СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКРОФЛОРЫ ПОЛОСТИ РТА И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СОПРОВОЖДАЮЩИХСЯ НАРУШЕНИЯМИ МИКРОФЛОРЫ В ПОЛОСТИ РТА

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКРОФЛОРЫ ПОЛОСТИ РТА И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СОПРОВОЖДАЮЩИХСЯ НАРУШЕНИЯМИ МИКРОФЛОРЫ В ПОЛОСТИ РТА 


RU (11) 2229130 (13) C1

(51) 7 G01N33/48 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 25.10.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2004.05.20 
(21) Регистрационный номер заявки: 2002124297/15 
(22) Дата подачи заявки: 2002.09.12 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2002.09.12 
(45) Опубликовано: 2004.05.20 
(56) Аналоги изобретения: Руководство по медицинской микробиологии. ДЖАВЕЦ Э. и др. - М.: Медицина, 1982, т.2, глава 26, с.273–292. ПОЗДЕЕВ О.К. Медицинская микробиология. /Под ред. акад. РАМН В.И. Покровского. - М.: ГЭОТАР-МЕД, 2001, с.267 и 268. RU 94029889 А1, 10.09.1996. RU 2078344 C1, 27.04.1997. ИВАНЮШКО Т.П. Особенности микрофлоры полости рта. Труды VI съезда. SU 1802322 A1, 15.03.1993. RU 2072787 С1, 10.02.1997. ASAI S. et al. Quantitative analysis of the Epstein-Barr virus-inducing properties of short-chain fatty acids present in the culture fluid of oral bacteria. Arch Virol. 1991; 119(3-4): 291-6. 
(72) Имя изобретателя: Семенов Э.К. (RU); Семенова Э.Э. (RU); Ардатская М.Д. (RU) 
(73) Имя патентообладателя: Государственное учреждение Стоматологическая поликлиника Московской железной дороги (RU); Семенов Эдуард Константинович (RU); Семенова Эльжбета Эдуардовна (RU); Ардатская Мария Дмитриевна (RU) 
(98) Адрес для переписки: 125315, Москва, ул. Усиевича, 18, кв.163, М.Д. Ардатской 

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКРОФЛОРЫ ПОЛОСТИ РТА И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СОПРОВОЖДАЮЩИХСЯ НАРУШЕНИЯМИ МИКРОФЛОРЫ В ПОЛОСТИ РТА 

Изобретение относится к области медицины, в частности к стоматологии, и предназначено для определения и лечения заболеваний, сопровождающихся нарушениями микрофлоры в полости рта. Проводят исследование ротовой жидкости. Определяют количественное и качественное содержание короткоцепочечных жирных кислот. По их суммарному количеству на уровне 0,8–1,9 мг/г судят о нормальном состоянии микрофлоры полости рта. Выбирают фармакологический препарат в соответствии с изменениями микрофлоры. Способ позволяет установить качественный состав микроорганизмов для назначения фармакологического средства и оценить эффективность проводимого лечения. 2 c. и 12 з.п. ф-лы. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к области медицины, в частности к стоматологии, и заключается в определении микрофлоры полости рта и идентификации видового состава микроорганизмов для подбора индивидуального лечения заболеваний полости рта, сопровождающихся нарушениями микрофлоры, с учетом полученных данных.

При лечении таких заболеваний полости рта как гингивит, пародонтит, стоматит и др., протекающих с нарушениями микрофлоры полости рта, лечение антибактериальными средствами назначают сразу, но подбор антибактериального средства у таких пациентов осуществляется чисто эмпирическим путем, без учета бактериальных агентов, которые могут быть представлены популяциями микроорганизмов индигенной микрофлоры. При другой патологии, например множественный кариес, изменения микрофлоры полости рта в широкой стоматологической практике вовсе не учитываются, что сказывается на своевременности проведения адекватной терапии, в частности назначения антибактериальных препаратов, препаратов про- и пребиотиков для коррекции имеющихся нарушений микрофлоры полости рта и для их профилактики. (“Пародонтология”, А.П. Безрукова, ЗАО “Стоматологический научный центр”, Москва, 1999, глава 6).

Наиболее распространенным способом определения нарушений микрофлоры полости рта и выбора антибактериального средства является бактериологическое исследование зубной бляшки, ротовой жидкости, соскобов и мазков-отпечатков со слизистой оболочки и др. с целью определения микроорганизмов, их идентификации и определения чувствительности к антибактериальным средствам. Для чего проводят посев полученного материала на питательные среды. Колонии микроорганизмов, выросшие на питательных средах, подвергают родовой и видовой идентификации для определения их таксономической принадлежности и чувствительности к антибиотикам. Для этого оценивают возможности роста бактерий в аэробных и анаэробных условиях, их отношения к окраске по Грамму, характеру роста на селективных питательных средах и угнетения под действием антибактериальных препаратов и др. (Руководство по медицинской микробиологии, Э. Джавец, Дж.Л. Мельник, Э.А. Эйдельберг, перевод с английского под редакцией д.м.н. Т.В. Перадзе, Москва, “Медицина”, 1982, том 2, глава 26, с.273-292).

Недостатками этого способа является длительность получения результатов, использование дорогостоящих питательных сред, строгое соблюдение условий забора и транспортировки материала, трудность анаэробного культивирования и др. (“Микробная флора полости рта в норме и при патологических состояниях”, Л.О. Иноземцева, М.И. Леверьева, Я.А. Ахременко. Учебное пособие, Якутск, 2000, 80 с.; “Руководство по медицинской микробиологии”, Э. Джавец, Дж.Л. Мельник, Э.А. Эйдельберг, перевод с английского под редакцией д.м.н. Т.В. Перадзе, Москва, “Медицина”, 1982, том 2, глава 26, с.273-292.).

Кроме того, существует способ диагностики нарушений микрофлоры полости рта и оценки эффективности ряда заболеваний полости рта (гингивитов, пародонтитов, стоматитов и др.), основанный на определении антимикробной активности слюны путем ее обработки с взвесью микробов, центрифугирования, калориметрирования надосадочной взвеси микробов. Затем определяют количество микробов, которые фиксированы факторами слюны и выпадают в осадок, и при исходной величине антимикробной активности слюны менее 175 млн. микробных тел лечение считают эффективным. (Патент “Способ контроля эффективности лечения заболеваний полости рта”, В.П. Рочев, Л.А. Мозговая, Н.Б. Фокина, основной индекс MПK G 01 N 33/48).

Основным недостатком этого метода является неспецифичность полученных результатов и невозможность индивидуального подбора терапии.

В литературе существуют работы по определению короткоцепочечных жирных кислот у детей с серозными и гнойными воспалительными процессами в челюстно-лицевой области (“Диагностическая ценность определения короткоцепочечных жирных кислот в слюне у детей с серозными и гнойными воспалительными процессами в челюстно-лицевой области”, О.Е. Алешина, А.И. Волохин, И.Б. Бойко. Труды VII Международной конференции челюстно-лицевых хирургов и стоматологов). Однако представленные данные не имеют существенной практической ценности, т.к. не приближают к определению видового состава микрофлоры полости рта и не могут применяться в подборе индивидуального лечения заболеваний полости рта, сопровождающихся нарушениями микрофлоры.

Задачей настоящего изобретения является создание способа определения микрофлоры полости рта и ее нарушений, часто встречающихся в стоматологической практике, и на нем основанного способа лечения заболеваний полости рта, сопровождающихся нарушениями микрофлоры, отличающегося высокой точностью верификации анаэробно-аэробных популяций микроорганизмов при значительном сокращении времени получения результатов, а также для оценки необходимости назначения фармакологических препаратов, их выбора и оценки эффективности проводимого лечения в реальном масштабе времени, при низкой стоимости исследования.

Способ основан на определении количественного и качественного состава короткоцепочечных жирных кислот, являющихся метаболитами анаэробных и аэробных популяций индигенной микрофлоры. К короткоцепочечным жирным кислотам (фракции С2-С6) относят уксусную, пропионовую, изомасляную, масляную, изовалериановую, валериановую, изокапроновую и капроновую кислоты. Результат, который может быть достигнут при осуществлении способа, - высокая точность верификации анаэробных и аэробных популяций микроорганизмов из малого количества исследуемого материала при быстроте получения ответа (35 мин), что приводит к своевременному и доказательному назначению фармакологических средств и позволяет оценить эффективность проводимого лечения в реальном масштабе времени, при низкой стоимости исследования.

В нашей работе исследования были выполнены у 55 больных с различной патологией полости рта: множественный кариес, гингивит, пародонтит, стоматит, пародонтоз, хронический пульпит.

Изобретение основано на выявленном нами техническом результате, заключающемся в том, что обнаружение в ротовой жидкости суммарного количества короткоцепочечных жирных кислот на уровне 0,8-1,9 мг/г свидетельствует о нормальном состоянии микрофлоры полости рта. Снижение или увеличение суммарного количества короткоцепочечных жирных кислот свидетельствует об изменении количества и функциональной активности облигатной и условно-патогенной микрофлоры полости рта. Верификация видового состава микрофлоры проводится по качественному содержанию короткоцепочечных жирных кислот, т.е. по процентному содержанию отдельных кислот. Содержание уксусной кислоты на уровне 80-83%, пропионовой кислоты на уровне 14-15% и масляной кислоты - на уровне 3-4% в пуле уксусной, пропионовой и масляной кислот, содержание изомеров короткоцепочечных жирных кислот на уровне 4,5-5,0% от общего содержания кислот свидетельствуют о нормальном состоянии микрофлоры полости рта.

Увеличение процента пропионовой и масляной кислот в качественном составе короткоцепочечных жирных кислот свидетельствует о повышенном количестве в полости рта анаэробных популяций микроорганизмов. По нашим данным, при содержании пропионовой кислоты на уровне 17,0-18,5% и уксусной кислоты на уровне 75-78% отмечается увеличение количества бактерий рода Bacteroides в полости рта; при содержании масляной кислоты на уровне 30-35%, уксусной кислоты на уровне 60-65% и пропионовой кислоты на уровне 9-10% -бактерий рода Clostridium и Fusobacterium; содержание пропионовой кислоты на уровне 19-21%, масляной кислоты на уровне 4,5-5,5% и уксусной кислоты на уровне 70-75% свидетельствует об увеличении в полости рта смешанной анаэробной флоры. Содержание пропионовой кислоты на уровне 18-20%, масляной кислоты на уровне 10-12% и изокислот на уровне 5,9-6,5% свидетельствует об увеличении в полости рта анаэробной флоры, обладающей протеолитической и гемолитической активностью. Содержание уксусной кислоты на уровне 89-93%, пропионовой кислоты на уровне 5,5-9,0%, масляной кислоты на уровне 1,5-2,5% и изомеров короткоцепочечных жирных кислот на уровне 3,0-3,8% свидетельствует об увеличении микроорганизмов родов Е.coli, аэробных стрептококков и стафилококков; содержание уксусной кислоты на уровне 87-91% и изомеров короткоцепочечных жирных кислот на уровне 7,0-8,5% свидетельствует об увеличении в полости рта аэробных популяций микроорганизмов, обладающих протеолитической активностью. Изменение содержания кислот в пределах 5-6% от нормальных показателей свидетельствует о минимальных изменениях микрофлоры полости рта.

Выбор антибактериального средства осуществляется согласно полученным данным изменения содержания короткоцепочечных жирных кислот, свидетельствующих о характере нарушений видового состава и популяционной численности микроорганизмов. В случае минимальных изменений со стороны короткоцепочечных жирных кислот антибактериальные препараты не назначаются, возможно применение других средств, например пре- и пробиотиков.

На фоне эффективной терапии происходит изменение содержания короткоцепочечных жирных кислот в ротовой жидкости в сторону нормальных величин.

Способ осуществляют следующим образом.

Больному с заболеванием полости рта проводят забор ротовой жидкости (0,5-1,5 мл) из полости рта в стерильную пробирку. Исследуют количественное содержание и качественный состав короткоцепочечных жирных кислот в полученном содержимом. По результатам исследования делают вывод о характере микробных популяций в полости рта (как было указано выше). В случае выявления изменений назначается тот или иной препарат согласно полученным данным. После курса терапии проводится повторное исследование ротовой жидкости для оценки эффективности проведенного лечения.

Ниже приведены примеры определения нарушений микрофлоры полости рта и способа лечения заболеваний, сопровождающихся данными нарушениями, подтверждающие возможность использования данного способа, который не ограничивается ими.

Пример 1

Больной Л., 27 лет. Диагноз: полость рта санирована. Жалоб нет. Анамнез не отягощен. Status localis: патологии не выявлено. Гигиенический индекс 1,0.

Пациенту проведен забор ротовой жидкости (1,5 мл) в стерильную пробирку для бактериологического исследования и на исследование количественного и качественного состава короткоцепочечных жирных кислот.

При бактериологическом исследовании ротовой жидкости существенных отклонений от нормальных показателей не выявлено.

При исследовании ротовой жидкости на состав короткоцепочечных жирных кислот суммарное количество короткоцепочечных жирных кислот составило 1,3 мг/г. В пуле уксусной, пропионовой и масляной кислот содержание уксусной кислоты составило 81,7%, пропионовой кислоты -14,5%, масляной кислоты - 3,8%, содержание изомеров кислот составило 4,6% в общем пуле кислот, что соответствует нормальному состоянию микрофлоры полости рта.

Пример 2

Больная С., 28 лет. Диагноз: хронический катаральный гингивит в стадии обострения, генерализованный, средней степени тяжести.

Жалобы: на кровоточивость и болезненность десен, неприятный запах изо рта.

Анамнез: считает себя больной около 5 лет. Периодически отмечает кровоточивость десен во время чистки зубов, запах изо рта. Пользовалась дезодорирующими средствами, полосканиями из отвара трав.

Status localis: десневой край отечен, гиперемирован, при зондировании кровоточит. Гигиенический индекс 3,5. Отложение мягкого зубного налета, над- и поднесневого зубного камня. Папилло-маргинальный индекс 1,2.

У больной проведен забор 1,2 мл ротовой жидкости в стерильную пробирку на бактериологическое исследование и на исследование количественного и качественного состава короткоцепочечных жирных кислот.

При бактериологическом исследовании ротовой жидкости выявлено наличие Е.coli, гемофильной палочки, повышенное количество аэробных стрепто- и стафилококков.

При исследовании ротовой жидкости на содержание короткоцепочечных жирных кислот были выявлены следующие изменения: суммарное содержание короткоцепочечных жирных кислот составило 2,5 мг/г, что указывает на изменение количества и функциональной активности микрофлоры. В пуле уксусной, пропионовой и масляной кислот содержание уксусной кислоты составило 90%, пропионовой кислоты - 8,2%, масляной кислоты - 1,8%, содержание изомеров кислот составило 3,5% в общем пуле кислот, что свидетельствует о наличии в полости рта микроорганизмов родов Е.coli, аэробных стрептококков и стафилококков.

По результатам проведенного исследования короткоцепочечных жирных кислот к лечению, включающему антисептическую обработку 3% раствором перекиси водорода и 1% раствором йодинола, добавлены лечебные повязки с 1% левомицетиновой мазью.

При контрольном исследовании ротовой жидкости после проведенного лечения в бактериологическом анализе отмечена положительная динамика: бактерий рода Е.coli и гемофильной палочки не обнаружено, уменьшилось количество аэробных стрепто- и стафилококков.

При исследовании короткоцепочечных жирных кислот после лечения отмечено снижение уровня короткоцепочечных жирных кислот до 1,8 мг/г и изменение качественного состава короткоцепочечных жирных кислот: процент уксусной кислоты составил 83%, пропионовой кислоты - 14%, масляной кислоты - 3,0% и изомеров кислот - 4,5%, что подтверждает эффективность проведенной антибактериальной терапии.

Пример 3

Больной М., 42 года. Диагноз: хронический пародонтит в стадии обострения средней степени тяжести.

Жалобы: на кровоточивость десен, расшатывание зубов, боли при приеме пищи. Анамнез: считает себя больным в течение 7 лет, отмечает кровоточивость десен, расшатывание зубов.

Status localis: гигиенический индекс 4,5, папилло-маргинальный индекс 2,5. Отложение мягкого зубного налета и над- и поддесневого зубного камня. Подвижность зубов I-II степени. Пародонтальные карманы от 3 до 5 мм, гноетечение. При рентгенологическом исследовании атрофия альвеолярного отростка до S длины корня, расширение периодонтальной щели.

Больному проведен забор 1,0 мл ротовой жидкости в стерильную пробирку для бактериологического исследования и на исследование количественного и качественного состава короткоцепочечных жирных кислот.

При бактериологическом исследовании ротовой жидкости выявлен повышенный рост бактерий рода Bacteroides.

При исследовании ротовой жидкости на содержание короткоцепочечных жирных кислот были выявлены следующие изменения: суммарное содержание короткоцепочечных жирных кислот составило 0,7 мг/г, что указывает на изменение количества и функциональной активности микрофлоры. В пуле уксусной, пропионовой и масляной кислот содержание уксусной кислоты составило 76%, пропионовой кислоты - 18%, масляной кислоты - 6%, содержание изомеров кислот составило 4,5% в общем пуле кислот, что свидетельствует об увеличении в полости рта количества анаэробной флоры, представленной бактериями рода Bacteroides.

По результатам проведенного исследования короткоцепочечных жирных кислот к лечению, включающему антисептическую обработку 3% раствором перекиси водорода и 0,05% раствора хлоргексидина, добавлены лечебные повязки с метронидазолом.

На фоне проведенного лечения в контрольных бактериологических исследованиях существенных отклонений от нормы выявлено не было.

При контрольном исследовании ротовой жидкости отмечается нормальный уровень короткоцепочечных жирных кислот 1,5 мг/г и изменение качественного состава короткоцепочечных жирных кислот: содержание пропионовой кислоты составило 15%, масляной кислоты - 4%, уксусной кислоты - 81%, что подтверждает эффективность проведенной антибактериальной терапии.

Достоверность способа подтверждена при сравнении с традиционным бактериологическим исследованием. Чувствительность метода 94±2%. Специфичность метода 92±2%. Воспроизводимость результатов 96±2%.

Таким образом, предлагаемый способ определения микрофлоры полости рта и на нем основанного способа лечения заболеваний полости рта, сопровождающихся нарушениями микрофлоры, позволяет достигнуть высокой точности верификации анаэробно-аэробных популяций микроорганизмов из малого количества исследуемого материала при значительном сокращении времени получения результатов, а также оценить необходимость, вид проводимого лечения и его эффективность в реальном масштабе времени, при низкой стоимости исследования. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



1. Способ определения нарушений микрофлоры полости рта, включающий исследование ротовой жидкости, отличающийся тем, что в ней определяют количественное и качественное содержание короткоцепочечных жирных кислот и по суммарному их количеству на уровне 0,8-1,9 мг/г судят о нормальном состоянии микрофлоры полости рта.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что снижение или увеличение суммарного количества короткоцепочечных жирных кислот свидетельствует об изменении количества и функциональной активности облигатной и условно-патогенной микрофлоры полости рта.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что содержание уксусной кислоты на уровне 80-83%, пропионовой кислоты на уровне 14-15% и масляной кислоты - на уровне 3,0-4,0% в профиле уксусной, пропионовой и масляной кислот, содержание изомеров короткоцепочечных жирных кислот на уровне 4,5-5,0% от общего уровня содержания кислот свидетельствует о нормальном состоянии микрофлоры полости рта.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что увеличение процента пропионовой и масляной кислот в качественном составе короткоцепочечных жирных кислот свидетельствует о повышенном количестве в полости рта анаэробных популяций микроорганизмов.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что содержание пропионовой кислоты на уровне 17,0-18,5% и уксусной кислоты на уровне 75-78% свидетельствует об увеличении количества бактерий рода Bacteroides в полости рта.

6. Способ по п.4, отличающийся тем, что содержание масляной кислоты на уровне 30-35%, уксусной кислоты на уровне 60-65% и пропионовой кислоты на уровне 9-10% свидетельствует об увеличении количества бактерий родов Clostridium и Fusobacterium в полости рта.

7. Способ по п.4, отличающийся тем, что содержание пропионовой кислоты на уровне 19-21%, масляной кислоты на уровне 4,5-5,5% и уксусной кислоты на уровне 70-75% свидетельствует об увеличении в полости рта смешанной анаэробной флоры.

8. Способ по п.4, отличающийся тем, что содержание пропионовой кислоты на уровне 18-20%, масляной кислоты на уровне 10-12% и изокислот на уровне 5,9-6,5% свидетельствует об увеличении в полости рта анаэробной флоры, обладающей протеолитической и гемолитической активностью.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что увеличение процента уксусной кислоты и изомеров короткоцепочечных жирных кислот свидетельствует об увеличении количества аэробной микрофлоры в полости рта.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что содержание уксусной кислоты на уровне 89-93%, пропионовой кислоты на уровне 5,5-9,0%, масляной кислоты на уровне 1,5-2,5% и изомеров короткоцепочечных жирных кислот на уровне 3,0-3,8% свидетельствует о наличии микроорганизмов родов Е. coli, аэробных стрептококков и стафилококков.

11. Способ по п.9, отличающийся тем, что содержание уксусной кислоты на уровне 87-91% и изомеров короткоцепочечных жирных кислот на уровне 7,0-8,5% свидетельствует об увеличении в полости рта аэробных популяций микроорганизмов, обладающих протеолитической активностью.

12. Способ по п.1, отличающийся тем, что изменение содержания кислот в пределах 5-6% от нормальных показателей свидетельствует о минимальных изменениях микрофлоры полости рта.

13. Способ лечения заболеваний полости рта, сопровождающихся нарушениями микрофлоры полости рта, отличающийся тем, что в ротовой жидкости исследуют концентрацию и качественный состав короткоцепочечных жирных кислот, при этом выбирают фармакологический препарат в соответствии с изменениями микрофлоры, установленными по качественному составу короткоцепочечных жирных кислот.

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что в процессе лечения осуществляют контроль его эффективности по количественному и качественному составу короткоцепочечных жирных кислот