·106 до 10·10 6 клеток на кг массы тела в сутки.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что введение мононуклеарных клеток пуповинной крови донора повторяют от 2 до 10 раз с интервалом 10-60 дней.