СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ХРОНИЧЕСКОГО ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА В+С НА ФОНЕ ОПИСТОРХОЗА

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ХРОНИЧЕСКОГО ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА В+С НА ФОНЕ ОПИСТОРХОЗА


RU (11) 2226690 (13) C2

(51) 7 G01N33/48 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 06.08.2007 - прекратил действие 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2004.04.10 
(21) Регистрационный номер заявки: 2002116406/15 
(22) Дата подачи заявки: 2002.06.18 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2002.06.18 
(45) Опубликовано: 2004.04.10 
(56) Аналоги изобретения: МИГУСЬКИНА Е.И. и др. Патоморфология и клинические особенности хронического вирусного гепатита в сочетании с описторхозом. Автореферат на соискание учен. степ. канд. мед. наук. - Новосибирск, 2000, с.28. RU 2155341 C1, 27.08.2000. RU 2131125 C1, 27.05.1999. RU 2136216 C1, 10.09.1999. 
(72) Имя изобретателя: Рачковский М.И.; Белобородова Э.И.; Белобородова Е.В.; Савченко И.В. 
(73) Имя патентообладателя: Сибирский государственный медицинский университет; Рачковский Максим Игоревич; Белобородова Эльвира Ивановна; Белобородова Екатерина Витальевна; Савченко Игорь Валерьевич 
(98) Адрес для переписки: 634050, г.Томск, 50, Московский тракт, 2, СГМУ, отдел ИС, пат.пов. Н.Г.Зубаревой 

(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ХРОНИЧЕСКОГО ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА В+С НА ФОНЕ ОПИСТОРХОЗА 

Изобретение относится к области медицины, в частности гастроэнтерологии, конкретно, к способам диагностики хронического вирусного гепатита И+С на фоне описторхоза. Сущность изобретения заключается в проведении морфологического исследования в стадии репликации вируса и при наличии интралобулярных гепатоцитов с пикнотизированными ядрами в относительном количестве более 4,5% диагностируют хронический вирусный гапатит И+С на фоне описторхоза. Преимущество изобретения заключается в повышении информативности и точности способа. 3 табл. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к области медицины, в частности гастроэнтерологии, конкретно, к способам диагностики хронического вирусного гепатита В+С на фоне описторхоза.

Известно, что диагностика хронического вирусного гепатита (ХВГ) в фазе репликации на фоне описторхоза осуществляется следующими способами:

1. Серологическим - определение специфических вирусных антигенов и антител в сыворотке крови: HBeAg, antiHBcIgM, antiHCVIgM, IgG [1, 2], определение противоописторхозных антител класса IgG в сыворотке крови [3].

2. ПЦР - определение вирусных РНК и ДНК в сыворотке крови [4, 5].

3. Морфологическим - проведение чрезкожной пункционной биопсии с последующим нахождением морфологических маркеров вирусных гепатитов и определением активности воспалительного процесса в печени (индексы Кноделя) и стадии заболевания (степень фиброза) [6, 7, 8].

Что касается описторхозной инвазии, то специфических морфологических критериев поражения печени в настоящее время не выделено, и наиболее подробной работой в этом направлении является работа М.Тун [9, 10], где представлено качественное описание неспецифических процессов в печени при данном гельминтозе, основными критериями которой являются наличие воспалительно-пролиферативных изменений в желчных протоках и межуточной ткани в сочетании с холестазами и некротическими изменениями в ряде случаев.

Как правило, диагностика гепатита сопровождается еще дополнительными способами диагностики описторхоза: обнаружением яиц описторхисов в кале (метод Столла [11, 12]), в дуоденальном содержимом.

Однако эти способы имеют следующие существенные недостатки: информативность серологичеких методов в большей степени зависит от состояния иммунитета, вследствие чего специфические маркеры определяются далеко не всегда, часто имеют место ложноотрицательные результаты из-за высокой скорости мутации вирусов гепатита. Чувствительность ПЦР также далека от 100% вследствие большой вариабельности вирусного процесса - фаза репликации вируса гепатита В может без видимых причин переходить в интегративную и наоборот [13, 14, 15, 16]. И кроме того, результаты этого способа также значительно зависят от выраженности иммунного ответа, качества исполнения реакции.

В настоящее время вследствие значительного распространения описторхозной инвазии в Сибири (90-100% взрослого населения) и преимущественного поражения им гепатобилиарной системы крайне актуальной становится проблема диагностики сочетанного поражения печени: вирусных гепатитов с данным гельминтозом [17]. Вышеописанные методы в этом отношении обладают ограниченной информативностью, диагностируют только отдельные нозологические формы и не позволяют представить имеющуюся патологию в полном объеме, произвести точную и быструю диагностику, а следовательно, назначить адекватную терапию.

Так, в настоящее время известно, что вирусный гепатит С по морфологической картине очень близок к описторхозной инвазии, что, конечно, затрудняет диагностику сочетания этих заболеваний [2, 18].

Изучение проблемы сочетанного поражения печени при ХВГ и описторхозе наблюдается только в последние годы. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ Мигуськиной [2], заключающийся в проведении пункционной биопсии с последующим гистологическим исследованием биоптата и качественной его оценкой. Так, при наличии определенной гистологической картины: гиперплазия гладкой цитоплазматической сети, внутриклеточный холестаз с формированием и накоплением желчного пигмента и липофусцина, усложнение на синусоидальном полюсе рельефа микроворсинок и инвагинаций плазмолеммы с концентрацией здесь митохондриального компартмента диагностировали ХВГ В+С на фоне описторхоза. Однако данный способ имеет существенные недостатки. Работа проводилась без учета фазы биологического развития вируса (морфологическая картина значительно разнится в зависимости от фазы репликации или интеграции). Кроме того, в способе представлены только описательные качественные характеристики сочетанного поражения печени без статистически достоверных количественных критериев. Таким образом, перед нами стояла задача найти способ, дающий достоверные количественные критерии диагноза ХВГ В+С в сочетании с описторхозом, высокоспецифический, чувствительный с учетом фазы развития вируса.

Новую техническую задачу - повышение точности и информативности решают применением нового способа диагностики ХВГ В+С на фоне описторхоза, заключающийся в определении специфических вирусных антигенов и антител гепатитов В и С, с последующим проведением пункционной биопсии печени и морфологическим исследованием биоптатов, отличающийся тем, что морфологическое исследование проводят в стадию репликации вируса и при наличии интралобулярных гепатоцитов с пикнотизированными ядрами в относительном количестве более 4,58% диагностируют хронический вирусный гепатит В+С на фоне описторхоза.

Способ осуществляют следующим образом. Всем больным проводят исследование сыворотки крови на наличие ДНК HBV и РНК HCV методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) [5] наборами НПФ “Литех” (г. Москва). По результатам реакции пациентов относят к одной из шести этиологических групп.

Диагностку описторхоза проводят копроовоскопическим методом Горячева, а степень инвазии определяляют методом Столла (слабая степень инвазии, когда в 1 грамме кала число яиц описторхисов менее 1000, умеренная - от 1000 до 5000 и высокая - 5000 и более яиц) [12].

Всем пациентам с положительной ПЦР реакцией проводят морфологическое исследование биоптатов печени, полученных методом чрезкожной пункционной биопсии [6]. Забор материала осуществляют после исключения всех абсолютных и относительных противопоказаний и предварительного общеклинического исследования пациентов с обязательным контролем основных показателей гемостаза. Для получения биоптата использовался одноразовый набор “Hepafix” фирмы “Braun” (ФРГ) с внутренним диаметром иглы от 1,4 до 1,8 мм и длиной иглы 88 мм. Взятый для исследования фрагмент тотчас же помещался в фиксирующую жидкость, состоящую из 96-процентного спирта и формалина в соотношении 1/4. Препараты готовились по стандартной методике, заливались в парафин. Срезы толщиной 5-6 мкм исследовались с помощью следующих гистологических методик [6, 18].

1. Окраска гематоксилином и эозином.

2. Окраска пикрофуксином по Ван-Гизону коллагеновых волокон соединительной ткани стромы печени.

3. Окраска пиронином по Браше на РНК и ДНК.

4. ШИК-реакция по Мак-Манусу на гликоген и гликопротеиды.

5. Окраска на жир Суданом 3.

Биоптаты считали информативными при обнаружении 4-х и более портальных трактов, которые определяли как фокусы соединительной ткани в пределах паренхимы с полноценными триадами (портальная вена, печеночная артерия, желчный проток). Объем биоптатов составлял от 20 до 35 мм3.

Морфометрическое исследование производилось на установке, состоящей из светового микроскопа фирмы “Карл Цейс Йена” “Jenamed”, видеокамеры, с использованием компьютерной обработки полученных изображений.

Изображение поля зрения светового микроскопа вводилось в компьютер с помощью видеокамеры, калибровка была проведена с помощью линейки-микрометра. Для объективной оценки состояния печеночной ткани второй и третьей зон все гистологические и морфологические параметры изучались в каждом третьем поле зрения в пределах всего материала, а также исследовались все представленные портальные тракты, чтобы гарантировать точность исследования. Конечное линейное и оптическое увеличение после переноса изображения с помощью видеокамеры в компьютер составило 600, 1600.

Индекс гистологической активности (ИГА) гепатита и степень фиброза рассчитывали по Desmet V.J. и соавт. (1994) [19] (минимальная активность - от 1 до 3 баллов, слабая - от 4 до 8 баллов, умеренная - 9-12 баллов, высокая - 13-18 баллов; при наличии портального и перипортального фиброза он считался слабым, одной и более порто-портальных септ - умеренным, одной и более порто-центральных септ - тяжелым, наличие ложных долек - цирроз печени).

Проводилась качественная и количественная характеристика состояния печеночной ткани. Оценивались дистрофические процессы, а именно, гидропическая, жировая дистрофии, насыщенность гепатоцитов гликогеном, некроз (моноцеллюлярный, ступенчатый, мостовидный, очаговый интралобулярный), портальная и интралобулярная воспалительная инфильтрация, а также характер фиброза (портальный, перипортальный, порто-портальный, порто-центральный, очаговый интралобулярный, порто-лобулярный).

Количественная характеристика включала в себя анализ состояния интралобулярных гепатоцитов и печеночных клеток пограничной пластинки. За гепатоциты пограничной пластинки принимались клетки первой зоны, имеющие непосредственный контакт с портальным трактом. Оценка состояния гепатоцитов производилась вокруг всех портальных трактов исследуемого биоптата. Гепатоциты второй и третьей зон, не имеющие контакта с портальным трактом относили к интралобулярным, причем для объективности исследования оценивалось каждое третье поле зрения в пределах всего материала. Раздельной оценке в перипортальной и интралобулярной зонах подвергались дистрофические, некротические и регенераторные процессы, происходящие в гепатоцитах при хронических вирусных гепатитах.

Для оценки выраженности дистрофических процессов подсчитывалось относительное количество гепатоцитов, содержащих в своей цитоплазме жировые вакуоли мелкого, среднего и крупного калибров.

Гепатоциты, в ядрах которых была обнаружена конденсация хроматина с маргинальной локализацией, относились к гепатоцитам с “песочными” ядрами, и также подсчитывалось относительное количество их как интралобулярно, так вблизи портального тракта. Определялось относительное количество печеночных клеток, в которых ядра находились в состоянии сморщивания (пикноза), что указывало на гибель клетки путем апоптоза. Ядра гепатоцитов, превышающие размеры большинства более чем в 1,5 раза, расценивались как гипертрофированные и затем также подвергались количественной оценке. Гепатоциты с выраженной базофилией ядер относились к гиперхромным, а имеющие в цитоплазме 2 ядра - к двуядерным. Гепатоциты, имеющие уродливость ядер и ядра, форма которых отличалась от большинства, считали клетками с полиморфностью ядер. Количество гепатоцитов с вышеописанными изменениями рассчитывалось в процентах от числа клеток перипортальной и интралобулярной зон.

Количественной оценке подвергался воспалительный инфильтрат портальных трактов и внутри долек как на срезах, окрашенных эозином и гематоксилином, так и по Браше. Подсчитывалось абсолютное и относительное количество лимфоцитов, моноцитов, плазматических клеток, эозинофилов, нейтрофильных лейкоцитов, фибробластов во всех портальных трактах биоптата.

Полученные данные обрабатывались методами математической статистики с помощью статистических программных средств на персональном компьютере, и при наличии интралобулярных гепатоцитов с пикнотизированными ядрами в относительном количестве более 4,58% диагностировали хронический вирусный гепатит В+С на фоне описторхоза.

Результаты исследования были получены на основании интерпретации следующего клинического материала: 98 больных (77,2% мужчин и 22,8% женщин) хроническим вирусным гепатитом в репликативную фазу инфекции, разделенные по этиологическому признаку на 6 групп. Средний возраст больных 29±2,6 лет. В 1-ю гр. вошли 11 больных хроническим вирусным гепатитом В, во 2-ю - 12 больных хроническим вирусным гепатитом B в сочетании с хроническим описторхозом, в 3-ю - 18 больных хроническим вирусным гепатитом С, в 4-ю - 20 больных хроническим вирусным гепатитом С в сочетании с хроническим описторхозом, 5-ю гр. составили 18 больных хроническим вирусным гепатитом В+С и в 6-ю гр. вошли 19 больных хроническим вирусным гепатитом В+С в сочетании с хроническим описторхозом. Давность вирусного гепатита в среднем составила 3±0,5 года. Длительность описторхозной инвазии была равной в среднем 6±1,2 года. Степень описторхозной инвазии была слабой. Все группы были сопоставимы по полу, возрасту, давности вирусного гепатита, степени активности и фиброза (стадии хронизации), а группы с сопутствующим, хроническим описторхозом - по длительности и степени описторхозной инвазии.

Для выявления патогномоничных для каждой из групп морфологических признаков проведен дискриминантный анализ по 51 морфологическому критерию, в результате чего найден диагностический признак ХВГ В+С на фоне описторхозной инвазии - это процент интралобулярных гепатоцитов с пикнотизированными ядрами.

Полученные данные приведены в таблицах 1, 2, 3.

Как видно из таблицы 3, группа больных хроническим вирусным гепатитом В+С в сочетании с описторхозом (6 гр.) достоверно отличается по выбранному показателю от всех остальных групп (р<0,01).

Среднее арифметическое значение показателя в 6 гр. равно 6,74%, а ошибка среднего арифметического 1,08%. Согласно теории статистики, с вероятностью 95,5%, среднее значение величины будет находиться в пределах двойной ошибки средней арифметической, т.е. в нашем случае 6,74±21,08%. В итоге получаем числовое значение показателя: 6,74±2,16%. Нижняя граница признака соответствует 4,58%. Таким образом, с вероятностью 95,5% можно утверждать, что при определении по вышеописанной методике количества интралобулярных гепатоцитов с пикнотизированными ядрами более 4,58%, диагностируемое состояние является сочетанием ХВГ В+С в фазе репликации и хронического описторхоза.

Клинические примеры.

Пример 1. В ОКБ поступил больной М. 21 год, с предварительным диагнозом ХВГ В+С в фазе репликации. Больной предъявлял жалобы на общую слабость, тошноту, тяжесть в правом подреберье. В анамнезе неоднократная экстракция зубов, полостная операция с переливанием крови. Употребление наркотических средств и алкоголя отрицает. Регулярно употребляет в пищу речную рыбу. При объективном обследовании - легкая желтушность склер, отмечается увеличение печени - выступает из-под края реберной дуги на 2 см (размеры по Курлову 15-14-11 см), при пальпации печень - плотноватая, с гладкой поверхностью, слегка болезненная. Селезенка не увеличена. Другой патологии не выявлено.

В OAK - гиперэозинофилия - 6%. ОАМ - без патологии. Кал на яйца глист - Opistorchis fellineus. Исследование кала по методу Стола - 80 яиц в 1 гр фекалий - низкая степень инвазии. Биохимия крови: общий белок - 76 г/л; билирубин - 52 ммоль/л (прямой - 10 ммоль/л), ACT - 0,9; АЛТ - 1,5; глюкоза - 4,8 ммоль/л, ПТИ - 95%; ПТВ - 17(18 сек); фибриноген - 3,5 г/л; холестерин - 5,6 ммоль/л; щел. фосфотаза - 120 ME; тимоловая проба - 8,3. Заключение: гипербилирубинемия, синдром цитолиза - слабовыраженный. При серологическом исследовании крови выявлено HBeAg+, HBsAg+, antiBcor IgM, antiHBcor суммарный и HCV (and HCV IgG), что говорит о наличии сочетанной вирусной инфекции В+С в фазе репликации вирусов. При УЗИ органов брюшной полости выявлено увеличение печени, диффузное повышение ее эхоплотности. ЭКГ - вариант нормы. ЭГДС - антральный гастрит. На основании проведенного исследования выставлен диагноз сочетанного вирусного поражения печени: гепатит В+С в фазе репликации на фоне хронического описторхоза. Фаза репликации вируса подтверждена ПЦР (HCV РНК+, HBV ДНК+). В последующем больному была проведена пункционная биопсия печени с количественной и качественной оценкой биоптатов по предлагаемой методике. Заключение: гистологический индекс активности гепатита - 12, индекс фиброза - 1. При оценке биоптата выявлено наличие в поле зрения интралобулярных гепатоцитов со сморщенными - уменьшенными в 2-3 раза ядрами (с явлениями пикноза), количество которых составило 7,9% от общего количества интралобулярных клеток - апоптоз интралобулярных гепатоцитов. Окончательный клинический диагноз был сформулирован следующим образом: ХВГ В+С в фазе репликации, умеренной степени активности, стадия хронизации - 1, на фоне хронического описторхоза.

Приведенный клинический пример представляет собой один из многих клинических случаев, где наглядно представлено подтверждение вышеописанного способа диагностики, а именно наличие определенного количества интралобулярных гепатоцитов (>4,58%) в состоянии пикноза при диагнозе сочетанного заболевания: гепатита В+С на фоне описторхоза, что может служить дифференциально-диагностическим критерием этой микст патологии.

Больному была назначена интерферонотерапия в течение 1 года с последующим планированием дегельминтизации при достижении эффекта лечения (элиминация вируса, переход в стадию интеграции).

Пример 2. В ОКБ направлена больная С., 42 лет с диагнозом: хронический гепатит неясной этиологии. Проведено комплексное обследование, включающее общеклиническое, серологическое исследование крови, ПЦР. Обследование было дополнено УЗИ органов брюшной полости и ЭГДС. Предварительный диагноз: хронический гепатит B в стадии репликации. Для уточнения степени активности гепатита и степени фиброза следующим этапом была проведена пункционная биопсия по вышеописанной методике. Заключение ИГА - 9, ИФ - 1. Отчетливо в поле зрения биоптата регистрировались интралобулярные гепатоциты с явлениями апоптоза (пикнотизированные ядра) в количестве 6,6% от общего количества интралобулярных клеток. Опираясь на предложенный диагностический критерий, возникло подозрение о наличии не только вируса гепатита В, но и С инфекции. Встал вопрос и о возможной описторхозной инвазии. Больной была повторно проведена ПЦР на наличие HCV-PHK. Результаты подтвердили наличие С инфекции, а следовательно, сочетанной этиологии гепатита В+С в фазе репликации. Для поиска хронического описторхоза было проведено дуоденальное зондирование, в результате которого в пузырной порции выявлены единичные яйца описторхисов. То есть благодаря предложенному диагностическому критерию был продолжен диагностический поиск в нужном направлении и выставлен правильный диагноз.

Таким образом, данный способ диагностики с высокой точностью (до 95,5%) в ранние сроки позволяет диагностировать сложное сочетанное поражение печени, а именно ХВГ В+С и описторхоза, с которым приходится сталкиваться на практике наиболее часто, учитывая, что Сибирь является эндемическим районом по описторхозу. Точная постановка диагноза ведет к назначению адекватного, рационального лечения.

Источники информации

1. Логинов А.С., Царегородцева Г.М., Зотина Т.М. Иммунологическая диагностика хронических гепатитов // Тер. Архив. 1995, № 11, с.5-7.

2. Мигуськина Е.И. Патоморфология и клинические особенности хронического вирусного гепатита в сочетании с описторхозом: Автореф. дис. канд. мед. наук. - Новосибирск, 2000, - 28 с.

3. Менявцева Т.А., Ратнер Г.М., Колмакова М.В. С соавт. Диагностика острого и хронического описторхоза методом твердофазного ИФА // Сибирский журнал гастроэнтерологии и гепатологии, 1995, № 1, с.48.

4. Михайлов М.И. Гепатит В. Лабораторная диагностика // Медицина для всех. 1996, № 1, с.6-7.

5. Тимощук Г.И., Тимощук О.А., Корзунина В.В., Пономарева М.В. Полимеразная цепная реакция. Принцип метода. Использование в клинико-диагностических лабораториях. Интерпретация результатов (Методические рекомендации). - Кемерово: Кузбассвузиздат, 1998, - 32 с.

6. Логинов А.С., Аруин Л.И. Клиническая морфология печени. - М.: Медицина, 1985, - 240 с.

7. Логинов А.С., Аруин Л.И., Шепелева С.Д. Пункционная биопсия в диагностике хронических заболеваний печени // Тер. Архив. 1996, № 2, с.5-7.

8. Подымова С.Д. Болезни печени. - М.: Медицина, 1998, - 704 с.

9. Тун М.А. Функционально-морфологические изменения печени у больных хроническим описторхозом: Дис. канд. мед. наук. - Томск, 1992, - 131 с.

10. Тун М.А.Хронический гепатит вирусной этиологии в эндемичном по описторхозу регионе // Сибирский журнал гастроэнтерологии и гепатологии. - 1995, № 1, с.57-58.

11. Лепехин А.В., Мефодьев В.В., Филатов В.Г., Бужак Н.С. Эпидемиология, клиника и профилактика описторхоза. - Томск: Изд-во. Томского университета, 1992, - 232 с.

12. Яблоков Д.Д. Описторхоз человека. - Томск: Изд-во Томского ун-та, 1979, - 238 с.

13. Апросина З.Г. Последние достижения в изучении вирусных гепатитов: от молекулярной биологии к лечению вирусного гепатита В /Русский медицинский журнал 1996, т.4, № 3.

14. Майер Г.П. Гепатит и последствия гепатита: практическое руководство. Перевод с немецкого (под ред. Шептулина А.А.). - М.: ГЭОТАР, Медицина, 2000, - 432 с.

Михайлов М.И., Семененко Т.А. Внимание, гепатит В. // - Медицина для всех, 1999, № 2, с.10-11.

Сорисон С.Н. Вирусные гепатиты. - СПб.: Изд. Теза, 1998, 325 с.

17. Подображникова О.К., Михайлова О.В., Шукевич Т.М. и др. К вопросу о диагностике сочетанных форм описторхоза // Сибирский журнал гастроэнтерологии и гепатологии. - 1995, № 1, с.51.

Пурлик И.Л. Клинико-морфологические особенности хронического вирусного гепатита в зависимости от типа вируса и наличия фоновой патологии: Дис. канд. мед. наук. - Томск, 2001, - 195 с.

19. Desmet V.I., Jerber M., Hoofuagle J. H., Manns M. et. all. Classification of chronic hepatitis: Diagnosus, grading and stading. // Hepatology. 1994, vol.19, p.1513-1520.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ диагностики хронического вирусного гепатита В+С на фоне описторхоза, включающий определение специфических антигенов и антител гепатитов В и С с последующим проведением пункционной биопсии печени и морфологическим исследованием биоптатов, отличающийся тем, что определяют стадию репликации вируса посредством исследования сыворотки крови на наличие ДНК (HBV) и РНК (НСV) методом ПЦР, морфологическое исследование биоптатов печени проводят у пациентов с положительной ПЦР реакцией и при наличии в биоптатах интралобулярных гепатоцитов с пикнотизированными ядрами в относительном количестве более 4,58% диагностируют хронический вирусный гепатит В+С на фоне описторхоза.