СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МИКРОФЛОРЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЯХ

СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МИКРОФЛОРЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЯХ


RU (11) 2021606 (13) C1

(51) 5 G01N33/48 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 05.10.2007 - прекратил действие 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 1994.10.15 
(21) Регистрационный номер заявки: 4952280/14 
(22) Дата подачи заявки: 1991.05.14 
(45) Опубликовано: 1994.10.15 
(56) Аналоги изобретения: Glauert A.M. Fixation, dehydration and embedding of biologikac specimens // Practical methods in electron microscopy/ed. Glauert A.M.-n.y.: American Elsevier, 1975. р. 30-43. 
(71) Имя заявителя: Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения 
(72) Имя изобретателя: Гросс В.А.; Часовских Г.Г.; Витязев С.П.; Козырь А.М.; Яснова Л.Н. 
(73) Имя патентообладателя: Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения 

(54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МИКРОФЛОРЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЯХ 

Использование: медицина, в частности лабораторные методы исследования микрофлоры. Сущность изобретения: исследуемый препарат фиксируют в 3%-ном растворе глютарового альдегида в течение 10 - 20 мин, причем в качестве препарата используют отпечаток с исследуемой поверхности ткани, затем обезвоживают по 5 мин в 50, 75 и 100%-ном ацетоне и высушивают на воздухе с последующим напылением его золотом в ионно-плазменной установке в течение 5 мин. Способ позволяет повысить точность выявления микрофлоры. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к медицине, а именно к способам диагностики микрофлоры при зондированиях внутренних полостей организма человека, инвазивных методах исследования и оперативных вмешательствах.

Известен способ бактериологической диагностики через посевы крови, а также с тампоном после их контакта с поверхностью тканей. Однако результаты таких посевов можно получить только через несколько дней. Известен также способ выявлений бактерий, основанный на микроскопическом исследовании окрашенных мазков-отпечатков на предметных стеклах, полученных во время операций с различных участков поражения. При быстром получении результата, он имеет существенный недостаток: необходимое фиксирование материала путем высушивания мазков над пламенем спиртовки вызывает нарушение структуры микробов, что затрудняет их идентификацию, а окрашивание по Граму не позволяет полно выявлять всю имеющуюся микрофлору.

Известен метод исследования биологических тканей с использованием сканирующей электронной микроскопии, включающий фиксацию в растворе глютарового альдегида, постфиксацию в растворе окиси осьмия, обезвоживание в ацетоне и высушивание методом перехода критической точки.

Однако при этом способе требуется длительное - более суток - подготовка материала.

Целью предполагаемого изобретения является более полное определение видов микроорганизмов и сокращение времени их выявления.

Поставленная цель достигается тем, что во время диагностического исследования или операции с поверхности органа или из полученного материала делают отпечатки, которые затем изучают с помощью сканирующего электронного микроскопа.

Способ осуществляется следующим образом.

Для исследования поверхности при оперативных вмешательствах предварительно заготавливают тонкие пластинки из любого неагрессивного материала, например, алюминия, с зашлифованными краями и небольшим загнутым под прямым углом концом для удержания хирургическим инструментом. Пластинки стерилизуют и отдельно каждую пластинку хранят во флакончиках с 3%-ным раствором глютарового альдегида на 0,1М фосфатном буфере. При выполнении отпечатка пластинку берут за загнутый край хирургическим инструментом, касаются исследуемой поверхности и пластинку с отпечатком немедленно погружают в раствор глютарового альдегида на 10-20 мин для фиксации, затем обезвоживают в ацетоновой батарее трех концентраций - 50%, 75%, 100% - по 5 мин в каждой и высушивают под теплой струей воздуха. Далее отпечаток напыляют золотом в ионно-плазменной установке в течение 5 мин и затем исследуют в сканирующем электронном микроскопе.

Таким образом, в течение 30-40 мин можно получить информацию об инфицировании исследуемой поверхности. Способ сохраняет интактную структуру микроорганизмов, снижая число артефициальных изменений при ее обработке и позволяет более полно определить виды микроорганизмов, их функциональные особенности - активные, неактивные, характер жизнедеятельности.

Предлагаемый способ был применен в 13 кардиохирургических коppекциях врожденных и приобретенных пороков сердца. В 6 из них подтверждено бактериологически обсеменение поверхности клапанов сердца, причем в двух - в виде смешанной микрофлоры.

П р и м е р 1. Больной В., 46 лет. При выполнении протезирования митрального клапана сделаны отпечатки с предсердной поверхности его как в неповрежденных местах, так и в области резекции измененных створок. Для подложки использованы пластины из алюминия размером 10 мм. После обработки отпечатков они изучены в СЭМ. Выявлены густо расположенные округлые колонии микрококков с более крупными формами возбудителя в центре и мелкими - по периферии, где идет активное размножение бактерий. Эти результаты свидетельствуют об выраженном размножении функционально активных микробов данного вида на поверхности клапана, откуда получен отпечаток. Отсутствие признаков разрушения микробов, расположения около них ядосодержащих клеточных элементов крови и выпадения фибрина указывают на слабость защитных сил организма больного.

П р и м е р 2. Больной И., 36 лет. При выполнении митральной комиссуротомии сделаны отпечатки на алюминиевой подложке с предсердной поверхности клапана. После обработки таких отпечатков при просмотре их в СЭМ выявлены единичные крупные неправильной формы колонии микробной флоры, покрытые аморфным веществом, обеспечивающих сохранность микробов от защитных сил.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет выявить все виды и формы микроорганизмов с хорошим сохранением их структуры при различных зондированиях полостей внутренних органов, инвазивных исследованиях и операциях. Способ может найти применение в кардиохируpгии, оперативной пульмонологии, урологии, общей хирургии. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МИКРОФЛОРЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЯХ, включающий фиксацию препарата в 3%-ном растворе глютарового альдегида, обезвоживание в ацетоне, высушивание и анализ микрофлоры в сканирующем электронном микроскопе, отличающийся тем, что , с целью повышения точности способа при инвазивных методах исследования, в качестве препарата используют отпечаток с исследуемой поверхности ткани, фиксацию которого проводят в течение 10 - 20 мин, обезвоживание по 5 мин в 50%-, 75%- и 100%-ном ацетоне, а высушивание на воздухе с последующим напылением его золотом в ионно-плазменной установке в течение 5 мин.