СПОСОБ РАННЕЙ НЕИНВАЗИВНОЙ ДИАГНОСТИКИ ПРОЦЕССОВ РЕМОДЕЛИНГА БРОНХОВ ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНИ ЛЕГКИХ (ХОБЛ) У МУЖЧИН

СПОСОБ РАННЕЙ НЕИНВАЗИВНОЙ ДИАГНОСТИКИ ПРОЦЕССОВ РЕМОДЕЛИНГА БРОНХОВ ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНИ ЛЕГКИХ (ХОБЛ) У МУЖЧИН


RU (11) 2285264 (13) C2

(51) МПК
G01N 33/68 (2006.01)
G01N 33/53 (2006.01) 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 26.07.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(14) Дата публикации: 2006.10.10 
(21) Регистрационный номер заявки: 2004138916/15 
(22) Дата подачи заявки: 2004.12.30 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2004.12.30 
(43) Дата публикации заявки: 2006.06.10 
(45) Опубликовано: 2006.10.10 
(56) Аналоги изобретения: RU 2002111601 А, 20.11.2003 (прототип). RU 2240726 C1, 27.11.2004. RU 2220423 C1, 27.12.2003. SONG Y et al. A study on pathological changes and the potential role of growth factors in the airway wall remodeling of COPD rat models. Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi. 2001 May; 24(5), p.283-287, реф. VIGNOLA AM et al. Release of transforming growth
factor-beta (TGF-beta) and fibronectin by alveolar macrophages in airway diseases. Clin Exp Immunol. 1996 Oct, 106(1), p.114-119. ZIORA DI et al. Transforming growth factor beta (TGF-beta) in induced sputum in COPD and asthma patients. XVII International Congress of Allergology and Clinical Immunology - ICACI XVII Sydney, 2000, www.hogrefe de/Sydney. 2000/abstracts/W-176.html. Клиническая медицина, М., 1997, т.1, с.170-171.

(72) Имя изобретателя: Степанищева Лариса Александровна (RU); Теплова Светлана Николаевна (RU); Игнатова Галина Львовна (RU) 
(73) Имя патентообладателя: Степанищева Лариса Александровна (RU); Теплова Светлана Николаевна (RU); Игнатова Галина Львовна (RU) 
(98) Адрес для переписки: 454091, г.Челябинск, ул. Труда, 157, оф.28-5, Челябинский ЦНТИ, Т.Ф. Костик 

(54) СПОСОБ РАННЕЙ НЕИНВАЗИВНОЙ ДИАГНОСТИКИ ПРОЦЕССОВ РЕМОДЕЛИНГА БРОНХОВ ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНИ ЛЕГКИХ (ХОБЛ) У МУЖЧИН
Изобретение относится к медицине, в частности к области пульмонологии. Для осуществления ранней неинвазивной диагностики процессов ремоделинга бронхов при хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) у мужчин в слюне определяют концентрацию трансформирующего фактора роста - 1 (ТФР- 1) методом иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью набора стандартов для определения ТФР- 1. При увеличении значения показателя ТФР- 1 в 2,4 и более раз по сравнению с показателем, считающимся нормой для здорового пациента, диагностируют ремоделинг бронхов. При этом показатель, считающийся нормой для здорового пациента, величину ТФР- 1, равную 403,88±102,58 пг/мл, выбирают сравнивая с нормой для здорового пациента показателя ОФВ1 и результатов биопсии бронха. Использование способа позволяет повысить информативность, достоверность и безопасность диагностирования ремоделинга бронхов у мужчин, обеспечить возможность применения диагностики на ранних стадиях морфологических процессов в бронхах. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Изобретение относится к медицине, в частности к области пульмонологии, и может использоваться для ранней диагностики обструктивных нарушений, развивающихся на фоне прогрессирования воспаления и присоединения процессов ремоделинга в нижних дыхательных путях.

Процессы ремоделинга лежат в основе хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ). ХОБЛ представляет собой важнейшую социально-медицинскую проблему и по праву считается болезнью века (наряду с ишемической болезнью сердца) в связи с высокой распространенностью, неуклонным ростом заболеваемости и смертности и колоссальным экономическим ущербом, наносимым обществу.

Известен способ диагностики инициации и присоединения процессов морфологической перестройки бронхов (ремоделинг), описанный в «Глобальной стратегии диагностики, лечения и профилактики хронической обструктивной болезни легких». Пересмотр 2003 г., М.: Издательство «Атмосфера», 2003, с.39. Ремоделинг может быть достоверно выявлен только с помощью биопсии и последующей морфологической оценки срезов из стенки бронхов.

Недостатком данного способа является то, что для диагностики каждый раз необходимо брать на анализ срез из стенки бронхов (материал для исследования), что требует определенных технических навыков у медицинского персонала и причиняет боль, определенные неудобства для пациента, что в конечном итоге вызывает у него страх и своеобразную психологическую травму перед исследованием, в результате чего пациент просто отказывается от такого рода исследования, идет на него только в крайних случаях, когда болезнь уже запущена.

В настоящее время в клинической практике «золотым стандартом» диагностики процессов необратимой и обратимой обструкции бронхов остается способ функционального исследования функции внешнего дыхания (ФВД) с постбронходилятационным тестом, в частности оценка объема форсированного выдоха за 1 сек ОФВ1), описанный Чучалиным А.Г. в книге «Хронические обструктивные болезни легких», М., ЗАО «Издательство Бином», СПб., «Невский диалект», 1998, с.512.

Недостатком данного способа является то, что до диагностики необходимо отменить все лечебные препараты за сутки, способ громоздкий по времени для пациента, занимает 45 мин, диагностически значимые изменения ОФВ1 выявляются гораздо позже, чем морфологические процессы в бронхах, лежащие в основе ремоделинга.

Известен способ прогнозирования бронхиальной обструкции при хроническом бронхите, описанный в заявке Российской Федерации №2002111601, А 61 В 5/00, опубликованной 20.11.2003 г.. Способ заключается в том, что используют количественные лабораторные критерии риска развития нарушений бронхиальной проходимости, включающие определение уровня ИЛ-1 в сыворотке крови из локтевой вены, слюне, бронхоальвеолярной жидкости (БАЛЖ) (с помощью бронхиального лаважа получают смыв из бронхиального дерева) и оценку критериев риска для уровня ИЛ-1 у больных хроническим бронхитом без изменения ФВД (ОФВ1).

Данный способ прогнозирует бронхиальную обструкцию только при хроническом бронхите, когда сужение бронхов может быть из-за слизи и мокроты, и оно обратимо, то есть косвенно указывает на сужение просвета трахеобронхиального дерева, кроме того, недостатком данного способа является то, что для диагностики необходимо сдавать сразу три анализа, что занимает много времени для лабораторных анализов, при взятии на анализ крови присутствует потенциальный риск инфицирования как медперсонала, так и пациента, при взятии на анализ бронхоальвеолярной жидкости - страх перед исследованием у пациента.

Изобретение направлено на решение задач: диагностика ремоделинга бронхов при хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ), повышение безопасности способа. возможность применения на ранних стадиях морфологических процессов в бронхах. повышение информативности и достоверности диагностики (исключающие недостатки инвазивного характера взятия материала на исследование, у медперсонала и пациента риска инфицирования, у пациента - страха, боли).

Поставленные задачи решаются тем, что в заявляемом способе ранней неинвазивной диагностики процессов ремоделинга бронхов при хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) у мужчин у больного берут материал для исследования, которым является слюна, при этом согласно изобретению в слюне определяют концентрацию трансформирующего фактора роста - 1 (ТФР- 1), методом иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью набора стандартов для определения ТФР- 1 выбирают показатель, считающийся нормой для здорового пациента, величину ТФР- 1, равную 403,88±102,58 пг/мл, при увеличении показателя в 2, 4 и более раз диагностируют ремоделинг бронхов. При этом показатель, считающийся нормой для здорового пациента, величину ТФР- 1, равную 403,88±102,58 пг/мл, выбирают сравнивая с нормой для здорового пациента показателя ОФВ1 и результатами биопсии бронха.

Определение трансформирующего фактора роста - 1 (ТФР- 1) по слюне позволяет избавить пациента от страха, боли, риска инфицирования как медперсонала, так и пациента, а также дает возможность применения на ранних стадиях морфологических процессов в бронхах, повышает информативность и достоверность диагностики.

Заявляемый способ обладает новизной по сравнению с прототипом, отличается от него тем, что в слюне определяют концентрацию трансформирующего фактора роста - 1 (ТФР- 1), по величине которой определяют предрасположенность пациента к ремоделингу бронхов или непосредственно ремоделинг.

Заявителю не известны способы подтверждения процессов ремоделинга бронхов по трансформирующему фактору роста - 1 (ТФР- 1), определяемому по слюне, поэтому он считает, что заявленное решение соответствует критерию «изобретательский уровень».

Заявляемый способ лабораторного неинвазивного подтверждения процессов ремоделинга бронхов при хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) у мужчин по трансформирующему фактору роста - 1 (ТФР- 1), определяемому по слюне, может найти широкое применение в медицине, а именно в пульмонологии, поэтому соответствует критерию «промышленная применимость».

В патогенезе развития ремоделинга активное участие принимает трансформирующий фактор роста (ТФР- 1).

ТФР- 1 описан в 1978 г. (без количественных показателей). Фактор существует в трех изоформах. Его продуцируют большое количество клеток (макрофаги, стромальные клетки) в неактивной форме. Активация происходит с помощью протеиназ: плазмина, катепсина, образующихся при воспалении. При воздействии ТРФ- 1 на иммунную систему преобладают ингибирующие эффекты. Фактор подавляет гемопоэз, синтез воспалительных цитокинов, ответ лимфоцитов на ИЛ-2, 4, 7, формирование цитотоксических NK-клеток и Т- клеток. Вместе с тем он вызывает переключение изотипов иммуноглобулинов на JgA и совместно с ИЛ-2 десятикратно повышает синтез JgA. тем самым способствуя защите слизистых оболочек. ТФР- 1 усиливает синтез белков межклеточного матрикса, коллагена, стимулирует пролиферацию фибробластов, активирует нейтрофилы, способствует новообразованию соединительной ткани и сосудов, непосредственно инициирует процессы гистоморфологической перестройки бронхов обструктивного характера. Следовательно, изменение структуры бронхов происходит гораздо раньше, чем изменение функциональных показателей функции внешнего дыхания. В стенках органов дыхания имеется хорошо выраженный аппарат иммунной защиты. Это скопления лимфоидной ткани в слизистой оболочке гортани, трахеи и бронхов, а также рассеянные в слизистой оболочке довольно многочисленные клетки лимфоидного ряда. получившие название лимфоидной ткани, ассоциированной с бронхами или БАЛТ. Мукозальные эпителиоциты БАЛТ при активации усиливают секрецию цитокинов, ингибиторов провоспалительных агентов, молекул главного комплекса гистосовместимости и межклеточных взаимодействий. Список цитокинов, секретируемых этими клетками, включает интерлейкины (ИЛ) 1 , 1 , 6, 7, 10, 15, ФНО, ФРН, ТФР- 1, -2, -3- , ИЛ-7, хемокины. Данные цитокины, за исключением ТФР- 1, в большей степени участвуют в активизации воспалительного процесса в респираторном тракте, и только ТФР- 1, являясь фиброгенным цитокином, стимулирует пролиферацию фибробластов и изменение структуры стенки бронха, его ремоделирование. Это морфологическая перестройка в стенке бронха приводит к появлению частично обратимой или необратимой обструкции дыхательных путей, что лежит в основе патогенеза ХОБЛ.

Учитывая данные литературы о продукции ТФР- 1 мукозальными эпителиоцитами, клетками бронхоассоциированной лимфоидной ткани, а также материалы о патогенетическом значении данного фактора в ремоделинге бронхов, в отличие от других цитокинов, мы предприняли изучение уровня ТФР- 1 в слюне у мужчин с ХБ и ХОБЛ с целью раннего выявления подъема уровня трансформирующего фактора роста в качестве маркера и инициатора ремоделинга.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. У больного ХОБЛ утром натощак берут слюну. В слюне определяют концентрацию ТФР- 1 (пг/мл). Полученные результаты сравнивают с показателем нормы, которым считают величину ТФР- 1, равную 403,88±102,58 пг/мл, увеличения в 2-2,5 раза ТФР- 1 в слюне пациента говорят о необратимой обструкции, о ремоделинге бронхов.

Диагностическая эффективность предлагаемого способа была изучена у 59 мужчин 40-62 лет, из них с ХБ - 18 пациентов, у 31 установлен диагноз ХОБЛ. Контрольную группу составили 10 здоровых мужчин в возрасте 35-60 лет. Диагноз ХВ и ХОБЛ устанавливали по данным анамнеза, жалоб, данных объективного исследования, результатам лабораторного, функционального, рентгенологического исследовании.

Слюну собирали утром натощак, через 10 минут после ополаскивания ротовой полости дистиллированной водой.

ТФР- 1 (пг/мл) определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием набора стандартов (производство BioSO u RCE Бельгия).

Стандарты и образцы сначала разводят буфером, подкисленным HCl, а затем нейтрализованным NaOH. После этого нейтрализованные стандарты и образцы добавляются в лунки, покрытые антителами. После первой инкубации неприкрепленный материал удаляется промыванием разведенным моющим раствором. Затем мышиные Мав анти-ТФР- 1 антитела, биотинилированные анти-мышиные IgG антитела и стрептавидин - POD энзим комплекс подвергается инкубации. Образуется иммуно-энзим сэндвич-комплекс. Неприкрепленный конъюгат удаляется промыванием. Затем добавляется субстрат-раствор. Цветная реакция прекращается стоп-раствором и читается при 450 нм. Интенсивность окрашивания пропорциональна концентрации ТФР- 1 в образце.

Параллельно с анализом слюны на концентрацию ТФР- 1 (для определения величины ТФР- 1, считающийся нормой для здорового пациента), определяли ОФВ1 и анализ биопсии бронха (таблица 1, таблица 2). Для исследования были представлены четыре группы: контрольная - здоровые, больные с хроническим бронхитом (ХБ). больные с хронической обструктивной болезнью легких 1 степени (ХОБЛ 1 ст.). больные с хронической обструктивной болезнью легких 2 степени (ХОБЛ 2 ст.).

Показатель, считающийся нормой для здорового пациента, величину ТФР- 1, равную 403,88±102,58 пг/мл, выбирали с учетом анализа данных таблицы 1 и таблицы 2.

В контрольной группе из здоровых пациентов содержание ТФР- 1 в слюне составило 403,88±102,58 (пг/мл).

Изменение ТФР- 1 в слюне и ОФВ 1 у здоровых и больных

Таблица 1 
Диагноз ТФР- 1 (пг/мл) р * ОФВ1-% R** 
Здоровые 403,88±102,58 0,05 95,1±1,05 - 
ХБ 464,15±107,94 0,10 91,2±1,02 -0,59 
ХОБЛ 1 ст. 1129,22±165,84 0,05 79,3±0,79 -0,64 
ХОБЛ 2 ст. 1149±189,13 0,05 62,3±0,62 -0,71 
*р - вероятность

**r - коэффициент корреляции ТФР- 1 и ОФВ 1. 


Как видно из таблицы 1, у больных с ХОБЛ 1 и 2 стадиях значение ТФР- превышает таковой показатель у пациентов с ХБ и тем более у здоровых в 2,4 и более раз. Коэффициент корреляции ТФР- 1 и ОФВ1 при ХБ составил -0,59, при ХОБЛ 1 ст. -0,64, при ХОБЛ 2 ст. -0,71. Таким образом, чем выше значение ТФР- 1 в слюне, тем ниже показатели ОФВ1.

Пример №1

Пациент В., 56 лет, работает шлифовщиком на крупном промышленном предприятии, курит 31 год по 15-20 сигарет в день, страдает хроническим бронхитом более 3-х лет, отмечает кашель со слизистой мокротой по утрам, одышку при интенсивной физической нагрузке. При обследовании: правильного телосложения, кожа чистая, лимфоузлы не увеличены. В легких - при перкуссии легочной звук с коробочным оттенком, при аускультации - жесткое дыхание, единичные сухие хрипы. ЧД - 18. Тоны сердца ясные, ритмичные, ЧСС - 66 в 1 минуту. АД - 135/90 мм рт. ст. Живот мягкий, безболезненный. Печень не выступает из-под реберной дуги. Физиологические отправления в норме.

ПСВ-426, ФВД: ОФВ1=2,69 л (73%), ФЖЕЛ=2,72 л (74%), ОФВ1/ФЖЕЛ=100%. Показатель ТФР- 1 в слюне составил 1125,92 пг/мл. Заключительный диагноз: Хроническая обструктивная болезнь легких, 1 стадия.

Таким образом, наличие высоких концентраций ТФР- 1 в слюне соответствует ремоделингу бронхов, что подтверждено данными изменением ОФВ1.

АД - артериальное давление;

ПСВ - пиковая скорость выдоха;

ЧД - число дыхательных движений в 1 мин.;

ЧСС - число сердечных сокращений в 1 мин:

ФВД - функции внешнего дыхания;

ФЖЕЛ - форсированная жизненная емкость легких

Пример №2

Пациент Д., 57 лет, работает наладчиком на крупном промышленном предприятии, курит 40 лет по 30 сигарет в день, страдает хроническим бронхитом 2 года, ежегодно обострения более 3 раз в год. Ежедневно беспокоит кашель со слизистой мокротой. одышка при средней физической нагрузке. Объективно: состояние удовлетворительное, кожа чистая, лимфоузлы не увеличены. В легких дыхание жесткое, единичные, сухие хрипы, ЧД - 20 в 1 минуту. Тоны сердца ритмичные, ясные. ЧСС - 78 в 1 минуту. АД - 140/90 мм рт. ст. Живот мягкий, безболезненный. ПСВ - 386, ФВД: ОФВ1=2.48 л (66%), ФЖЕЛ=2,57 л (68%), ОФВ1/ФЖЕЛ=100%. Показатель ТФР- 1 в слюне составил 1397,28 пг/мл. Больному была проведена диагностическая бронхоскопия с биопсией. Протокол биопсии: признаки хронического фиброзного воспаления бронхов: увеличение числа плоских клеток, фрагменты многорядного цилиндрического эпителия: базальная мембрана фиброзирована с круглоклеточной инфильтрацией. Все слои стенки с фибропластической инфильтрацией: с участками фиброза. Отдельно расположены участки фибрина со скоплениями гранулоцитов. Заключительный диагноз: Хроническая обструктивная болезнь легких, 2 стадия.

Таким образом, наличие высоких концентраций ТФР- 1 в слюне соответствует ремоделингу бронхов, что подтверждено данными биопсии при бронхоскопии и изменением ОФВ1.

Пример №3

Пациент К., 59 лет, работает шлифовщиком на промышленном предприятии, курит 45 лет по 25 сигарет в день, страдает хроническим бронхитом 5 лет, ежегодно обострения более 2-3 раз в год. Ежедневно беспокоит кашель со слизистой мокротой, одышка при физической нагрузке. Объективно: состояние удовлетворительное, кожа чистая, лимфоузлы не увеличены. В легких дыхание жесткое, единичные, сухие хрипы. ЧД - 18 в 1 минуту. Тоны сердца ритмичные, ясные, ЧСС - 66 в 1 минуту. АД - 135/90 мм рт. ст. Живот мягкий, безболезненный. ПСВ - 375, ФВД: ОФВ1=2,78 л (82%), ФЖЕЛ=2,85 л (90%), ОФВ1/ФЖЕЛ=91%. Показатель ТФР- 1 в слюне составил 1227,13 пг/мл. Больному была проведена диагностическая бронхоскопия с биопсией. Протокол биопсии: Стенка бронха представлена фрагментами уплощенного эпителия с псевдоплоскоклеточной метаплазией слизистой оболочки. Базальная мембрана фиброзирована с круглоклеточной инфильтрацией; фрагменты с участками фибрози. Заключительный диагноз: Хроническая обструктивная болезнь легких, 2 стадия.

В данном клиническом случае у больного клинические признаки ХОБЛ; значительное повышение ТФР- 1 в слюне; выраженные фиброзные изменения в стенке бронхов; что свидетельствует о уже произошедшем ремоделинге бронхиального дерева. Вместе с тем нарушений вентиляции по ФВД нет. Следовательно, увеличение ТФР- 1 в слюне свидетельствует о гистоморфологических изменениях в стенке бронха и реагирует гораздо раньше, чем ОФВ1, при ХОБЛ. Изменения фиброгенного цитокина ТФР- 1 и данных ремоделинга бронхов представлены в таблице 2.

Изменения данных ТФР- 1 и биопсии бронхов у здоровых и больных



Заявляемый способ по сравнению с прототипом диагностирует ремоделинг, повышает безопасность диагностирования, обеспечивает возможность применения на ранних стадиях морфологических процессов в бронхах, повышает информативности и достоверности диагностики (исключая недостатки инвазивного характера взятия материала на исследование, у медперсонала и пациента риска инфицирования, у пациента - страха, боли).




ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


1. Способ ранней неинвазивной диагностики процессов ремоделинга бронхов при хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) у мужчин, заключающийся в том, что у больного берут материал для исследования, которым является слюна, отличающийся тем, что в слюне определяют концентрацию трансформирующего фактора роста - 1 (ТФР- 1) методом иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью набора стандартов для определения ТФР- 1, выбирают показатель, считающийся нормой для здорового пациента, величину ТФР- 1, равную (403,88±102,58) пг/мл, при увеличении показателя в 2,4 и более раз диагностируют ремоделинг бронхов.

2. Способ ранней неинвазивной диагностики процессов ремоделинга бронхов при хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) по п.1, отличающийся тем, что показатель, считающийся нормой для здорового пациента, величину ТФР- 1, равную (403,88±102,58) пг/мл, выбирают, сравнивая с нормой для здорового пациента показателя ОФВ1 и результатов биопсии бронха.