СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ ПЕЦИЛОМИКОЗА

СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ ПЕЦИЛОМИКОЗА


RU (11) 2287163 (13) C2

(51) МПК
G01N 33/49 (2006.01) 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 26.07.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(14) Дата публикации: 2006.11.10 
(21) Регистрационный номер заявки: 2005104470/15 
(22) Дата подачи заявки: 2005.02.18 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2005.02.18 
(43) Дата публикации заявки: 2006.07.27 
(45) Опубликовано: 2006.11.10 
(56) Аналоги изобретения: SU 1775047 A3, 07.11.1992. RU 2152721 C1, 20.07.2000. SU 1834639 A3, 15.08.1993. Руководство по лабораторной диагностике вирусных риккетсиозных болезней. Под ред. П.Ф.ЗДРОДОВСКОГО и М.И.СОКОЛОВА. М.: Медицина, 1965, стр.41-45. Г.А.МЕРКУЛОВ. Курс патологогистологической техники. 5-е изд. Медицина, Л.: 1969, стр.290. 
(72) Имя изобретателя: Ахунова Алима Муратовна (RU); Ахунов Василий Михайлович (RU) 
(73) Имя патентообладателя: Ахунова Алима Муратовна (RU); Ахунов Василий Михайлович (RU) 
(98) Адрес для переписки: 115201, Москва, Старокаширское ш., 4, корп.1, кв.169, В.М.Ахунову 

(54) СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ ПЕЦИЛОМИКОЗА
Изобретение относится к области медицины, в частности к микологии, инфекционным болезням, гематологии, пульмонологии, дерматологии, терапии, неврологии, аллергологии. Способ экспресс-диагностики пециломикоза включает взятие образца крови (0.02 мл) и помещение его в физиологический раствор (4 мл), подкрашенный генциановым фиолетовым из расчета 10 мг на 100 мл физиологического раствора. После 5-минутного окрашивания содержимое пробирки перемешивают стеклянной палочкой и помещают в счетную камеру Горяева. Выявляют окрашенные сферулы гриба и производят их количественное определение в 100 больших квадратах. Изобретение обеспечивает быструю диагностику заболевания пециломикоза. 2 табл., 2 ил.




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Изобретение относится к медицине, в частности к микологии, инфекционным болезням, гематологии, пульмонологии, дерматологии, терапии, неврологии, аллергологии. Может быть использовано при постановке диагноза пециломикоза, сепсиса, анемии, атипичной пневмонии, бронхиальной астмы, энцефаломиелита, пузырных дерматозов и зудящих дерматозов.

В настоящее время многие заболевания, сопровождающиеся аллергическими проявлениями, относят к псевдоаллергическим, поскольку у них аллергологическое обследование с известной группой аллергенов показывает отрицательные результаты (Г.И.Дрынов, 2004) [1]. Нами выявлен новый вид хронической инфекции крови тканевыми формами условно-патогенных грибов рода Paecilomyces, активация которых под влиянием ОРВИ или др. инфекций, или различных стрессовых ситуаций, стимулирует выработку специфических IgE- и/или IgG-антител с развитием аллергических симптомов и, в том числе, бронхиальной астмы [2].

Наблюдаемая клиническая картина инфекционного процесса, вслед за симптомами которого через 7-14 дней развиваются клинические проявления кожного и/или респираторного аллергоза является типичной для клинически выраженного пециломикоза и зачастую, по жизненным показаниям требует ускоренной диагностики и оказания неотложной помощи.

Грибы рода Paecilomyces широко распространены в природе и встречаются во всех странах, что определяет массовую инфицированность ими населения земного шара. Они обладают диморфизмом и встречаются в двух формах - культуральной и тканевой (фиг.1, 2). Культуральная форма представлена мицелием, а тканевая - сферулой. Зрелая сферула грибов рода Paecilomyces - округлые или овальные тельца с двухконтурной капсулой, внутри которой заключены эндоспоры. Основная масса зрелых сферул гриба рода Paecilomyces имеет размеры в пределах 4-5 мкм и 10-11 мкм в диаметре и только отдельные из них достигают размеры 20-21 мкм и 28-29 мкм в диаметре. Соответственно этому основная масса эндоспор имеет размеры от 0,3-0,5 мкм в диаметре, а отдельные из них - 1,0-1,5 мкм в диаметре. Порядок расположения эндоспор в зрелой сферуле специфичен и имеет характерный узорчатый рисунок для каждого вида. Развитие эндоспоры в зрелую сферулу осуществляется главным образом внутриклеточно, по-видимому, используя сложные белки ядер клеток как основной источник пластического материала, необходимого для их роста и развития. При этом происходит гибель клетки с распадом ее клеточной структуры и выходом зрелых сферул в окружающую среду. [3].

Пециломикоз в форме сепсиса был впервые описан у человека Uys и соавт. в 1963 г. [4].

В последующие годы были описаны другие наблюдения, которые характеризуют его как системное заболевание, при котором наряду с поражениями кожных и слизистых покровов описаны поражения различных внутренних органов [5].

Известен способ культурального выделения грибов рода Paecilomyces из патологического материала больных (A.M.Ахунова, патент №1775047, выданный Государственным комитетом по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР, 1990 г.),когда предварительная инкубация в гепаринизированной среде 199 повысила чувствительность метода культурального выделения грибов рода Paecilomyces от 0-1% до 44-73%. Однако вся процедура выделения гриба охватывает период от 5 до 14 дней, что затрудняет своевременное оказание неотложной помощи. В то же время в связи с условно-патогенными свойствами грибов рода Paecilomyces при постановке диагноза пециломикоз возникла необходимость количественного учета микрофлоры.

Цель настоящей работы - разработка способа экспресс-диагностики пециломикоза путем выявления морфологических структур гриба рода Paecilomyces в крови и разграничения пецилоносительства от форм клинического проявления пециломикозной инфекции путем прямого количественного подсчета зрелых сферул гриба.

Задачей изобретения является ускорение метода диагностики пециломикоза.

Задача решается путем помещения образца крови в физиологический раствор, подкрашенный генциановым фиолетовым из расчета 10 мг красителя на 100 мл физиологического раствора для прокрашивания полисахаридных компонентов капсул сферул гриба в багрово-фиолетовый цвет.

Задача осуществляется:

1-й этап исследования: После обработки мякоти безымянного пальца спиртом у больного производили забор крови в количестве 0,02 мл и помещали в пробирку, содержащую 4 мл стерильного 0,9% физиологического раствора, подкрашенного генциановым фиолетовым и оставляли для прокрашивания в течение 5 минут при комнатной температуре. После чего содержимое пробирки перемешивали стеклянной палочкой и вносили в камеру Горяева. Счетную камеру Горяева оставляли в горизонтальном положении на 1 мин для осаждения сферул гриба и эритроцитов. Для лучшего контрастирования затемняли поле зрения, опуская конденсор и прикрывая диафрагму. Прямой количественный подсчет зрелых сферул гриба, окрашенных в багрово-фиолетовый цвет, производили по всей сетке в 100 больших квадратах, начиная с левого верхнего угла сетки. Считали сферулы при увеличении окуляр 10, объектив 15. В случае затруднения их распознавания использовали увеличение объектив 20, окуляр 15. Подсчету подлежали зрелые сферулы гриба размерами от 4-5 мкм до 28-29 мкм в диаметре. Меньшие формы недостаточно ясны для распознавания и нами не учитывались. Расчет зрелых сферул гриба производили исходя из разведения крови (200), числа сосчитанных квадратов (100) и объема большого квадрата (1/250) по формуле:



где Х - число зрелых сферул гриба 1 мкл крови;

С - число зрелых сферул гриба в 100 больших квадратах.

Новым в предложенном техническом решении для постановки диагноза пециломикоза является:

1 - специфическая окраска клеток гриба генциановым фиолетовым, что отличает их от эритроцитов.

2 - количественный подсчет окрашенных зрелых сферул гриба исходя из объема квадратов и разведения крови в счетной камере Горяева.

Обследование проведено у 24 носителей пециломикозной инфекции и у 105 больных с клинически выраженным пециломикозом.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Б-ая М, 22 года.

После обработки кожи мякоти безымянного пальца спиртом сделан прокол кожи, после чего произведен забор крови в количестве 0.02 мл крови в стерильный капилляр который поместили в пробирку со стерильным физиологическим раствором, подкрашенным генциановым фиолетовым в количестве 4 мл. После 5-минутного прокрашивания при комнатной температуре содержимое пробирки перемешивали стеклянной палочкой и вносили в счетную камеру Горяева.

Счетную камеру Горяева оставляли в горизонтальном положении на 1 мин для осаждения сферул гриба и эритроцитов. Прямой количественный подсчет зрелых сферул гриба, окрашенных в багрово-фиолетовый цвет, производили по всей сетке в 100 больших квадратах, начиная с левого верхнего угла сетки. Для лучшего контрастирования затемняли поле зрения, опуская конденсор и прикрывая диафрагму. Подсчету подлежали зрелые сферулы гриба размерами от 4-5 мкм до 28-29 мкм в диаметре. По всей поверхности 100 больших квадратов было выявлено 25 зрелых сферул гриба. Согласно формуле подсчета:



где Х - число зрелых сферул гриба 1 мкл крови;

С - число зрелых сферул гриба в 100 больших квадратах.

Это составило 12.500 зрелых сферул гриба в 1 мкл крови при норме 1000-6000.

Анамнестически установлено, что у больной в течение полугода после перенесенного недомогания с кратковременным повышением температуры тела до 38.С, спустя несколько дней появились высыпания волдырного типа и отек типа Квинке в области лица и голосовых связок. Больная по скорой помощи была доставлена в реанимационное отделение, где ее вывели из острого состояния путем парентерального введения глюкокортикостероидов и антиаллергических препаратов. При выписке из стационара сохранялся зуд кожи, после расчесов кожи появлялись волдырные высыпания, отмечала слабость, утомляемость, потливость, в связи с чем была госпитализирована в аллергологическое отделение ГКБ№7. При аллерго-иммунологическом обследовании у больной были обнаружены низкие уровни общего Ig-E (13 МЕ/мл) и Ig-G (8.1 г/л). С использованием PACT наличие специфических Ig-E антител к различным видам общеизвестных экзоаллергенов выявлено не было.

Клинически у больной установлена хроническая идиопатическая крапивница, отек Квинке средней тяжести течения.

Использование предлагаемого способа экспресс-диагностики пециломикоза позволило выявить сферулы гриба рода Paecilomyces и активацию пециломикозной инфекции в крови (12.000 сферул гриба в 1 мкл крови при норме 1000-6000).

Клинический диагноз: хроническая рецидивирующая крапивница, отек Квинке средней тяжести течения пециломикозной этиологии.

Больной была проведена комплексная этиотропная терапия с включением флюконазола (Форкан) 200 мг-100 мл, в/в капельно, с интервалом 48 часов №5. На вторые сутки от начала лечения состояние больной нормализовалось, исчезли слабость, недомогание, потливость.

Зуд кожи и волдырные высыпания прекратились на 4-е сутки лечения и не возобновлялись за весь период наблюдения (5 мес). Контрольное обследование больной после проведенного лечения показало наличие в крови 2000 зрелых сферул гриба рода Paecilomyces (при норме 1000-6000). Культурально из крови больной был выявлен гриб Paecilomyces variotii Baenier (1907).

Пример 2. Б-й Х, 64 года.

После обработки кожи мякоти безымянного пальца спиртом сделан прокол кожи, после чего произведен забор крови в количестве 0.02 мл крови в стерильный капилляр который поместили в пробирку со стерильным физиологическим раствором, подкрашенным генциановым фиолетовым в количестве 4 мл. После 5-минутного прокрашивания при комнатной температуре содержимое пробирки перемешивали стеклянной палочкой и вносили в счетную камеру Горяева.

Счетную камеру Горяева оставляли в горизонтальном положении на 1 мин для осаждения сферул гриба и эритроцитов. Прямой количественный подсчет зрелых сферул гриба, окрашенных в багрово-фиолетовый цвет, производили по всей сетке в больших квадратах, начиная с левого верхнего угла сетки. Для лучшего контрастирования затемняли поле зрения, опуская конденсор и прикрывая диафрагму. Подсчету подлежали зрелые сферулы гриба размерами от 4-5 мкм до 28-29 мкм в диаметре. По всей поверхности 100 больших квадратов было выявлено 56 зрелых сферул гриба. Согласно формуле подсчета:



где Х - число зрелых сферул гриба 1 мкл крови;

С - число зрелых сферул гриба в 100 больших квадратах.

Это составило 28.000 зрелых сферул гриба в 1 мкл крови при норме 1000-6000.

Анамнестически установлено, что у больного в течение полутора лет, после перенесенной ОРВИ спустя неделю появились приступы удушья, преимущественно в вечернее время.

Аллергологический анамнез отрицательный: аллергические заболевания в роду не отмечались, связь возникновения приступов удушья с воздействием внешних факторов отрицалась. При аллерго-иммунологическом обследовании уровень общего Ig-E составил 141 МЕ/мл. С использованием PACT специфические антитела к различным видам общеизвестных экзоаллергенов не были выявлены. В гемограмме умеренная эозинофилия - 12%. Анализ мочи без патологии. Функция внешнего дыхания - обьем форсированного выдоха за 1 секунду составил 61%. После вдыхания аэрозоля бронхолитика - 73%, что показало прирост показателя +22%.

Клинически установлена бронхиальная астма эндогенная форма средней степени тяжести. Использование предлагаемого способа экспресс диагностики пециломикоза позволило выявить наличие сферул гриба рода Paecilomyces и установить активацию пециломикозной инфекции (28000 зрелых сферул гриба в 1 мкл крови при норме 1000-6000). Больному проведено комплексное этиотропное лечение в включением тербинафина (тербифин) 250 мг по 1 таблетке 2 раза вдень в течение 7 дней, далее по 1 таблетке в день в течение 14 дней.

Приступы удушья прекратились на третьи сутки от начала лечения. Свистящие хрипы в легких полностью исчезли к концу первой недели. Количество зрелых сферул гриба к окончанию лечения составило 4000 в 1 мкл крови. Ремиссия больше года (срок наблюдения).

Культурально из крови больного был выделен гриб Paecilomyces variotii Baenier (1907).

Положительный эффект предлагаемого способа экспресс-диагностики пециломикоза заключается в том, что путем помещения образца крови в стерильный физиологический раствор, подкрашенный генциановым фиолетовым из расчета 10 мг на 100 мл раствора, происходит окраска полисахаридного компонента оболочек сферул гриба в багрово-фиолетовый цвет, что выделяет их среди эритроцитов. Выявление сферул гриба и их прямой подсчет в камере Горяева, исходя из разведения крови (200), числа сосчитанных квадратов (100) и объема большого квадрата (1/250), что позволяет дифференцировать пецилоносительство от клинически выраженного пециломикоза и своевременно оказать этиотропное и патогенетическое лечение.

При сравнении времени, затраченного на диагностику пециломикоза, с использованием предлагаемого способа с данными других авторов (табл. 1) видно преимущество предлагаемого нами метода.

Этот метод прост в исполнении и позволяет в течение 15 минут определять наличие пециломикозной инфекции в крови, разграничивая пецилоносительство от клинически выраженного пециломикоза, что дает возможность перейти к обоснованной этиотропной терапии.

Таблица 1.

Сравнительные данные диагностики пециломикоза по известному и предлагаемому способу. 
Время, затраченное на диагностику пециломикоза с использованием известного способа. Время, затраченное на диагностику пециломикоза с использованием предлагаемого способа. 
5-14 дней. 15-минут. 


Таблица 2.

Данные количественного подсчета зрелых сферул гриба рода Paecilomyces в образцах крови практически здоровых лиц и у больных с различными вариантами клинической манифестации пециломикоза. 
№ Варианты клинической манифестации пециломикоза Число наблюдений Количественное содержание зрелых сферул в 1 мкл крови 
1 Носительство 24 1000-6000 
2 Бронхиальная астма 80 10.000-28.500 
3 Пузырный дерматоз 9 30.000-55.000 
4 Хроническая рецидивирующая крапивница, отек Квинке 16 12.000-26.000 


Литература

1. Г.И.Дрынов. Терапия аллергических заболеваний. - М., 2004, стр 349

2. Ахунова А.М. Бронхиальная астма при пециломикозе (клиническая, аллерго-иммунологическая и патоморфологическая характеристика) / Автореф. дис. на соиск. ученой степени доктора мед. наук. - М., 1993.

3. Ахунова A.M. Трансформация сапрофитной мицелиальной формы гриба Paecilomyces varioti в тканевую паразитическую форму и ее морфологическая характеристика. // Мед.паразитол. - 1992. - №3. - С.53-55.

4. Uys C.J., Don P.A., Schrire V., Barnard C.N. Endocarditis following cardiac surgery due to the fungus Paecilomyces. // S.Afr. Med. J. - 1963. - Vol.37. - P.1267-1280.

5. Samson R.A. Paecilomyces and some allied hyphomycetes. Studies in mycology. - 1974. - N:6. - C.223-226.




ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


Способ диагностики пециломикоза путем помещения препарата крови в среду и проведение микроскопирования, отличающийся тем, что в качестве среды используют физиологический раствор, подкрашенный генциановым фиолетовым, после чего по окрашиванию зрелых сферул гриба рода Paecilomyces в багрово-фиолетовый цвет, имеющих двухконтурную капсулу с заключенными в нее эндоспорами размерами от 4-5 до 28-29 мкм, производят их количественное определение исходя из объема квадратов и разведения крови в счетной камере Горяева и диагностируют пециломикозную инфекцию.