ИЗОБРЕТЕНИЕ
Патент Российской Федерации RU2241995

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ОРГАНИЗМА К ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИМ ПРЕПАРАТАМ, СТОМАТОЛОГИЧЕСКИМ МАТЕРИАЛАМ
Имя изобретателя: Козаченко Надежда Вениаминовна (KZ); Лебедев К.А. (RU); Максимовский Ю.М. (RU); Митронин А.В. (RU); Понякина И.Д. (RU); Строкина Ольга Михайловна (KZ)
Имя патентообладателя: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный медико-стоматологический университет" (RU)
Адрес для переписки: 127473, Москва, ул. Делегатская, 20/1, ГОУ ВПО "Московский государственный медико-стоматологический университет", патентный отдел
Дата начала действия патента: 2004.03.16
Изобретение относится к области медицины,
а именно к лабораторной диагностике. Способ
основан на наложении на десну образца
испытуемого вещества, подсчете нейтрофилов
в смывах из полости рта, взятых до и после
контакта слизистой оболочки с веществом, их
центрифугировании, определении уровня
эмиграции нейтрофилов в полость рта и
индекса сдвига нейтрофилов. Подсчет
нейтрофилов осуществляют путем
окрашивания пероксидазы раствором
хромогена. Индекс сдвига нейтрофилов
определяют по их оптической плотности по
формуле:

При значениях индекса сдвига нейтрофилов
в пределах от 0,75 до 1,5 чувствительность
организма к испытуемому веществу
определяют как нормальную. Способ
позволяет сократить сроки исследования при
определении чувствительности к
фармацевтическим препаратам и
стоматологическим материалам.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к области
медицины, а именно к лабораторной
диагностике.
Известен способ определения
лекарственной аллергии путем выявления
уровня торможения естественной эмиграции
нейтрофилов в полость рта после полоскания
рта раствором этого препарата в течение 1
мин (Адо А.Д., Польнер Н.И. Тест торможения
естественной эмиграции нейтрофилов in vivo
для специфической диагностики
лекарственной аллергии. Методические
рекомендации. - М., НИИ Иммунологии, 1986. - 20 с.).
Этот тест является небезопасным для
пациента, т.к. с препаратом контактирует
слизистая оболочка всей полости рта. Кроме
того, тест трудоемок и предполагает
обязательное использование микроскопа.
Известен способ определения повышенной
чувствительности организма к местным
анестетикам на основе слизисто-десневого
теста (Лебедев К.А., Максимовский Ю.М.,
Кулмагамбетов И.Р. и др., Слизисто-десневой
тест для определения
гиперчувствительности к местным
анестетикам /Маэстро стоматологии. - 2003. - №3
(12). - С.74-78). Способ состоит в том, что
носителем тестируемого препарата является
лигниновый диск диаметром 10 мм и толщиной 3
мм, который позволяет создать градиент
концентрации препарата и обеспечивает
длительное воздействие препарата на
слизистую оболочку, что позволяет провести
более глубокое исследование влияния
препарата на клетки организма. Диск,
пропитанный раствором препарата,
прикладывают к слизистой оболочке десны и
выдерживают 50 мин, после чего клетки смывов,
взятых до и после воздействия испытуемого
препарата, осаждают центрифугированием,
определяют количество нейтрофилов в смывах.
Определяют индекс сдвига нейтрофилов по их
количественному соотношению в смывах.
Подсчет клеток осуществляют при помощи
светового микроскопа. При значениях 0,8-2,0
определяют нормальную чувствительность
организма к препарату. Данный способ
является безопасным для пациентов,
поскольку он основан на применении
концентрации препарата в 10000 раз более
низкой, кроме того, с препаратом
контактирует не вся поверхность слизистой
оболочки полости рта, а лишь небольшая ее
часть. Однако и в данном способе оценку
результатов осуществляют при помощи
светового микроскопа, что ограничивает
возможности использования данного способа
наличием лаборатории, время оценки
результата составляло - 20 мин на 1-го
больного. Этот способ выбран за прототип.
Задача изобретения - обеспечение
возможности определения чувствительности
организма к практически любому веществу,
сокращение сроков определения
чувствительности организма. Это
достигается за счет того, что подсчет
нейтрофилов осуществляют путем
окрашивания пероксидазы раствором
хромогена, а индекс сдвига нейтрофилов
определяют по их оптической плотности по
формуле:

и при значениях индекса сдвига
нейтрофилов в пределах от 0,75 до 1,5
чувствительность организма к испытуемому
веществу определяют как нормальную.
В целом время исследования 1-го пациента к
1-му препарату по способу-прототипу
занимает 2 часа, а при увеличении количества
обследуемых пациентов, например 10 человек,
увеличивается, и время исследования
занимает 5-6 часов. Затраты времени
увеличиваются за счет процедуры оценки
результатов - каждый раз на 20 мин. Подсчет
результатов под микроскопом - 20 мин на 1
пациента (10 пациентов - 20 мин (10=200 мин).
В предлагаемом способе исследование 1-го
пациента занимает 1 час 20 мин, а
обследование 10 человек занимает 2 часа 20 мин.
Время сокращается за счет того, что оценка
результатов осуществляется путем
окрашивания пероксидазы раствором
хромогена. По предлагаемому способу
подсчет результатов 1 пациента - 2 мин (10
пациентов - 2 мин+9 мин (1=11 мин). Кроме того,
исследование может проводиться в
автоматизированном режиме (одновременно
можно исследовать до 96 человек).
Способ осуществляют следующим образом: у
пациента берут смыв из полости рта (пациент
полощет рот фиксированным количеством
физиологического раствора, обычно 8 мл, в
течение 1 мин, затем осторожно сливает его
обратно в пробирку). Затем к десне
прикладывают образец испытуемого вещества.
В случае, если испытуемое вещество имеет
жидкую консистенцию, то можно применить,
например, лигниновый диск диаметром 10 мм и
толщиной 3 мм, пропитанный раствором
испытуемого препарата в разведении 10-7
от используемых терапевтических растворов
на физиологическом растворе на 50 мин, а при
исследовании чувствительности к веществам
твердой консистенции, в виде гелей или паст
- кусочек этого вещества.
Через 50 мин образец испытуемого вещества
удаляют, а у пациента берут еще один смыв из
полости рта при соблюдении тех же условий,
что и первый смыв. Нейтрофилы из обоих
смывов осаждают центрифугированием.
Надосадочную жидкость сливают, а клетки
отмывают физиологическим раствором,
приливая к осадкам 8 мл физиологического
раствора и ресуспендируя их (таким образом,
удаляют остатки слюны, которая содержит
большое количество пероксидазы). Клетки
вновь осаждают центрифугированием в том же
режиме.
Далее надосадочную жидкость сливают, а к
осадкам приливают равное количество
дистиллированной воды (обычно 1 мл),
тщательно перемешивают. Спустя 2 мин
находящиеся в пробирке клетки лизируются,
при этом из нейтрофилов высвобождается
пероксидаза. В лунки плоскодонного
планшета для проведения иммуноферментного
анализа заливают по 0,1 мл из каждой пробирки.
Приливают по 0,1 мл раствора
тетраметилбензидина (ТМБ). При этом уже
через 1-5 мин начинает развиваться голубое
окрашивание, интенсивность которого
пропорциональна концентрации пероксидазы
в жидкости. Через 10-30 мин реакцию
останавливают, добавляя в лунки 0,1 мл 5%-ного
раствора серной кислоты. Результат
оценивают визуально (с использованием
цветовой шкалы) или при помощи
вертикального фотометра. Определяют индекс
сдвига нейтрофилов по их оптической
плотности (интенсивность окрашивания) по
формуле:

и при значениях от 0,75 до 1,5 определяют
чувствительность организма к испытуемому
веществу как нормальную.
Оценка результатов занимает 2 мин, что в 10
раз меньше, чем по способу-прототипу.
Клинический пример 1
У пациентки Н. (и/б №6014-03), 43 лет, определяли
чувствительность к местным анестетикам с
целью подбора препарата для проведения
терапевтического стоматологического
лечения. В день определяли
чувствительность к 1 препарату.
Перед проведением исследования у
пациентки брали контрольный смыв:
полоскание рта 8 мл физиологического
раствора в течение 1 мин. Затем к десне
прикладывали лигниновый диск диаметром 10
мм и толщиной 3 мм, пропитанный раствором
Ultracaine D-S forte в разведении 10-7 от
терапевтической концентрации.
Длительность аппликации составила 50 мин.
Затем у пациентки вновь взяли смыв из
полости рта в тех же условиях. В обоих
смывах клетки осаждали центрифугированием
при 200 g в течение 10 мин. Надосадочную
жидкость сливали, а к осадку приливали 8 мл
физиологического раствора, осадок
ресуспендировали. Эту процедуру
осуществляли непосредственно после взятия
смывов.
Далее клетки обоих смывов осаждали
центрифугированием в том же режиме.
Надосадочную жидкость сливали, а к осадку
приливали дистиллированную воду до объема 1
мл. Тщательно перемешивали. Через 2 мин по 0,1
мл полученной жидкости заливали в лунки
плоскодонных планшетов, туда же приливали
по 0,1 мл стандартного раствора ТМБ (производство
Хема-Медика, Россия). Спустя 15 мин приливали
по 0,1 мл 5%-ного раствора серной кислоты.
Измеряли оптическую плотность (ОП) при
помощи вертикального фотометра при длине
волны 450 нм. ОП контрольного смыва составила
0,412, после аппликации препарата - 1,123, т.е.
была в 2,73 раза больше (на 173%). Также можно
оценить визуально (с использованием
цветовой шкалы). Был сделан вывод о
повышенной чувствительности пациентки к
данному препарату и невозможности его
использования для местной анестезии. При
опросе пациентки выяснилось, что ранее
выявлялись клинические симптомы аллергии (сыпь)
после применения сульфаниламидных
препаратов (ультракаин является
серосодержащим препаратом).
Аналогичным способом на следующий день у
пациентки определяли чувствительность к
лидокаину 3% (Россия). ОП контрольного смыва
составила 0,533, после аппликации препарата -
0,540, т.е. превышение было в 1,013 (на 1,3%). Был
сделан вывод об отсутствии повышенной
чувствительности организма к данному
анестетику, лидокаин данной фирмы был
рекомендован для использования у данной
пациентки. Пациентка успешно прошла
терапевтическое лечение у стоматолога с
применением данного препарата.
Клинический пример 2
Пациентка Е. (и/б №358-03), 39 лет, обратилась в
нашу клинику по поводу болезненности и
отека слизистой оболочки в районе 13 зуба. В
анамнезе 6 недель назад было проведено
лечение периодонтита этого зуба, каналы
запломбированы. Рентгеновкий снимок
показал удовлетворительное состояние
обтурации каналов. Предположили, что у
пациентки имеется непереносимость
материала, использованного для
пломбирования (цинкоксидэвгеноловой пасты).
Встали вопросы, во-первых, о подтверждении
или опровержении данного предположения, во-вторых,
в случае выявления непереносимости данного
пломбировочного материала о подборе нового
материала для пломбирования. Для
проведения слизисто-десневого
провокационного теста использовали
кусочки готового пломбировочного
материала в том виде, в котором им заполняли
канал зуба (но не отдельные его компоненты).
Перед проведением исследования у пациентки
взяли контрольный смыв: полоскание рта 8 мл
физиологического раствора в течение 1 мин.
Далее к десне прикладывали кусочек
испытуемого материала, длительность
аппликации составила 50 мин. После удаления
материала у пациентки вновь взяли смыв из
полости рта в тех же условиях. Клетки в
обоих смывах осаждали центрифугированием
при 200 g в течение 10 мин. Измеряли ОП при
помощи вертикального фотометра при длине
волны 450 нм. ОП, непосредственно после
взятия смывов, затем приливали 8 мл
физиологического раствора, клетки
ресуспендировали.
Отмытые клетки смывов осаждали
центрифугированием в том же режиме. Затем
надосадочную жидкость сливали, а к осадку
приливали дистиллированную воду до объема 1
мл, перемешивали. Через 5 мин по 0,1 мл
полученной жидкости заливали в лунки
плоскодонного планшета. Приливали по ОД мл
стандартного раствора ТМБ. Спустя 25 мин
реакцию останавливали добавлением ОД мл 5%-ного
раствора серной кислоты. Измеряли ОП при
помощи вертикального фотометра при длине
волны 450 нм. ОП контрольного смыва составила
0,428, смыва после аппликации материала - 0,830, т.е.
коэффициент стимуляции составил 1,94 (превышение
клеток составило 94%). Это соответствовало
наличию у пациентки реакции средней силы на
данный материал, что вполне могло давать
имевшиеся у нее клинические проявления. В
результате было решено произвести
перепломбировку канала.
Для подбора нового пломбировочного
материала у пациентки была определена
чувствительность к двум пломбировочным
материалам: 1) Силдент и 2)
цинкоксидэвгеноловая паста (ЦОЭП) так, как
описано выше (чувствительность проверяли у
материалов - 1 тест в 1 день). При
исследовании материала 1 (Силдент) ОП в
контрольном смыве составила 0,475, после
аппликации препарата - 0,608 (то есть ИС
составил 1,28. При исследовании материала 2 (ЦОЭП)
оптическая плотность в контрольном образце
смыва составила 0,377, после аппликации
препарата - 0,622 (то есть ИС составил 1,65). Для
пломбирования канала был отобран материал 1
(Силдент). После перепломбирования канала с
использованием этого материала
клинические симптомы, по поводу которых
пациентка обратилась к нам в клинику,
исчезли.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ определения чувствительности
организма к фармацевтическим препаратам,
стоматологическим материалам, основанный
на наложении на десну образца испытуемого
вещества, подсчете нейтрофилов в смывах из
полости рта, взятых до и после контакта
слизистой оболочки с веществом,
центрифугировании их, определении уровня
эмиграции нейтрофилов в полость рта,
определении индекса сдвига нейтрофилов,
отличающийся тем, что подсчет нейтрофилов
осуществляют путем окрашивания
пероксидазы раствором хромогена, а индекс
сдвига нейтрофилов определяют по их
оптической плотности по формуле

и при значениях индекса сдвига
нейтрофилов в пределах от 0,75 до 1,5
чувствительность организма к испытуемому
веществу определяют как нормальную.
Версия для печати
Дата публикации 06.01.2007гг

вверх
|