СПОСОБ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ ПЕЧЕНОЧНЫХ КЛЕТОК В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

СПОСОБ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ ПЕЧЕНОЧНЫХ КЛЕТОК В ЭКСПЕРИМЕНТЕ


RU (11) 2153344 (13) C1

(51) 7 A61K35/407, A61P43/00 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 06.08.2007 - прекратил действие 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2000.07.27 
(21) Регистрационный номер заявки: 99119219/14 
(22) Дата подачи заявки: 1999.09.13 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 1999.09.13 
(45) Опубликовано: 2000.07.27 
(56) Аналоги изобретения: 1. RU 2063760 C1, 20.07.96. 2. US 4908206 A, March, 13, 1990. 3. EP 0754462 A2, 22.01.97. 4. Чистова Л.В. и др. Опыт применения фетальных тканей человека при лечении детей с хроническим вирусным гепатитом и циррозом печени. Трансплантация фетальных тканей и клеток человека. - М., 1996, с.84 - 86. 
(71) Имя заявителя: Башкирский государственный медицинский университет 
(72) Имя изобретателя: Тимербулатов В.М.; Рахматуллин С.И.; Хасанов А.Г.; Тимербулатов М.В.; Каюмов Ф.А. 
(73) Имя патентообладателя: Тимербулатов Виль Мамилович 
(98) Адрес для переписки: 450000, г.Уфа, ул. Ленина 3, Башкирский государственный медицинский университет, патентный отдел 

(54) СПОСОБ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ ПЕЧЕНОЧНЫХ КЛЕТОК В ЭКСПЕРИМЕНТЕ 

Изобретение относится к медицине, а именно к способам трансплантации эмбриональных печеночных клеток в эксперименте. Для этого осуществляют забор печени у эмбриона, которую отмывают в питательной среде N199, затем помещают в свежую среду N199, получают гомогенат, подвергают его центрифугированию, выделяют верхний, средний, нижний слои, отсасывают средний слой и верхнюю часть нижнего слоя, разводят в питательной среде N199 и вводят в воротную вену крысе-реципиенту. Способ позволяет расширить функциональные возможности эмбриональной ткани, увеличить регенерирующую способность печеночной ткани и уменьшить реакцию отторжения. Способ может найти применение в трансплантологии, в частности, при тяжелых дегенеративно-дистрофических поражениях печени. 14 ил. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к области медицины и может найти применение в трансплантологии, в частности, при тяжелых дегенеративно-дистрофических поражениях печени.

Известен способ, по которому осуществляют ортотопическую пересадку печени от донора к реципиенту (журнал "Хирургия", Москва, 1993 г., N 3, стр. 32-44.).

Недостатком данного способа является трудность подбора донора, большая травматичность, сложность, дороговизна оперативного вмешательства, неизбежность реакции отторжения, возможность повторного оперативного вмешательства, вследствие развития тяжелых осложнений в послеоперационном периоде, длительный восстановительный период, необходимость длительного применения дорогостоящих иммунодепрессантов.

Наиболее близким к заявляемому объекту, является способ, при котором исследовали ферментативную деятельность цитохрома Р450 внутри пересаженных небольших кусочков печени эмбриона. Гепатоциты были собраны на 20 день беременности крыс и пересажены в селезенку взрослой особи реципиента. Микроскопическая экспертиза селезенок реципиентов на 4 и 10 недели после трансплантации выявило множество гепатоцитов с шнуроподобными структурами в красной пульпе.

Эти результаты продемонстрировали, что гепатоциты могут быть пересажены в селезенку донора и в дальнейшем расти в селезенках.

(Kato.K; Kato.J; Hodgson.WJ; Abraham.NG; Onodera.K; Imai.M; Kasai.S; Mito. M. "Ферментативная деятельность и выражение цитохрома Р450 внутри эмбриональных гепатоцитов, пересаженных в селезенку крыс", [Internet], Yahoo, Отдел Медицины и Желудочно-кишечной Хирургии, центральная библиотека Нью-Йоркского Медицинского Колледжа, Valhalla, США, сентябрь 1999 г.).

Недостатком данного способа является, опасность возникновения некроза пересаженных тканей в связи с малой вероятностью прорастания сосудами, нарушение гемоциркуляции в селезенке, что может нарушить функции как печени, так и самой селезенки. Этот способ является не физиологичным, так как пересадка производится в селезенку, а не в печень. Так же предполагаем, что в более позднее время произойдет рассасывание основной части пересаженного материала. У пересаженных кусочков ткани, низкая функциональная и регенерирующая активность.

Задачей изобретения является расширение функциональных возможностей, увеличение регенерирующей способности, исключение возникновения реакции отторжения.

Это достигается тем, что осуществляется забор печени у эмбриона, которая отмывается в питательной среде N 199, затем помещается в свежую среду N 199, получают гомогенат в тефлоновом гомогенезаторе, подвергают его центрифугированию, выделяют верхний, средний, нижний слои, отсасывают средний слой и верхнюю часть нижнего слоя, разводят в питательной среде N 199, вводят в воротную вену крысе-реципиенту.

Способ трансплантации эмбриональных печеночных клеток иллюстрируется на морфологических фотоснимках NN 1 - 14.

Фиг. 1. Распад гепатоцитов с образованием жиробелкового детрита. Через 10 дней после введения гомогената. Гематоксилин-эозин. Ок. 10 об.40.

Фиг. 2. Деструктивные и некробиотические изменения гепатоцитов у центральной вены дольки печени. Через 10 дней после введения гомогената. Гематоксилин-эозин. Ок. 10 об. 20.

Фиг. 3. Оксифилия гепатоцитов у междольковой вены. Через 10 дней после введения гомогената. Гематоксилин-эозин. Ок. 10 об. 20.

Фиг. 4. Интенсивное восприятие красителей у ряда гепатоцитов, расположенных вокруг междольковой вены триады печени. Гематоксилин-эозин. Ок. 10 об. 20.

Фиг. 5. Полигональные формы гепатоцитов, имеющие сродство к кислым красителям. Через 10 дней после введения гомогената. Гематоксилин-эозин. Ок. 10 об. 40.

Фиг. 6. Сильно вытянутой формы гепатоциты вокруг центральной вены, дольки печени. Через 10 дней после введения гомогената. Гематоксилин-эозин. Ок. 10 об. 40.

Фиг. 7. Сплошное расположение гепатоцитов с оксифильной цитоплазмой. Через 10 дней после введения гомогената. Гематоксилин-эозин. Ок. 10 об. 40.

Фиг. 8. Тяжистое расположение оксифильно окрашенных гепатоцитов у триады печени. Через 10 дней после введения гомогената. Гематоксилин-эозин. Ок. 10 об. 40.

Фиг. 9. Отдельные гепатоциты с оксифильной цитоплазмой. Через 10 дней после введения гомогената. Гематоксилин-эозин. Ок. 10 об. 40.

Фиг. 10. Большие скопления лимфоидной ткани по ходу кровеносных сосудов. Через 10 дней после введения гомогената. Гематоксилин-эозин. Ок. 7 об. 20.

Фиг. 11. Лимфоидная ткань вокруг кровеносных сосудов печени. Через 10 дней после введения гомогената. Гематоксилин-эозин. Ок. 7 об. 20.

Фиг. 12. Интенсивно окрашенные гепатоциты. Через 20 дней после введения гомогената. Гематоксилин-эозин. Ок. 10 об. 40.

Фиг. 13. Кисточные тяжи с большей окрашиваемостью. Через 20 дней после введения гомогената. Гематоксилин-эозин. Ок. 10 об. 40.

Фиг. 14. Небольшое скопление лимфоидной ткани в периваскулярной зоне триады печени. Через 20 дней после введения гомогената. Гематоксилин- эозин. Ок. 10 об. 20.

Способ восстановления печеночной ткани осуществляется следующим образом. Осуществляется забор зародыша, например, путем лапаротомии, извлекается печень зародыша, отмывается питательной средой N 199, затем помещается в свежую питательную среду N 199, получают гомогенат в гомогенезаторе, с целью получения однородной массы путем механического перетирания, которую разливают в две одинаковые пробирки с равным количеством содержимого. Затем данные пробирки подвергают центрифугированию. После чего содержимое пробирок разделяется на три слоя: верхний, средний, нижний. Каждый слой подвергается тщательному морфологическому исследованию на предмет изучения качественного, количественного состава слоев, жизнеспособности и функциональной активности клеточных структур в них. Отсасывают средний слой и верхнюю часть нижнего слоя, разводят в питательной среде N 199, вводят в воротную вену крысе-реципиенту.

Пример 1. Гомогенезат был получен в тефлоновом гомогенезаторе из 4 печеней эмбриона крысы (от одной самки) и 4 мл питательной среды N 199. Полученный субстрат был отцентрифугирован в течение 30 минут, на скорости 1500 об. мин. После чего гомогенезат разделился на 3 слоя. Каждый слой выделен в отдельную колбу и окрашен: 1) по Романовскому-Гимзе, а также, 2) трипановым синим (краситель, выявляющий погибшие клетки) в концентрации 0,4% раствора. Морфологическое исследование показало, что в верхнем (2,5 мл) слое практически отсутствуют клетки или клеточные структуры, в среднем (1 мл) - основное количество живых гепатоцитов (90 - 95%), а также в небольшом количестве (5 - 10%) - клеточные структуры, лимфоциты, макрофаги и др., в нижнем (0,5 мл) - лимфоциты, макрофаги, клеточные структуры, и в небольшом количестве - гепатоциты.

Было выделено 5 печеней эмбриона от одной самки. После механической очистки, печени были отмыты в питательной среде 199 и помещены в свежую среду N 199 (5 мл). Была произведена гомогенезация в тефлоновом гомогенезаторе (до однородной массы). Гомогенезат отцентрифугировали в 2-х минзурках по 2,5 мл в течение 40 мин при 1500 об. Средний слой (1 мл) после выделения был разведен в 1,5 мл среды N 199.

Эксперимент проводился на 2 белых крысах (m = 250 гр.). Под эфирным наркозом производился верхне-средне-срединный разрез. Часть петель кишечника были выведены наружу через операционную рану, с целью удобства выделения воротной вены. В воротную вену (медленно, инсулиновым шприцем) вводили 0,3 мл раствора полученного гомогената. После введения иглу задерживали в вене на 20 секунд, с целью снижения давления внутри вены. После манипуляции место укола обкладывали петлями кишечника, производили послойное ушивание.

Способ восстановления печеночной ткани осуществляется следующим образом.

Через 10 дней после проведенного эксперимента внутри капилляров и некоторых сосудов определяются скопления гепатоцитов, которые не закрывают весь просвет, тем самым не вызывая нарушение гемодинамики. Отмечается незначительный мелкоочаговый некроз печени, связанный с гибелью некоторых пересаженных гепатоцитов. Распад единичных гепатоцитов долек печени сопровождается образованием жиробелкового детрита и разрушением ядер всех расточных структур (фиг. 1). Как видно из морфологических снимков незначительные некротические изменения серьезно не повлияют на структуру и функции тканей печени. Некоторые гепатоциты, расположенные вокруг очагов некроза печени не имеют четкой границы, ядра их уменьшены в размерах, хроматин плотный. В зоне деструкции располагаются небольшое количество макрофагических клеток, участвующих в фагоцитозе и резорбции некротически измененных структурах печени. Дистрофические и некробиотические изменения чаще всего наблюдаются по периферии дольки в непосредственной близости от крупных кровеносных сосудов (междольковая артерия и вена) и синусоидных капилляров (фиг. 2). Вместе с тем со стороны крупных венозных кровеносных сосудов печени выявляются тяжи гепатоцитов, характеризующиеся более интенсивным восприятием красителей (фиг. 3 и 4). Подобные клетки могут быть полигональной (фиг. 5) или сильно вытянутой формы (фиг. 6). У таких клеток ядро крупное, но с равномерным распределением хроматина, у таких клеток ядрышки не выявляются. Такие клетки могут иметь сплошное расположение (фиг. 7) или могут иметь вид кисточного тяжа (пластинки) (фиг. 8). Цитоплазма окрашивается плотно, но равномерно и оксифильно в большей степени, чем остальные гепатоциты дольки печени (фиг. 9). Митозом разделенные клетки меньшего размера и соответственно их ядра также меньшего размера. Более интенсивно и оксифильно окрашенные гепатоциты встречаются в глубине дольки печени. Они располагаются вдоль печеночных пластинок по ходу синусоидных капилляров, некоторые из них делятся митозом. По периферии долек печени располагаются гепатоциты больших размеров, они чаще всего полигональной формы, умеренной окрашиваемостью, ядро клетки светлое с одним или несколькими ядрышками. Цитоплазма таких клеток имеет ячеистое строение за счет секреторных гранул или гликогена. Вдоль печеночных пластинок проходят макрофагические клетки.

У некоторых экспериментальных животных гепатоз сопровождается образованием очагов лимфоидного кроветворения (фиг. 10). При этом вдоль крупных кровеносных сосудов обнаруживаются достаточно крупного размера скопления лимфоидной ткани. Они могут быть округлой или овальной формы, некоторые из них сопровождают кровеносные сосуды, концентрируясь в периваскулярном пространстве (фиг. 11). Большие скопления лимфоидных клеток, расположенных в непосредственной близости от стенок кровеносных сосудов, сдавливая их, уменьшают просвет кровеносных сосудов и тем самым затрудняют кровообращение через дольки печени. Такого рода скопления лимфоидной ткани может быть в глубине дольки печени по ходу синусоидных капилляров. Они намного меньшего размера, чем скопления лимфоидных клеток по ходу более крупных кровеносных сосудов.

Через 20 дней после проведенного экспериментального исследования в дольках печени мелкоочаговый некроз гепатоцитов не определяется, однако встречаются скопления гепатоцитов без резко выраженной границы клеток, но с базофильной цитоплазмой.

Вероятно, это очаги бывшего некроза гепатоцитов с их постепенным рассасыванием зоны разрушения и заполнения их с делящимися гепатоцитами. Особо интересные морфологические изменения определяются в зоне расположения крупных кровеносных сосудов, особенно вокруг триады печени и центральной вены. На фиг. 12 и 13 видно веерообразное расположение интенсивно окрашивающихся гепатоцитов. Большинство из них вытянутой формы, следуют друг за другом и в целом формируют печеночные пластинки. Рядом с такими же гепатоцитами располагаются полигональной формы клетки, которые составляют основную массу клеток печени, для них также характерна светлая цитоплазма, слабая окрашиваемость ядра и обязательно наличие ядрышка. Интенсивно окрашенные тяжи гепатоцитов растут вглубь дольки по ходу печеночных пластинок. В то же время можно видеть изолированно расположенных гепатоцитов. Наконец в некоторых дольках печени определяется довольно большое скопление гепатоцитов, отличающихся по тинкториальным свойствам от других (собственных) гепатоцитов печени.

Были проведены эксперименты на 35 крысах. По сравнению с прототипом в предполагаемом изобретении обеспечивается высокая функциональная активность пересаженных клеток, их высокая регенерирующая способность, снижается риск иммуноконфликта за счет неполной иммунной дифференцировки эмбриональной ткани. На период эмбрионального развития приходится "пик" активации, так называемого, фактора роста, ускоряющего функциональные свойства гепатоцита. Техника операции является несложной, не требует специального инструментария, предварительной специальной подготовки медицинского персонала, способ может применяться не только в специализированных, но и в общехирургических отделениях. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



Способ трансплантации эмбриональных печеночных клеток в эксперименте, включающий пересадку гепатоцитов эмбриона в воротную вену, отличающийся тем, что осуществляют забор печени у эмбриона, которую отмывают в питательной среде N 199, затем помещают в свежую среду N 199, получают гомогенат в тефлоновом гомогенизаторе, подвергают его центрифугированию, выделяют верхний, средний, нижний слои, отсасывают средний слой и верхнюю часть нижнего слоя, разводят в питательной среде N 199, вводят в воротную вену крысе-реципиенту.