СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОСТОЯНИЯ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ И ДЫХАТЕЛЬНОЙ СИСТЕМ НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ОКСИДА АЗОТА В ВЫДЫХАЕМОМ ВОЗДУХЕ

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОСТОЯНИЯ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ И ДЫХАТЕЛЬНОЙ СИСТЕМ НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ОКСИДА АЗОТА В ВЫДЫХАЕМОМ ВОЗДУХЕ


RU (11) 2143689 (13) C1

(51) 6 G01N33/497, G01N33/483 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 26.07.2007 - прекратил действие 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 1999.12.27 
(21) Регистрационный номер заявки: 98119852/14 
(22) Дата подачи заявки: 1998.10.30 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 1998.10.30 
(45) Опубликовано: 1999.12.27 
(56) Аналоги изобретения: 1. PCT 95/02181, 19.01.95. 2. RU 2029951 C1, 27.02.95. 3. RU 2117290 C1, 10.08.98. 4. RU 2092846 C1, 10.10.97. 5. RU 95109305 C1, 20.12.96. 
(71) Имя заявителя: Малышев Игорь Юрьевич 
(72) Имя изобретателя: Малышев И.Ю.; Манухина Е.Б. 
(73) Имя патентообладателя: Малышев Игорь Юрьевич 
(98) Адрес для переписки: 121165, Москва, а/я 15, ООО "Юстис" 

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОСТОЯНИЯ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ И ДЫХАТЕЛЬНОЙ СИСТЕМ НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ОКСИДА АЗОТА В ВЫДЫХАЕМОМ ВОЗДУХЕ 

Способ может быть использован в медицине, а именно в кардиопульмонологии при исследовании состояния сердечно-сосудистой системы и органов дыхания. Пациенту предлагают выдыхать воздух в течение 5-7 мин через У-образную стеклянную трубку, колено которой погружено в охладитель. Таким образом получают конденсат выдыхаемого воздуха. В анализируемой пробе конденсата, содержащей нитриты и нитраты, проводят восстановление нитратов до нитритов. Спектрофотометрически в области 540 нм определяют содержание нитритов. Концентрация оксида азота является эквимолярной установленной концентрации нитритов. О патологическом состоянии систем судят по увеличению или уменьшению полученного значения от нормы, составляющей 3,1 - 5,1 мкмоль. Способ обеспечивает высокую точность определения содержания оксида азота, возможность длительного хранения полученных проб. 3 з.п.ф-лы. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к области медицины, а именно к кардиопульмонологии, и может быть использовано при исследовании состояния сердечно-сосудистой системы и органов дыхания.

В настоящее время для оценки состояния сердечно-сосудистой системы и органов дыхания используют различные методы, в основе которых лежит исследование выдыхаемого воздуха с помощью всевозможных инструментальных средств, при этом анализу подвергают как непосредственно выдыхаемый воздух в газообразном состоянии, так и его конденсат. В каждом из используемых способов устанавливают свои критерии оценки для определения состояния указанных систем организма.

Известен способ дифференциальной диагностики заболеваний бронхолегочной системы путем биохимического исследования биологической жидкости, при этом в конденсате выдыхаемого воздуха определяют относительное содержание жирных кислот C16:0 и C19:0, рассчитывают коэффициент C16:0/C19:0 и при определенных его значениях устанавливают то или иное заболевание (RU 95109305, 1996, G 01 N 33/497).

Полученные при осуществлении способа показатели свидетельствуют о наличии заболеваний, но не могут дать картины процессов, происходящих на более ранних стадиях.

Известен способ определения функционального состояния бронхорецепторного аппарата путем проведения бодиплетизмографии, при котором проводят исследование показателей биомеханики, рассчитывают степень бронхообструктивного синдрома (БОС) по определенной формуле и при повышении количественных показателей БОС более чем одного количественного показателя определяют наличие патологии бронхореспираторной системы, а после дополнительного проведения холодового воздействия, физической нагрузки, постнагрузки, ингаляций раствором гистамина, сальбутамола проводят исследование показателей биомеханики дыхания и при изменении показателя более чем на 20% от исходного уровня определяют реакцию как положительную (RU, 2092846, 1997, G 01 N 33/483).

Известен также способ оценки функционирования кардиореспираторной системы с помощью специального устройства, которое позволяет получить одномоментную информацию о сердечной и дыхательной деятельности с межсистемным анализом взаимосвязи данных систем как в процессе вдоха, так и выдоха. При осуществлении способа используется сложная система дорогостоящей аппаратуры. При обследовании пациента параллельно обрабатывают и анализируют кардиоинтервалограмму непрерывно при вдохе и выдохе пациента, а также анализируют разные порции воздуха, идущие, например, из мертвого пространства легких или из мелких бронхов, или альвеол, несущие информацию о газовом составе и количестве данного воздуха. Эта информация, в свою очередь, поступает на интегратор, где анализируется в зависимости от заданной программы (RU 2098012, 1997, A 61 B 5/0205).

Известные способы являются трудоемкими и требуют использования сложной дорогостоящей аппаратуры при выполнении ряда нескольких последовательных исследований.

Большое распространение при исследовании состояния органов дыхания получил способ определения содержания NO в выдыхаемом воздухе с помощью хемилюминесценции, который позволяет регистрировать его изменение при патологических процессах и физиологических воздействиях.

Ближайшим аналогом изобретения является способ определения состояния дыхательных путей, заключающийся в том, что обследуемый выдыхает воздух в специальное устройство, а затем определенную его порцию анализируют с помощью хемилюминесценции и по завышенному количественному содержанию NO в анализируемой пробе по сравнению с контролем устанавливают наличие воспалительных заболеваний или риск их возникновения (PCT 95/02181, 19.01.95, G 01 N 33/00).

Способ является сложным, связан с использованием дорогостоящего стационарного оборудования, не обеспечивает возможность отсроченного анализа и проведение исследований в малых клиниках скорой помощи и в полевых условиях.

Задачей изобретения является создание нового способа, позволяющего с высокой точностью и быстро определить содержание оксида азота (NO) в выдыхаемом воздухе с использованием доступного оборудования, что ускоряет процесс постановки диагноза, при этом изобретение позволяет проводить отсроченные измерения.

Поставленная задача решена заявленным способом определения состояния сердечно-сосудистой и дыхательной системы, включающим анализ выдыхаемого воздуха на содержание оксида азота с последующим установлением патологического состояния систем при достоверном изменении его количества в анализируемой пробе по сравнению с нормой.

Отличие изобретения состоит в том, что анализу подвергают конденсат выдыхаемого воздуха, содержащий стабильные конечные метаболиты NO нитриты и нитраты, при этом предварительно проводят восстановление в анализируемой пробе конденсата нитратов до нитритов с последующим спектрофотометрическим определением при 540 нм их содержания и определения концентрации оксида азота эквимолярной установленной концентрации нитритов в анализируемой пробе, а о патологическом состоянии систем судят по увеличению или уменьшению полученного значения от нормы, составляющей 3,1-5,1 мкмоль нитритов в конденсате воздуха.

Технический результат заключается в повышении достоверности получаемых результатов, обусловленной следующим: проходя по дыхательным путям, оксид азота частично окисляется до стабильных метаболитов-нитритов и нитратов. В известных методах, основанных на определении NO в выдыхаемом воздухе, часть NO подвергается окислению, не регистрируется газоанализатором, что искажает истинные результаты, и в итоге точность и достоверность анализа снижаются.

В предложенном способе регистрация NO проводится более полно - по конечным метаболитам, содержащимся в конденсате - нитритам и нитратам, являющимся стабильными в растворенном состоянии.

Способ позволяет измерять содержание NO в выдыхаемом воздухе в наномолярных концентрациях с точностью 0,1 нМ, что не ниже порога чувствительности и точности хемилюминесцентного газового анализа. В отличие от газового анализа предлагаемый способ позволяет оценивать среднюю скорость продукции NO, т.е. снижает влияние внесения поправки на вентиляцию и соответственно не является обязательным использование специального оборудования для оценки вентиляции.

Способ осуществляют следующим образом.

Пациенту предлагают выдыхать воздух в течение 5-7 мин через U-образную стеклянную трубку, колено которой погружено в охладитель. Таким образом получают конденсат выдыхаемого воздуха. Для анализа берут аликвоту объемом 720 мкл. Вносят ее в реактор, добавляют в нее для обработки 80 мкл буфера 0,5 М NH4OH PH 9,0 в соотношении буфер-проба 1:9. Затем проводят инкубацию пробы в реакторе в течение 5 - 30 мин. Из реактора берут аликвоту объемом 400 мкл и добавляют 400 мкл реактива Грисса. Восстановление активности реактора осуществляют последовательно при помощи 10 мл 0,1н HCl и 10 мл CuSO4.

Далее полученный раствор инкубируют в реакторе Nitralyzer в течение 10 минут при комнатной температуре. При этом сердцевинный элемент реактора, содержащий кадмий, обработанный медью, при погружении в анализируемую пробу восстанавливает нитраты до нитритов. Затем проводят количественное определение нитритов спектрофотометрически в области 540 нм. Для определения содержания NO строят калибровочную кривую для оптической плотности стандартных растворов NaNO2 в диапазоне концентраций от 0,5 до 50 мкМ. По этой калибровочной кривой определяют концентрацию NaNO2 для данной оптической плотности пробы. Количество NO эквимолярно сумме нитритов и нитратов, содержащихся в анализируемой пробе конденсата выдыхаемого воздуха.

На основании многочисленных проведенных авторами изобретения исследований установлена норма содержания NO в конденсате выдыхаемого воздуха. Нормой являются значения концентрации NO в диапазоне от 3,1 до 5,1 мкМ.

Нижеследующие примеры иллюстрируют изобретения.

Пример 1. С помощью предлагаемого способа проведено определение продукции NO у здоровых молодых курящих и некурящих мужчин и установлена степень влияния табачного дыма на функциональное состояние сосудистого эндотелия. Показано, что продукция NO у некурящих составляла 4,70,4 мкМ, тогда как у курящих - 2,1-0,1 мкМ, т.е. было достоверно снижено. В пересчете с конденсата на выдыхаемый воздух это количественно соответствует литературным данным о том, что курение вызывает снижение концентрации NO в выдыхаемом воздухе, причем имеется корреляция между снижением продукции NO и числом выкуриваемых сигарет. У курильщиков продукция NO в дыхательных путях снижена из-за токсического действия табачного дыма на NO-продуцирующие клетки и ухудшения газообмена.

Пример 2. С помощью предлагаемого способа проведено определение продукции NO у молодых здоровых мужчин в покое и после физической нагрузки (100 приседаний). Продукция NO после нагрузки достоверно увеличилась в среднем на 59% (с 3,7+0,2 до 4,20,4 мкМ). В пересчете с конденсата на выдыхаемый воздух это количественно согласуется с литературными данными о том, что при физической нагрузке концентрация NO в выдыхаемом воздухе с поправкой на вентиляцию возрастает, причем это возрастание составляет по разным данным от 35 до 100%. Показатели продукции NO до и после нагрузки в норме.

Пример 3. С помощью предлагаемого способа проведено определение продукции NO у молодых здоровых мужчин и у добровольцев того же возраста, страдающих острым респираторным заболеванием (воспаление верхних дыхательных путей). Респираторное заболевание вызвало повышение продукции NO до 7,40,3 мкМ. В пересчете с конденсата на выдыхаемый воздух это количественно согласуется с литературными данными о том, что воспалительный процесс, обусловленный бактериями в верхних дыхательных путях, существенно увеличивает концентрацию NO в выдыхаемом воздухе.

Пример 4. Изучена возможность отсроченной оценки измерения содержания NO в пробах конденсата выдыхаемого воздуха с помощью предлагаемого способа. Для этого было проведено измерение содержание NO в аликвотах проб непосредственно после их забора, а затем содержание NO было измерено повторно в других аликвотах тех же проб, хранившихся в течение 48 часов при комнатной температуре. Содержание NO до и после хранения проб составило соответственно 17,7+3,2 и 17,9+4,0 мкМ.

Таким образом, способ позволяет с высокой точностью измерять содержание NO в выдыхаемом воздухе и регистрировать его изменения при физиологических воздействиях и патологических процессах. При этом предлагаемый способ позволяет проводить отсроченные измерения и не требует специальных условий хранения и/или транспортировки проб.

Преимущества определения NO в конденсате выдыхаемого воздуха предлагаемым методом:

1. Более высокая точность анализа за счет определения NO по суммарному количеству нитритов и нитратов.

2. Возможность введения дополнительного показателя - легочного клиренса NO, который рассчитывается как отношение количества NO в выдыхаемом воздухе к концентрации NO в плазме крови, которая измеряется одновременно тем же методом в начале периода сбора конденсата воздуха. Определение легочного клиренса NO может служить одним из показателей эффективности ингаляции NO, которое широко применяется при некоторых заболеваниях (респираторном дистресс-синдроме новорожденных, легочной гипертонии и т.д.).

3. Отсутствие необходимости в депротеинизации пробы.

4. Возможность длительного хранения полученных проб конденсированного воздуха. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



1. Способ определения состояния сердечно-сосудистой и дыхательной системы на основе анализа оксида азота в выдыхаемом воздухе, включающий анализ выдыхаемого воздуха на содержание оксида азота с последующим установлением патологического состояния систем при достоверном изменении его количества в анализируемой пробе по сравнению с нормой, отличающийся тем, что анализу подвергают конденсат выдыхаемого воздуха, содержащий нитриты и нитраты, при этом предварительно проводят восстановление в анализируемой пробе конденсата нитратов до нитритов с последующим определением их содержания и определения концентрации оксида азота эквимолярной установленной концентрации нитритов в анализируемой пробе, а о патологическом состоянии систем судят по увеличению или уменьшению полученного значения от нормы.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве нормы принимают концентрацию, находящуюся в пределах 3,1 - 5,1 мкмоль.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что определение содержания конденсата нитритов осуществляют спектрофотометрическим методом.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что определение содержания конденсата нитритов осуществляют при длине волны в области 540 нм.