ИММУНОДИАГНОСТИКУМ НА ОСНОВЕ ПОЛИСТИРОЛЬНОГО ЛАТЕКСА

ИММУНОДИАГНОСТИКУМ НА ОСНОВЕ ПОЛИСТИРОЛЬНОГО ЛАТЕКСА


RU (11) 2231366 (13) C2

(51) 7 A61K51/08, G01N33/569 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 17.09.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2004.06.27 
(21) Регистрационный номер заявки: 2002113997/14 
(22) Дата подачи заявки: 2002.05.29 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2002.05.29 
(43) Дата публикации заявки: 2003.12.20 
(45) Опубликовано: 2004.06.27 
(56) Аналоги изобретения: Иммунологические методы. /Под ред. М. ФРИМЕЛЯ. - М.: Мир, 1978. RU 2092853 C1, 10.10.1997. RU 2142807 C1, 20.12.1999. US 4489158 А, 18.12.1984. 
(72) Имя изобретателя: Леонова В.Б. (RU); Розенфельд М.А. (RU) 
(73) Имя патентообладателя: Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН (RU) 
(98) Адрес для переписки: 119991, Москва, ул. Косыгина, 4, ИБХФ РАН 

(54) ИММУНОДИАГНОСТИКУМ НА ОСНОВЕ ПОЛИСТИРОЛЬНОГО ЛАТЕКСА 

Изобретение относится к области медицины, в частности к средствам экспресс-диагностики широкого спектра заболеваний, и представляет собой иммунодиагностикум на основе модифицированного полистирольного латекса, содержащий балластный белок для насыщения вакантных центров связывания, при этом содержит в качестве балластного белка -казеин коровьего молока в равных объемах с модифицированным полистирольным латексом при концентрации -казеина 0,4 мг/мл на основе модифицированного полистирольного латекса, содержащего в качестве балластного белка -казеин коровьего молока. Данный иммунодиагностикум характеризуется пролонгированным сроком годности и высокой чувствительностью, позволяющей проводить определения в разбавленных пробах, что препятствует возникновению неспецифической агглютинации и обеспечивает получение достоверных результатов. В зависимости от природы иммобилизованного на поверхности латекса специфического белка может быть получен широкий спектр диагностикумов, предназначенных, например, для количественного определения продуктов деградации фибрина/фибриногена (ПДФ) и ревматоидного фактора (Rf) в сыворотке и в плазме крови человека. 5 табл. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к медицине, а именно к средствам экспресс-диагностики широкого спектра заболеваний, основанным на реакции агглютинации полистирольного латекса.

Иммунолатексные диагностикумы широко используются в клинико-лабораторной практике, так как они характеризуются высокой чувствительностью, строгой специфичностью, простотой выполнения анализа, быстротой получения результата [1].

Диагностика основана на количественном определении в биологических жидкостях (кровь, моча, цереброспинальная жидкость) белков-маркеров (антител, бактериальных антигенов, белков острой фазы и т.д.), содержание которых изменяется при возникновении и развитии тех или иных заболеваний. Белки-маркеры избирательно взаимодействуют с иммобилизованными на полимерную матрицу специфическими белками (антителами или антигенами), что приводит к наглядному склеиванию (агглютинации) полимерного носителя. В качестве полимерного носителя используют сферические частицы полистирольного латекса, поверхность которых для достижения более надежной адсорбции белков модифицируют различными химическими группами, например карбоксилируют [2]. При получении диагностикума после иммобилизации специфического белка на полимер на поверхности полистироловых частиц остаются вакантные центры связывания, которые необходимо заполнить балластным белком для обеспечения строгой специфичности определения. Обычно в качестве балластного белка используют бычий сывороточный альбумин (БСА).

Известен иммунодиагностикум SPLI-PREST (фирма Diagnostica Stago) для экспресс-диагностики тромбозов, ДВС-синдрома и других заболеваний, сопровождающихся накоплением продуктов деградации фибрина/фибриногена (ПДФ), содержащий в качестве балластного белка БСА [3]. БСА - гидрофильный белок, активно взаимодействующий с ионогенными группами, расположенными на поверхности полимера, но не проявляющий сродства к неполярным группировкам полистиролового латекса. Поэтому для более полного насыщения свободных центров связывания приходится использовать БСА в количествах, на порядок больших, чем иммобилизуемый специфический белок [4]. Конкуренция между БСА и специфическим белком за центры связывания вызывает нежелательную десорбцию с поверхности полистирола уже иммобилизованных антител (антигенов) в раствор, что приводит к снижению предельной чувствительности диагностикума, которая составляет 2 мкг/мл. Этой чувствительности достаточно для диагностирования указанных заболеваний в неосложненных стандартных случаях. Однако, когда в крови больного присутствуют повышенные количества липидов, иммунных комплексов, криоглобулинов и других веществ, придающих ей повышенную вязкость и адгезивную способность, происходит неспецифическое склеивание латексных частиц, провоцирующее получение ложноположительного результата. В этом случае ограниченная чувствительность диагностикума вступает в противоречие с необходимостью использования высоких разведений исследуемых образцов.

Аналогичным недостатком обладает иммунолатексный диагностикум "Ревмотест" (Каунасское предприятие по производству сывороточных и бактерийных препаратов) для количественного определения ревматоидного фактора - индикатора возникновения ревматоидного артрита, склеродермии и других аутоиммунных заболеваний, содержащий в качестве балластного белка БСА, и поэтому характеризуется теми же недостатками. Общим недостатком обоих диагностикумов является относительно короткий срок использования, связанный с десорбцией специфического белка с поверхности полимера.

Предлагаемое изобретение решает задачу получения иммунодиагностикума, обладающего более высокой чувствительностью, позволяющего более достоверно диагностировать заболевания за счет возможности анализа более разбавленных образцов и характеризующегося более длительным сроком использования.

Эта задача решается тем, что в качестве балластного белка используется -казеин коровьего молока. Как и большинство белков, обладая положительно заряженными ионогенными группами, -казеин способен взаимодействовать с отрицательно заряженными группами на поверхности модифицированного (карбоксилированного) полистирольного латекса. С другой стороны, -казеин проявляет ярко выраженный гидрофобный характер и прочно связывается также с неполярными участками полимера, в результате чего обеспечивается полное заполнение вакантных центров связывания при концентрациях на порядок ниже, чем при использовании БСА. Это приводит к уменьшению десорбции специфического белка с поверхности носителя, и следовательно, к увеличению чувствительности диагностикума. Более высокая чувствительность позволяет анализировать более разбавленные образцы, что снижает вероятность ложноположительной реакции вследствие неспецифического склеивания и повышает надежность диагностирования заболевания. Замена БСА на -казеин приводит к уменьшению десорбции специфического белка, в результате чего повышается стабильность диагностикума и пролонгируется срок его годности (см. табл. 1).



Представленные в табл.1 данные показывают, что полученные нами препараты обладают пролонгированным сроком годности, сохраняя свои исходные характеристики неизменными, в то время как коммерческие препараты за тот же срок хранения снижают чувствительность определения в два раза.

Для получения иммунодиагностикума в соответствии с предлагаемым изобретением к 2%-ной суспензии сферических частиц (-0.5 мкм) полистирольного карбоксилированного латекса с иммобилизованным на их поверхности специфическим к данному заболеванию белком в 0.1 М глициновом буфере рН 8,2 (буфер) [4] прибавляют равный объем раствора -казеина (10 мг/мл) в буфере, приготовленного следующим образом: -казеин растворяют в рассчитанном количестве Буфера, прогревают 30 минут при 37С, раствор осветляют центрифугированием в течение 15 мин при 5000 об/мин. Оптимальная концентрация раствора -казеина для насыщения свободных центров связывания 0,4 мг/мл. Смесь латексной суспензии с раствором -казеина тщательно встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 30 минут, после чего помещают в холодильник (4С). Через 24 часа иммунодиагностикум готов.

Описанный общий подход позволяет получать широкий спектр диагностикумов, отличающихся только специфическим белком, иммобилизованным на поверхности полимера, и предназначенных для экспресс-диагностики различных заболеваний.

Приведенные ниже примеры иллюстрируют возможность получения и использования иммунодиагностикумов в соответствии с предлагаемым изобретением.

Пример 1

ПДФ-латтест - иммунодиагностикум для количественного определения белков, указывающих на развитие патологий системы свертывания крови, количественно определяющий содержание продуктов деградации фибрина/фибриногена (ПДФ) в сыворотке крови человека.

Получение ПДФ-латтеста

К 2 мл 2%-ной суспензии полистирольного карбоксилированного латекса с иммобилизованными антителами к фибриногену человека (250 мкг) и антителами к фрагменту Е (150 мкг) в буфере прибавляют равный объем раствора -казеина 0,4 мг/мл в буфере, смесь тщательно встряхивают и после выдерживания при комнатной температуре в течение 30 мин и оставляют на 24 часа в холодильнике при 4С. Чувствительность полученного диагностикума, определенная методом титрования [4], составила 0,8 мкг/мл, что в 2,5 раза выше, чем чувствительность коммерческого препарата SPLI-PREST, используемого в настоящее время для определения ПДФ.

Применение ПДФ-латтеста для определения ПДФ в сыворотке крови

Образцы сыворотки крови для анализа готовили по стандартной методике [3]. Для проведения определения в агглютинационном планшете делали двукратные разведения сыворотки на буфере: 1/2, 1/4, 1/8 и т.д. Дозатором на стеклянную пластину переносили по 10 мкл как цельной сыворотки, так и каждого ее разведения. В каждую каплю добавляли равный объем иммунодиагностикума, тщательно перемешивали и при непрерывном покачивании наблюдали за развитием агглютинации. Через 2 минуты учитывали результат. Содержание ПДФ (мкг/мл) в образце определяли как произведение фактора последнего разведения, еще дающего агглютинацию, на 0,8 (чувствительность диагностикума). Для количественного определения концентрации ПДФ в сыворотке крови делали дополнительные разведения образца, например, если разведение 1/16 давало положительную реакцию, а разведение 1/32 - отрицательную, то делали разведение 1/24, определяя таким образом фактор разведения более точно. По той же методике проводили определение с помощью иммунолатексного диагностического набора SPLI-PREST.

Описанным способом проведено определение ПДФ в образцах сыворотки крови трех здоровых доноров и четверых больных людей с диагнозом инсульт. ДВС-синдром был верифицирован у всех больных по известным клиническим и лабораторным критериям. Образцы крови данной группы больных не обладали повышенной вязкостью, провоцирующей неспецифическую агглютинацию. Полученные результаты представлены в табл. 2.



Из данных табл. 2 видно, что в неосложненных случаях предлагаемый иммунодиагностикум дает результаты, сопоставимые с результатами, полученными с помощью коммерческого диагностикума. Кроме того, ПДФ-латтест позволяет определять меньшие количества белков-маркеров, чем используемый в настоящее время диагностикум.

В табл. 3 приведены результаты анализа образцов плазмы крови больных, страдающих выраженной формой атеросклероза. Независимыми методами в этих образцах было выявлено повышенное содержание компонентов, провоцирующих неспецифическую агглютинацию.



Такое различие результатов для данной группы больных обусловлено высоким содержанием у них в крови липопротеидов низкой плотности. Так как последние провоцируют неспецифическую агглютинацию, необходимо разводить тестируемую сыворотку не менее чем в 10 раз, вследствие чего конечная концентрация ПДФ в сыворотке оказывается ниже чем 2 мкг/мл и не может быть выявлена при применении диагностикума SPLI-PREST. ПДФ-латтест в этих условиях позволяет выявить даже сравнительно низкие концентрации белка-маркера.

Пример 2

Rf-латтест - диагностикум для быстрого обнаружения и полуколичественного определения в плазме крови ревматоидного фактора (Rf), являющегося иммунным комплексом антител к собственным иммуноглобулинам и служащего надежным индикатором возникновения заболеваний аутоиммунного происхождения, таких как ревматоидный артрит, склеродермия, синдром Шегрена и др. [1].

Получение Rf-латтеста

К 2 мл 2%-ной суспензии полистирольного карбоксилированного латекса с иммобилизованным Fc фрагментом IgG человека в буфере прибавляют равный объем раствора -казеина 0.4 мг/мл в буфере, смесь тщательно встряхивают и оставляют на 24 часа в холодильнике при 4С. Чувствительность полученного диагностикума, определенная титром реакции - последним разведением стандартного образца плазмы крови, который дает агглютинацию с латексной суспензией, составила 1:320, что в 2 раза выше, чем чувствительность коммерческого препарата "Ревмотест", используемого в настоящее время для определения Rf.

Применение Rf-латтеста для определения ревматоидного фактора в плазме крови

Для определения использовали цитратную плазму крови. К 0,1 мл 0,11 М раствора цитрата натрия прибавляли 0.9 мл крови, затем центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут, осадок отбрасывали. Плазму разводили буферным раствором в соотношениях 1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320. Методика проведения реакции агглютинации аналогична той, которую использовали для определения ПДФ в сыворотке крови. Оценку содержания ревматоидного фактора (Rf) в плазме осуществляли полуколичественно путем определения его титра, т.е. последнего разведения исследуемой плазмы, еще дающего агглютинацию латекса.

Определение ревматоидного фактора проводили в образцах плазмы крови двух доноров и трех больных ревматоидным артритом, в крови которых независимым методом было выявлено повышенное содержание компонентов, провоцирующих неспецифическую агглютинацию. Результаты определения сравнивали с результатами, полученными с помощью коммерческого диагностикума для определения ревматоидного фактора "Ревмотест", производимого Каунасским предприятием по производству сывороточных и бактерийных препаратов (Литва) (см. табл. 4).



Представленные в табл. 4 результаты показывают, что при наличии в плазме крови компонентов, вызывающих неспецифическую агглютинацию (липидов, криоглобулинов, циркулирущих иммунных комплексов), в неразведенных образцах и в образцах со степенью разведения 1:5-1:10 использование "Ревмотеста" приводит к получению ложноположительного результата. При более высоком разведении отрицательный результат связан с недостаточной чувствительностью диагностикума. Предлагаемый Rf-латтест во всех случаях обеспечивает достоверный отрицательный результат.

В табл.5 представлены результаты обнаружения Rf-фактора в плазме крови больных ревматоидным артритом, содержащей компоненты, способствующие агглютинации с латексной суспензией.



Данные табл.5 показывают, что, если в крови содержатся компоненты, придающие ей повышенную вязкость, применение предлагаемого иммунолатексного диагностикума Rf-латтест обеспечивает более точное определение Rf, чем коммерческий диагностикум "Ревмотест", за счет возможности анализа более разбавленных образцов.

Таким образом, предложенный иммунодиагностикум на основе модифицированного полистирольного латекса, содержащий в качестве балластного белка -казеин коровьего молока, характеризуется пролонгированным сроком годности и высокой чувствительностью, позволяющей проводить определения в разбавленных пробах, что препятствует возникновению неспецифической агглютинации и обеспечивает получение достоверных результатов.

Литература

1. Энциклопедия клинических лабораторных тестов./Под ред. Н.Тица., Москва. Лаб. Информ. 1997.

2. Новые методы иммуноанализа. М.: Мир. 1991.

3. Manual of clinical laboratory immunology. Eds. Rose N.R., Fridman A., Fahey M. Washington, DC, American society for microbiolodgy. 1986.

4. Иммунологические методы./Под ред. М.Фримеля., М., Мир. 1978. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



Иммунодиагностикум на основе модифицированного полистирольного латекса, содержащий балластный белок для насыщения вакантных центров связывания, отличающийся тем, что в качестве балластного белка он содержит -казеин коровьего молока в равных объемах с модифицированным полистирольным латексом при концентрации -казеина 0,4 мг/мл.