СПОСОБ ОЦЕНКИ АКТИВНОСТИ И ХАРАКТЕРА ВОСПАЛЕНИЯ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ

СПОСОБ ОЦЕНКИ АКТИВНОСТИ И ХАРАКТЕРА ВОСПАЛЕНИЯ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ


RU (11) 2152617 (13) C1

(51) 7 G01N33/487, G01N33/52 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 09.07.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2000.07.10 
(21) Регистрационный номер заявки: 99105335/14 
(22) Дата подачи заявки: 1999.03.16 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 1999.03.16 
(45) Опубликовано: 2000.07.10 
(56) Аналоги изобретения: 1. KHARITONOV S. Nitric oxide and asthmatic inflammation. The Eur. Resp. J. 1998, vol.12, s.28. 2. RU 2071727 C1, 20.01.97. 3. RU 2075077 C1, 10.03.97. 4. Диагностика и лечение острых пневмоний, осложненных бронхообструктивным синдромом у детей раннего возраста. Методические рекомендации. - Черновцы, 1989, с. 24. 
(71) Имя заявителя: Невзорова Вера Афанасьевна; Лукьянов Павел Александрович; Кулакова Наталья Валентиновна; Гельцер Борис Израилевич 
(72) Имя изобретателя: Невзорова В.А.; Лукьянов П.А.; Кулакова Н.В.; Гельцер Б.И. 
(73) Имя патентообладателя: Владивостокский государственный медицинский университет 
(98) Адрес для переписки: 690600, Приморский край, г.Владивосток, ул. Острякова 2, Владивостокский государственный медицинский университет 

(54) СПОСОБ ОЦЕНКИ АКТИВНОСТИ И ХАРАКТЕРА ВОСПАЛЕНИЯ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ 

Способ может быть использован в медицине, а именно в пульмонологии. У больного получают бронхоальвеолярный лаваж, в котором определяют биологические маркеры. В качестве биологического маркера используют метаболиты оксида азота и при увеличении их концентрации в период обострения болезни более чем в два раза по сравнению с контролем судят об активности воспаления, а показатели ниже контрольных значений в два и более раза в период ремиссии указывают на необратимый характер воспаления дыхательных путей. Способ позволяет наиболее точно мониторировать течение болезни, оптимизировать лечебные программы, обладает высокой чувствительностью и предполагает уменьшение затрат на лечение вследствие максимальной оптимизации терапии. 3 табл. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к медицине, а именно к пульмонологии.

В современной концепции хронические обструктивные болезни легких рассматривают с позиций хронического воспалительного процесса дыхательных путей, который эволюционирует независимо от степени тяжести и проявлений хронического обструктивного бронхита и бронхиальной астмы [6]. В то же время характер морфологических проявлений воспаления при этих заболеваниях различен, как и подходы к лечению. К настоящему времени признается актуальной разработка биологических маркеров, позволяющих проводить дифференциальную диагностику как внутри гетерогенной группы болезней, объединенных понятием ХОБЛ, так и позволяющих прогнозировать течение процессов воспаления и обструкции дыхательных путей и оптимизировать проводимую терапию [8,9].

Используемые в практической медицине методы оценки активности воспалительного процесса основаны на данных клинического анализа и ряда биохимических показателей крови, изменение которых мало специфично и недостаточно информативно при обострении хронической обструктивной болезни легких. В то же время оптимальной средой, позволяющей наиболее точно отразить состояние дыхательных путей признается жидкость бронхоальвеолярного лаважа. Существуют способы оценки активности воспаления дыхательных путей с помощью исследования содержания индолалкиламинов (серотонина и гистамина) в жидкости бронхоальвеолярного лаважа [1, 10]. Однако изменение их при хронических обструктивных болезнях легких происходит независимо от характера воспаления и не имеет существенных различий при хроническом обструктивном бронхите и бронхиальной астме.

В последнее время в литературе обсуждается вопрос о возможности использования свободного радикального газа оксида азота (NO) в качестве одного из маркеров активности и характера воспаления в дыхательных путях [9]. Измерение содержания газа в выдыхаемом воздухе является простым, неинвазивным, но дорогостоящим методом диагностики.

Принимая во внимание вышесказанное, целью настоящего изобретения явилась разработка способа оценки активности воспаления в дыхательных путях, определяя метаболиты NO в жидкости бронхоальвеолярного лаважа у больных бронхиальной астмой и хроническим обструктивным бронхитом.

Способ осуществлялся следующим образом. Всего было обследовано 105 больных обоего пола в возрасте 20-60 лет, из них у 70 человек имел место хронический обструктивный бронхит и у 35 бронхиальная астма. Диагноз хронического обструктивного бронхита устанавливали согласно эпидемиологическим критериям ВОЗ и международному консенсусу по диагностике и лечению хронических обструктивных болезней легких [4, 6] , а бронхиальной астмы - в соответствии с международным консенсусом по бронхиальной астме [2]. У всех больных хроническим обструктивным бронхитом и бронхиальной астмой наблюдалось среднетяжелое течение болезни.

Состояние функции внешнего дыхания оценивали с помощью показателей, отражающих бронхиальную проходимость - объем форсированного выдоха за 1 с, максимальную объемную скорость выдоха на уровне 25%, 50%, 75% форсированной жизненной емкости легких.

Субсегментарный бронхоальвеолярный лаваж получали в объеме 25 мл по методике, описанной Г.И. Лукомским и соавт. [3]. Контролем служил бронхоальвеолярный лаваж, взятый у здоровых лиц. Аликвоту жидкости бронхоальвеолярного лаважа, содержащую в своем составе 10 частей 2% ЭДТА центрифугировали, исследования проводили с бесклеточными фракциями бронхоальвеолярного лаважа.

В жидкости бронхоальвеолярного лаважа больных бронхиальной астмой и хроническим обструктивным бронхитом определяли сумму метаболитов оксида азота - NO2- и NO3-. Так как NO2- является неустойчивым анионом и при воздействии окислителей легко доокисляется до NO3-, для определения всей суммы метаболитов нитрат ион восстанавливали с помощью металлического кадмия, импрегнированного медью до нитрит иона, содержание которого определяли с помощью реактива Грейса [7]. Измерение проводили на спектрофотометре Dynatech при 540 нм (С1.99, Т1.99). В норме уровень метаболитов NO в жидкости бронхоальвеолярного лаважа был равен 0,83 + 0,04 нмоль/мл.

Для сравнения специфичности используемого маркера в жидкости бронхоальвеолярного лаважа также изучена активность индолалкиламинов - гистамина и серотонина.

Анализ индолалкиламинов (гистамина и серотонина) был проведен одномоментно в одной пробе, что позволило установить более тесную связь между ними, путем создания одинаковых условий. Определение концентрации гистамина проводили в присутствии ортафталиевого диальдегида (Sigma, США). Измеряли интенсивность флюоресценции при 440 нм полученного комплекса моноамина и ортафталиевого диальдегида при длине волны возбуждения 338 нм методом двойного сканирования. При построении калибровочной кривой использовали стандарт основания гистамина (Fluka Chemical AG, Германия).

Количественный анализ серотонина в жидкости бронхоальвеолярного лаважа проводили по стандартной методике [5] в кислотной фазе на спектрофлюориметре при длине волны возбуждения 295 нм и регистрировали при 545 нм методом двойного сканирования.

Количество гистамина и серотонина в контрольной группе обследованных составило соответственно 0,007 0,0002 и 0,085 0,001 мкмоль/л.

Результаты обрабатывали методом вариационной статистики, достоверность различий определяли по критерию Стьюдента (t) и непараметрическим критериям рангов Спирмена. Данные считались достоверными при Р < 0,05.

Как видно из данных, представленных в таблице 1, в период обострения бронхиальной астмы и хронического обструктивного бронхита наблюдалось повышение уровня NO с наиболее высокими значениями при бронхиальной астме, когда его показатели превысили содержание у здоровых почти в три раза, а в сравнении с больными хроническим обструктивным бронхитом вдвое.

К периоду ремиссии секреция NO и соответственно содержание продуктов его метаболизма в жидкости бронхоальвеолярного лаважа снижались. При этом у больных бронхиальной астмой концентрация метаболитов NO оставалась достоверно выше, чем у здоровых. Тогда как при хроническом обструктивном бронхите секреция газа резко падала и становилась почти вдвое ниже по сравнению с контрольной группой обследованных.

Для решения вопроса о возможной взаимосвязи между активностью NO и процессами обструкции дыхательных путей, связанных с преобладанием обратимого и необратимого характера воспаления при бронхиальной астме в первом случае и хроническом обструктивном бронхите во втором, проведен корреляционный анализ непараметрических рангов Спирмена показателей функции внешнего дыхания и концентрации NO2- и NO3- в жидкости бронхоальвеолярного лаважа.

Установлено, что в период обострения хронического обструктивного бронхита и бронхиальной астмы между рассматриваемыми показателями существуют тесные обратные связи, о чем свидетельствуют данные коэффициента корреляции r = -0,55, Р < 0,001 и r = -0,63, Р < 0,001 соответственно. К периоду ремиссии бронхиальной астмы прослеженная закономерность сохраняется (r = -0,48, Р < 0,001), тогда как при хроническом обструктивном бронхите корреляционная взаимосвязь ослабевает и становится недостоверной (r = -0,13, Р > 0,05). Иначе, повышение активности NO при бронхиальной астме совпадает с ухудшением показателей бронхиальной проходимости. Тогда как при ХОБ увеличение концентрации метаболитов NO в ЖБАЛ происходит только в период обострения болезни при наличии активного воспаления в дыхательных путях, а к периоду ремиссии, несмотря на сохранение бронхиальной обструкции вследствие необратимого воспалительного процесса в дыхательных путях уровень секреции газа снижен.

Таким образом, проведенные исследования показали, что содержание метаболитов NO в ЖБАЛ при БА и ХОБ зависит от активности воспалительного процесса и повышается при обострении заболеваний, наиболее заметно в первом случае и зависит от характера воспаления, сохраняясь повышенным при ремиссии БА и резко снижаясь в этот же период у больных ХОБ при преобладании необратимых изменений в бронхиальном дереве.

Как видно из данных, представленных в таблице 2, в период обострения бронхиальной астмы и хронического обструктивного бронхита наблюдалось значительное повышение концентрации гистамина. К периоду ремиссии заболеваний уровень моноамина снижался, но оставался выше, чем у здоровых.

Проведенный анализ непараметрических рангов Спирмена между показателями гистамина и объемом форсированного выдоха за 1 секунду в разные периоды болезни показал наличие тесных отрицательных связей. Так, во время обострения хронического обструктивного бронхита и бронхиальной астмы показатели коэффициента корреляции составили -0,68 (Р < 0,001) и -0,78 (Р < 0,001) соответственно. Во время ремиссии прослеженная закономерность сохранялась, и показатели коэффициента составили при хроническом обструктивном бронхите r = -0,59 (Р < 0,001) и бронхиальной астме r = -0,62 (Р < 0,001).

Таким образом, активность гистамина в жидкости бронхоальвеолярного лаважа больных хронической обструктивной болезнью легких, в отличие от оксида азота, развивается однонаправленно и связана как с активностью воспаления, так и со степенью обструктивных нарушений, повышаясь при обострении бронхиальной астмы и хронического обструктивного бронхита и снижаясь к периоду ремиссии. Иначе говоря, содержание гистамина в жидкости бронхоальвеолярного лаважа не зависит от характера воспаления дыхательных путей при различных формах хронической обструктивной болезни легких.

Как следует из данных, представленных в таблице 3, динамика уровня серотонина в жидкости бронхоальвеолярного лаважа при хроническом обструктивном бронхите и бронхиальной астме была аналогичной содержанию гистамина. Так, при обострении хронической обструктивной болезни легких активность моноамина значительно возрастала и, снижаясь к периоду ремиссии, оставалась выше, чем в контрольной группе.

Анализ непараметрических критериев ранга Спирмена показал наличие умеренных отрицательных корреляционных связей между содержанием серотонина и вентиляционными параметрами функции внешнего дыхания при обострении бронхиальной астмы (r = -0,62, Р < 0,01) и хронического обструктивного бронхита (r = -0,63, Р < 0,01), с сохранением установленной закономерности к периоду ремиссии.

Таким образом, динамика содержания серотонина в жидкости бронхоальвеолярного лаважа больных хронической обструктивной болезнью легких аналогична изменению уровня гистамина и связана как с активностью воспаления в дыхательных путях, так и с обусловленными воспалением обструктивными нарушениями независимо от обратимости или необратимости их характера.

Итак, проведенное нами биохимическое тестирование жидкости бронхоальвеолярного лаважа больных хроническим обструктивным бронхитом и бронхиальной астмой показало существование взаимосвязи между содержанием в изучаемой биологической среде метаболитов NO, гистамина, серотонина и активностью воспаления при хронической обструктивной болезни легких.

При этом динамика уровня индолалкиламинов при бронхиальной астме и хроническом обструктивном бронхите связана с активностью воспаления и не зависит от его характера, развиваясь однонаправленно при преобладании как обратимого, так и необратимого компонентов.

В то время как при изучаемых формах хронической обструктивной болезни легких в содержании метаболитов NO имеются существенные различия, а именно уровень секреции газа в период обострения бронхиальной астмы более чем вдвое превышает показатели у здоровых и выше, чем у больных хроническим обструктивным бронхитом. В период ремиссии хронического обструктивного бронхита в условиях необратимого ремоделирования стенки бронхов активность оксида азота резко снижается.

Тогда как при бронхиальной астме при наличии обратимых воспалительных изменений показатели метаболитов оксида азота в жидкости бронхоальвеолярного лаважа остаются выше, чем у здоровых.

Таким образом, предлагаемый нами способ оценки активности и характера воспалительного процесса в дыхательных путях позволяет проводить дифференциальную диагностику между двумя ведущими формами хронической обструктивной болезни легких - бронхиальной астмой и хроническим обструктивным бронхитом, наиболее точно мониторировать течение болезни и оптимизировать используемые лечебные программы. Экономический эффект предлагаемого способа диагностики основан на возможности оценки активности NO в жидкостных средах без использования дорогостоящей хемолюминесцентной техники. Высокая чувствительность метода предполагает уменьшение затрат на лечение вследствие максимальной оптимизации терапии.

Список литературы

1. Абросимов В.Н., Порядин Г.В. Воспаление и гиперреактивность дыхательных путей при бронхиальной астме (лекция) //Тер. архив. - 1994. -N 11 - С. 60-64.

2. Бронхиальная астма. Глобальная стратегия. Совместный доклад Национального института Сердце, Легкие, Кровь и Всемирной организации здравоохранения //Пульмонология. - 1996. - Приложение.- 165 с.

3. Лукомский Г. И., Шулутко М.В., Виннер М.Г. Бронхопульмонология. М.: Медицина. - 1982. - 400 с.

4. Овчаренко С.И. Хронический обструктивный бронхит: клиника, диагностика, лечение //Клин. мед. -1997. - N 6. - С. 53-57.

5. Соминский В.Н., Калниня И.Э., Кузнецова В.А. и др. Методика определения серотонина и гистамина в одном образце //Люминесцентный анализ в медико-биологических исследованиях. Рига. 1983. С. 85-88.

6. Чучалин А.Г. Хронический обструктивный бронхит // Тер. архив. - 1997. - N 3. - С. 5-9.

7. Green L.C., Wagner D.A., Glogowski J. et al. Analysis of nitrate, nitrite, and [15N] Nitrate in biological fluids. /Analyt. Biochemistry.- 1982. -Vol. 126. - P. 131-138.

8. Kharitonov S., Alving K. Barnes P. J. Increased nitric oxide in enxaled air of asthmatic patients //European Resp. Jour. - 1997. - Vol. 10, S. 7. - P. 1683 - 1693.

9. Kharitonov S., Sapienza M.A., Barnes P.J. Nitric oxide and asthmatic inflammation // The Eur. Resp. J. - 1998. -Vol. 12, S. 28. - 364 s.

10. Rankun J. A., Kaliner М., Reynolds H. Y. Histamine levels in bronchalveolar lavage from patiets with asthma, sarcoidosis, and idiopathic pulmonary fibrosis //J. Allergy Clin.Immunol. - 1987. -V.79, N 2. - P. 371-377. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



Способ оценки активности и характера воспаления дыхательных путей методом определения биологических маркеров в жидкости бронхоальвеолярного лаважа, отличающийся тем, что в качестве биологического маркера используют метаболиты оксида азота и при увеличении их концентрации в период обострения болезни более чем в два раза по сравнению с контролем судят об активности воспаления, а показатели ниже контрольных значений в два и более раза в период ремиссии указывают на необратимый характер воспаления дыхательных путей.