УВЕЛИЧЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ИНГАЛЯЦИОННОЙ ТЕРАПИИ С ПОМОЩЬЮ ДИОКСИДА УГЛЕРОДА

УВЕЛИЧЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ИНГАЛЯЦИОННОЙ ТЕРАПИИ С ПОМОЩЬЮ ДИОКСИДА УГЛЕРОДА


RU (11) 2270683 (13) C2

(51) МПК
A61K 33/08 (2006.01)
A61P 43/00 (2006.01) 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 26.07.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(14) Дата публикации: 2006.02.27 
(21) Регистрационный номер заявки: 2002117912/14 
(22) Дата подачи заявки: 2000.12.01 
(30) Приоритетные данные: 60/169,038 1999.12.04 US 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2000.12.01 
(43) Дата публикации заявки: 2004.02.10 
(45) Опубликовано: 2006.02.27 
(56) Аналоги изобретения: US 5049388, 17.09.1991. RU 2133744 C1, 27.07.1999. КОГАН А.Х. и др. Сравнительное исследование влияния диоксида углерода на генерацию активных форм кислорода лейкоцитами в норме и при бронхиальной астме. Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - М.: 1995, №3, с.34-40. GOLDRING et al. Respiratory adjustment to chronic alcalosis in
man. J. Clin. Inv. 47: 188-202. NEILSEN et al. Ventilation CO2 Production and CO2 exposure effecta in conscious, restrained CF-1 mice. Pharmacol. Toxicol. 72: 163-168 (1993). SCHLENCER E.H. et al. Ventilation and metabolism of the djungarian hamster (Photopus sungorus) and the albino mouse. Comp. Biochem. Physiol. 82A: 293-295 (1985).

(72) Имя изобретателя: УОЛДРЕП Дж Клиффорд (US); НАЙТ Дж Вернон (US); КОШКИНА Надежда (US) 
(73) Имя патентообладателя: РИСЕРЧ ДИВЕЛОПМЕНТ ФАУНДЕЙШН (US) 
(85) Дата соответствия ст.22/39 PCT: 2002.07.04 
(86) Номер и дата международной или региональной заявки: US 00/32637 (01.12.2000) 
(87) Номер и дата международной или региональной публикации: WO 01/39789 (07.06.2001) 
(98) Адрес для переписки: 129010, Москва, ул. Б.Спасская, 25, стр.3, ООО "Юридическая фирма Городисский и Партнеры", пат.пов. Г.Б. Егоровой 

(54) УВЕЛИЧЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ИНГАЛЯЦИОННОЙ ТЕРАПИИ С ПОМОЩЬЮ ДИОКСИДА УГЛЕРОДА
Изобретение относится к медицине, к фармакологии, пульмонологии и может быть использовано для увеличения эффективности ингаляционной терапии с помощью диоксида углерода. В дыхательные пути человека или животного вводят лекарственное средство в виде аэрозоля в воздушной смеси, содержащей приблизительно от 2,5% до приблизительно 10% газообразного диоксида углерода. Данное изобретение способствует доставке лекарственного средства непосредственно к зоне повреждения, что, в свою очередь, способствует увеличению его концентрации в этой зоне и обеспечению лечебного эффекта минимальными дозами препарата. 23 з.п. ф-лы, 13 ил., 3 табл.




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Область изобретения

Настоящее изобретение относится в основном к областям фармакологии и доставки лекарственных средств. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу применения газообразного диоксида углерода для увеличения осаждения в легких вводимого в виде аэрозоля лекарственного средства в процессе ингаляционной терапии.

Описание предыдущего уровня техники 

Обработка аэрозолем, содержащим липосомы малого размера, состоит в том, что жирорастворимые или водорастворимые противораковые лекарственные средства включают в липосомы, которые вводят из водной дисперсии с помощью струйного распылителя (см. патент США №5049388). Полученные при распылении аэрозоли, частицы которых имеют среднемассовый аэродинамический диаметр 1-3 мкм, обеспечивают целевую доставку на поверхность дыхательных путей. Впоследствии осажденные липосомы локально высвобождают лекарственное средство в легких, или в кровоток с доставкой к ткани, находящейся вне легких.

Если лекарственное средство является жирорастворимым, оно будет связано с липидной молекулой способом, специфичным для использующегося липида, применяемого противоракового средства, и, возможно, оно может быть дополнительно модифицировано с помощью различных растворимых компонентов, которые могут быть включены в суспендирующую водную среду. Такие растворимые компоненты могут включать забуферивающие соли и, возможно, инозитол для увеличения синтеза и секреции поверхностно-активного фосфолипида в легочной ткани, а также для минимизации дыхательной недостаточности, которая уже существует, или которая может возникнуть при лечении аэрозолем. 

Если лекарственное средство является водорастворимым, оно может быть включено с помощью соответствующих методов в водные полости, которые существуют в концентрических пространствах между липидными бислоями (ламеллами) многослойной липосомы. Могут быть получены однослойные липосомы; однако они имеют более низкую способность удерживать жирорастворимые или водорастворимые лекарственные средства, так как удерживание ограничено одной центральной полостью. Водные капельки аэрозоля могут содержать одну или несколько липосом, включающих лекарственное средство. Кроме того, в обработку аэрозолем, содержащем липосомы, можно также включить более чем одно лекарственное средство, либо путем смешивания различных, содержащих лекарство липосом, либо путем применения липосом, в которых лекарственные средства объединены и включены вместе в липосомы.

В процессе распыления липосомы разбиваются до размеров, обеспечивающих легкое испускание из сопла распылителя. Липосомы размером до нескольких микрон в диаметре обычно разбиваются с получением частиц диаметром менее 500 нм, причем они могут быть и значительно меньше, что зависит от эксплуатационных характеристик распыляющего устройства и других переменных. Перераспределение водорастворимых лекарств, содержащихся в липосомах, приводит к высвобождению существенных количеств водорастворимого соединения, возможно 50 процентов. Это не является противопоказанием к их применению, но означает, что вводят две формы лекарственного препарата, и эффект включает терапевтический эффект от обеих форм, получаемый при введении каждой формы отдельно. Много других деталей лечения липосомными аэрозолями описано в патенте США №5049388.

Как правило, основной целью ингаляционной терапии является местная доставка аэрозольных частиц фармацевтических препаратов в центральные дыхательные пути и к периферическим участкам респираторного тракта. Однако осаждаемая фракция вдыхаемых частиц, даже при оптимальном диапазоне размеров, составляющих 1-2 мкм для среднемассового аэродинамического диаметра, составляет только приблизительно 20%. Осаждение в легких вдыхаемых аэрозолей в значительной степени зависит от размера частиц, гигроскопических свойств и геометрии дыхательных путей (1, 2). Характер дыхания также является важным параметром, который определяет способ осаждения вдыхаемых частиц (1, 2).

В частности, задержка дыхания заметным образом увеличивает осаждение в легких вследствие увеличения времени пребывания частиц в легком. Она обеспечивает увеличение периода гравитационного осаждения, происходящего в особенности в малых периферических дыхательных путях, и гарантирующего, что водные частицы могут полностью уравновешиваться в условиях почти 100% влажности и достигать своего максимального размера, что в дальнейшем увеличивает их осаждение (1, 2). С помощью компьютерного моделирования показано, что тридцатисекундная процедура задержки дыхания у людей может увеличить осажденную фракцию в 3,2 раза. Физиологической причиной данного эффекта является увеличение поглощения частиц при глубоком вдыхании, при котором вдыхаемый объем может быть в 8 раз выше объема, вдыхаемого при основном дыхании. Увеличение дыхательного объема приводит к проникновению частиц в самые дальние уголки легких, где диаметры дыхательных путей являются наименьшими, и, следовательно, осаждение благодаря силе тяжести и максимальному размеру частиц происходит с максимальной эффективностью.

Исходя из данного физиологического свойства, можно заключить, что непосредственное использование факторов, которые могут увеличивать объем вдыхаемого воздуха (содержащего аэрозольные частицы), будет впоследствии значительно увеличивать фракцию, осаждавшуюся в центральных дыхательных путях, и, даже в большей степени, в периферических участках легких. Диоксид углерода (СО2) является наиболее важным природным регулятором дыхания. Диоксид углерода свободно диффундирует из тканей в кровь в соответствии с существующим градиентом давления. При повышении уровней диоксида углерода в крови он легко диффундирует в спинно-мозговую жидкость, где превращается в НСО3 - и Н+. Хеморецепторы центральной нервной системы на вентральной поверхности спинного мозга отвечают на повышение концентрации Н+ в CSF и вызывают компенсаторное увеличение газообмена (частоты дыхания и дыхательного объема).

Исследователи используют ингаляцию диоксидом углерода для регулирования дыхания у тестируемых животных и людей. Вдыхание 5% диоксида углерода вызывает увеличение дыхательного объема до 192% (3). Данное увеличение происходит быстро и достигает устойчивого плато на протяжении всего воздействия (4). Когда воздействие диоксида углерода прекращается, изменения дыхания возвращаются к исходному уровню в течение нескольких минут (4). Подобным образом, вдыхание людьми 5% диоксида углерода приводит к 3-кратному увеличению минутного объема (5). Вдыхание 5% или 7,5% диоксида углерода нормальными людьми в течение двух минут приводит к увеличению частоты дыхания на 6,7% и 19% соответственно, а также увеличению дыхательного объема на 31% и 52% соответственно, так, что минутный объем увеличивается на 34% и 75% соответственно (6). Более длительные воздействия указанных концентраций продуцируют еще более сильные ответы (5).

Аналоги камптотецина и таксаны представляют собой химические агенты, которые в настоящее время разрабатываются в качестве химиотерапевтических агентов (21, 26). Противораковые лекарственные средства, паклитаксел (РТХ) и различные производные камптотецина (СРТ), являются клинически активными при лечении ряда человеческих опухолей, включая рак легких. Клинические испытания данных лекарственных средств демонстрируют благоприятные результаты при использовании их в виде отдельных агентов, или в сочетании друг с другом (21). Данные лекарства принимают системно посредством перорального или внутривенного способов введения; для паклитаксела наиболее эффективным способом является длительная внутривенная инфузия (22, 24), тогда как доказано, что для липофильных родственных соединений камптотецина наиболее эффективным является пероральное введение.

Развитие токсических побочных эффектов часто является основным ограничением таких терапевтических режимов. Некоторые подкожные ксенотрансплантанты рака человека у голых мышей (23) и в экспериментальных легочных метастазах мышей (6) успешно лечили липосомальными композициями камптотецина и 9-нитрокамптотецина (9NC), вводимыми аэрозольным способом, что является альтернативным методом лечения. Исследования фармакокинетики камптотецина на мышах показали, что вдыхание липосомального камптотецина обеспечивает значительные уровни лекарственного средства в легких и других органах, которые быстро снижаются после прекращения аэрозольной доставки (17). Несмотря на достижение указанных уровней, системы аэрозольной доставки являются эффективными только на 15-20% в отношении осаждения в легких (29, 30); таким образом, повышение осаждения в легких может быть полезным.

При использовании указанных системных способов доставки лекарственных средств некоторое количество лекарства выходит из кровотока и локализуется в тканях органов дыхания, однако легкие не являются основными органами для осаждения лекарства. Применение обычных липосом в качестве носителей для указанных лекарственных средств не улучшает осаждения в легких лекарств, вводимых с помощью традиционных системных способов (11, 27). Распыление является очень эффективным способом целевой доставки лекарственного средства, например камптотецина, к дыхательным путям (17). Собак со спонтанно растущими первичными и метастатическими опухолями легких успешно лечили с помощью новых препаративных форм доксорубицина и РТХ, доставляемых посредством аэрозолизации (16). Однако в данных случаях аэрозоли получают, используя обычный воздух.

Доставку генов к различным тканям осуществляют с использованием как вирусных, так и невирусных векторов. Хотя применение невирусных векторов позволяет избежать иммуногенного ответа, связанного с вирусными векторами, невирусные векторы, такие как катионные липиды и поликатионные полимеры, как правило, не были связаны с высокими уровнями экспрессии генов, характерной для вирусных векторов. Однако полиэтиленимин (PEI), катионный полимер, является эффективным как в культуре ткани, так и in vivo (36). Способность к протонированию каждого третьего азота придает полиэтиленимину высокую буферную емкость. Полиэтиленимин может эффективно транспортировать ДНК к ядрам (37) и защищать ДНК от расщепления ДНКазами (36). Было показано, что как линейные, так и разветвленные формы полиэтиленимина обеспечивают высокие уровни экспрессии трансгена в различных тканях, таких как легкие, мозг и почки (39-41). Полиэтиленимин также используют для эффективной доставки ДНК к опухолям in vivo (42).

Аэрозольная доставка является неинвазивным способом доставки нужных генов к легким и потенциально может использоваться для лечения заболеваний, таких как рак легкого и кистозный фиброз. Однако уровни экспрессии трансгена не являются очень высокими из-за того, что в некоторых случаях в процессе распыления утрачивается жизнеспособность ДНК (43). PEI может защищать ДНК в процессе распыления (44) и может обеспечивать в легких более высокие уровни трансфекции, чем большинство других катионных липидов, подвергавшихся испытаниям (44, 45). Кроме того, PEI-опосредованная трансфекция является устойчивой к ингибированию легочными поверхностно-активными веществами (46). 

Повышения эффективности осаждения лекарственного средства в дыхательных путях посредством ингаляционного способа введения достигают несколькими способами: 1) путем изменения концентрации лекарственного средства в препаративной форме, используемой для введения посредством аэрозоля (31); 2) путем применения более эффективных типов распылителей (32); 3) путем увеличения продолжительности лечения; или 4) путем изменения моделей дыхания (4). Как ранее установлено, диоксид углерода является природным модулятором дыхания. Вдыхание воздуха, содержащего низкие концентрации СО 2 (приблизительно от 3-7%), вызывает подобные изменения моделей дыхания и хорошо переносится (13, 6). Различия в моделях дыхания при вдыхании 5% СО2 в воздухе и выполнении человеком умеренных физических упражнений не наблюдаются (32). Такое воздействие 5% СО2 в воздухе на человека может быть получено при использовании аэрозольного лечения. Так, применение для распылителя воздуха, обогащенного СО2, как модулятора ингаляционной терапии, может приводить к более эффективной легочной доставке химиотерапевтических агентов.

В предыдущем уровне техники существует дефицит средств, увеличивающих осаждения в легких лекарственного средства, вводимого в виде аэрозоля в процессе ингаляционной терапии. Настоящее изобретение удовлетворяет данную многолетнюю потребность, существующую в данной области.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение предоставляет способ увеличения осаждения в дыхательных путях человека или животного лекарственного средства, вводимого в виде аэрозоля, включающий стадию введения упомянутого лекарственного средства в виде аэрозоля в воздушной смеси, содержащей приблизительно до 10% газообразного диоксида углерода. В данном описании используются концентрации диоксида углерода 2,5%, 5% и 7,5%. Аэрозоль может быть введен в течение от 1 до 30 минут, или даже в течение более длительного времени. Вводимое лекарственное средство может представлять собой растворимое лекарственное средство, нерастворимое лекарственное средство или терапевтическую композицию, например олигонуклеотид, ген, пептид или белок, который можно растворить в растворе и непосредственно вводить в виде аэрозоля с помощью струйного распылителя, или перед введением в виде аэрозоля его можно включить в носитель, такой как липосомы, полимеры с замедленным высвобождением или поликатионные полимеры.

Другие аспекты, признаки и преимущества настоящего изобретения станут понятными из следующего описания представленных предпочтительных воплощений данного изобретения, приведенного с целью раскрытия.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ 

Для того, чтобы материал, в котором приведенные выше признаки, преимущества и цели изобретения, а также другие аспекты, стали бы понятными, достижимыми и могли бы быть понятны в деталях, более конкретное описание изобретения, кратко изложенное выше, может быть приведено со ссылкой на определенные его воплощения, которые иллюстрируются в прилагаемых чертежах. Данные чертежи составляют часть описания. Следует отметить, однако, что прилагающиеся чертежи иллюстрируют предпочтительные воплощения данного изобретения и, следовательно, не могут рассматриваться как ограничивающие их объем.

На фигуре 1 показано тканевое распределение камптотецина после 30 мин воздействия липосомального аэрозоля, полученного с использованием нормального воздуха (сплошные), или с использованием воздуха, содержащего 5% СО2 (заштрихованные). В конце обработки (30 мин) производят резекцию органов у трех мышей из каждой группы и определяют содержание лекарственного средства методом ВЭЖХ. Рассчитывают средние значения со стандартным отклонением (SD). Значения Р для воздуха, содержащего 5% СО2, по сравнению с нормальным воздухом составляют 0,02, 0,13, 0,04, 0,04, 0,03 и 0,01 для легких, печени, селезенки, почек, крови и мозга соответственно (двухсторонний критерий Стьюдента).

На фигуре 2 показана кривая зависимости концентрация-время, полученная на легких для СРТ-липосом, вводимых в течение 30 мин в виде аэрозоля, полученного с использованием нормального воздуха (о), или воздуха, содержащего 5% СО2 (). Для каждой временной точки производят резекцию легких от трех мышей и определяют содержание лекарственного средства методом ВЭЖХ. Рассчитывают средние значения с SD.

На фигуре 3 показана кривая зависимости концентрация-время, полученная на легких для РТХ-липосом, вводимых в течение 30 мин в виде аэрозоля, полученного с использованием нормального воздуха (о), или воздуха, содержащего 5% СО2 (). Для каждой временной точки легкие от трех мышей объединяют и определяют содержание лекарства методом ВЭЖХ. Каждый эксперимент повторяют три раза и рассчитывают средние значения с SD.

На фигуре 4 демонстрируется сравнение тканевых уровней паклитаксела в легких мышей, подвергавшихся воздействию аэрозолей, содержащих различные липосомальные композиции. Эквивалентные уровни обработки паклитакселем достигаются при использовании аэрозоля, полученного с применением 5% СО2 в воздухе, содержащего стерически стабилизированные паклитаксел-содержащие липосомы, полученные из димиристилфосфоэтаноламинполи(этиленгликоля) 2000, а также при применении DLPC.

На фигуре 5 демонстрируется сравнение экспрессии CAT в легких под действием PEI-ДНК аэрозоля, полученного с использованием воздуха, или воздуха, содержащего 5% СО 2. Один миллиграмм CAT плазмиды подвергают комплексованию с PEI при соотношении N:P, составляющем 10:1, и полученный комплекс вводят мышам в виде аэрозоля в течение 30 мин. Спустя 24 часа легкие собирают и проводят CAT анализ по описанной методике. Данные приводят в виде средних значений ± SD (n=6 мышей на группу, Р=0,001).

На фигуре 6 демонстрируется влияние процентного содержания СО2 на эффективность переноса PEI-ДНК к легким посредством аэрозоля. Используют различные процентные концентрации СО2 в воздухе при фиксированном количестве CAT плазмиды. Комплексы вводят в виде аэрозолей, используя 0%, 2,5%, 5%, 10% диоксида углерода и контроль. Мышей умерщвляют, собирают легкие и проводят CAT анализ. Данные выражают в виде средних значений ± SD.

На фигуре 7 демонстрируется, что экспрессия гена в легких, индуцированная PEI-ДНК аэрозолем, является дозозависимой. Увеличивающиеся дозы CAT плазмиды вводят в виде аэрозоля с использованием 5% CO2 в воздухе, при фиксированном соотношении N:P, равном 10:1. Наблюдается увеличение как общего количества доставляемой ДНК, так и концентрации доставляемого PEI-ДНК. Мышей умерщвляют через 24 ч, легкие собирают и анализируют Cat белок. Данные приводят как средние значения ± SD (n=5 мышей на группу).

На фигуре 8 демонстрируется влияние соотношения N:Р на эффективность переноса PEI-ДНК к легким в виде аэрозоля. Различные соотношения PEI-ДНК (N:P) используют с фиксированным количеством CAT плазмиды (2 мг). Комплекс вводят в виде аэрозоля, полученного с использованием 5% СО2 в воздухе. Через 24 часа мышей умерщвляют, собирают легкие и проводят CAT анализ. Данные представляют как средние значения ± SD (n=5 мышей на группу).

На фигуре 9 демонстрируется влияние соотношения N:P на экспрессию гена люциферазы в легких. Фиксированное количество люциферазкой плазмиды (2 мг) доставляют при различных соотношениях N:P. Комплексы вводят в виде аэрозоля, полученного с использованием 5% СО2 в воздухе. Через 24 часа после доставки аэрозоля мышей умерщвляют, собирают легкие и определяют люциферазную активность. Данные представляют как средние значения ± SD (n=5 мышей на группу).

На фигуре 10 показана экспрессия трансгена во времени после однократной обработки PEI-ДНК аэрозолем. На фигуре 10А мышей обрабатывают аэрозолем, содержащим 2 мг CAT плазмиды при соотношении N:P, равном 15:1, полученным с использованием 5% СО2 в воздухе. Мышей умерщвляют в разные временные точки, легкие собирают и сразу замораживают. CAT анализ проводят после последней временной точки. Данные приводят как средние значения ± SD (n=5 мышей на временную точку). На фигуре 10В показана устойчивая экспрессия CAT, полученная с использованием двух разных соотношений N:P. Обеим группам мышей (n=5 мышей на каждую временную точку на группу) вводят 2 мг CAT плазмиды при соотношении NPP 15:1 или 10:1, с использованием 5% СО2 в воздухе. Временные точки для соотношения 10:1 составляли 1, 2, 3 и 6 дней после воздействия аэрозоля, и для соотношения 15:1 составляли 1, 3, 7 и 10 дней после воздействия аэрозоля.

На фигуре 11 показано тканевое распределение трансгена после однократной обработки PEI-ДНК аэрозолем. Используют такие же группы мышей, как для фигуры 9 (из группы 10:1). Разные ткани собирают и немедленно замораживают. CAT белок анализируют после последней временной точки. Данные приводят как средние значения ± SD (n=5 мышей на временную точку). Уровни CAT в тканях, не относящихся к легким, в группе, обработанной аэрозолем, не отличаются от уровней, полученных для контрольных тканей (Р>0,1). 

На фигуре 12 демонстрируется гистологический анализ легких, обработанных PEI-ДНК аэрозолем. Получают комплекс двух миллиграммов CAT плазмиды и PEI при соотношении N:P, составляющем 15:1, и комплекс вводят пяти мышам в течение 30 мин в виде аэрозоля, полученного с использованием 5% СО2 в воздухе. Спустя 24 часа мышей умерщвляют, легкие собирают и фиксируют в формалине. Тонкие срезы окрашивают гематоксилином и эозином (Н&Е). Фигура 12А: бронхиол (контроль); Фигура 12В: бронхиол (обработанные). Увеличение 100×.

На фигуре 13 демонстрируется ингибирование метастаз в легких B16-F10 под действием обработки аэрозолем PEI-р53. Фигура 13А: Опухолевый индекс рассчитывают по формуле: опухолевый индекс = массы легких × средний размер для группы. Данные представляют как средние значения ± SD (n=10 мышей на группу). Фигура 13В: Представлены образцы легких от контрольных мышей, мышей, обработанных PEI-Lucand и PEI-р53 (n=10 мышей на группу). Легкие от группы, обработанной PEI (не показано), по форме, размеру и числу опухолевых очагов сходны с легкими, показанными для контрольной группы и группы, обработанной PEI-Luc. Данные получены от двух отдельных экспериментов. Фигура 13С: Массы легких мышей из разных групп. Данные представлены как средние значения ± SD (n=10 мышей на группу).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение предоставляет способ увеличения осаждения в дыхательных путях человека или животного лекарственного средства, вводимого в виде аэрозоля, который включает стадию введения указанного лекарственного средства в виде аэрозоля в воздушной смеси, содержащей приблизительно до 10% газообразного диоксида углерода. Предпочтительные концентрации газообразного диоксида углерода включают 2,5%, 5% и 7,5%. Аэрозоль может быть введен в течение от 1 до 30 минут, или даже в течение более длительного времени.

Настоящее изобретение направлено на аэрозольную доставку водорастворимого лекарственного средства. Такое лекарственное средство может быть непосредственно получено в виде водного или буферного раствора, который непосредственно используют для получения аэрозоля. Примеры водорастворимых лекарственных средств включают антибиотики, такие как тобрамицин и пентамидин; муколитики, такие как ацетилцистеин; бронхолитические средства, такие как альбутерол; парасимпатические агенты, такие как ипратропиум бромид; ферменты, такие как ДНКазы; а также антивирусные агенты, такие как рибавирин.

Альтернативно настоящее изобретение может использоваться для доставки нерастворимого лекарственного средства, которое перед аэрозольной доставкой присоединяют к носителю. Возможные носители включают липосомы, полимеры, обеспечивающие замедленное высвобождение, и поликатионные полимеры. Липосомы представляют собой особенно пригодный носитель для липофильных лекарственных средств, таких как амфотерицин В; нистатин; глюкокортикоиды; иммунодепрессанты, такие как CsA, FK506, рапамицин или микофенолат; и противораковые средства, такие как камптотецин, производные камптотецина и паклитаксел. Липосомы могут быть образованы из таких липидов, как фосфолипид дилауроилфосфатидилхолин (DLPC), или они могут представлять собой стерически стабилизированные липосомы, в состав которых входят модифицированные фосфолипиды, такие как димиристилфосфоэтаноламин-поли(этиленгликоль) 2000. Могут применяться полимеры, обеспечивающие замедленное высвобождение, такие как сополимер (молочной кислоты и гликолевой кислоты) (PLGA), или поликатионные полимеры, такие как полиэтиленимин (PEI).

Настоящее изобретение также может применяться для доставки терапевтических белков, терапевтических пептидов, ДНК генов, смысловых олигонуклеотидов, антисмысловых олигонуклеотидов и вирусных векторов. Характерными примерами ДНК генов являются ген хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT) или ген р53. Предпочтительно данные гены доставляются посредством носителя из поликатионного полимера, такого как полиэтиленимин. В качестве носителей могут также применяться катионные липосомы. Полиэтиленимин может иметь соотношение азот:фосфат, составляющее приблизительно от 10:1 до 20:1. В предпочтительном воплощении соотношение азот: фосфат в PEI составляет приблизительно 10:1.

Предоставляются нижеследующие определения. Термины, которые конкретно не определены, следует интерпретировать, как принято в данной области.

В данном описании термин "аэрозоли" относится к дисперсиям в воздухе твердых или жидких частиц, имеющих достаточно маленький размер и, как следствие, достаточно низкие скорости оседания для того, чтобы образовывать относительно стабильную взвесь в воздухе (8).

В данном описании термин "липосомные аэрозоли" относится к водным капелькам, в которых диспергированы одна или несколько липосомных частиц или липосом, содержащих один или несколько лекарственных препаратов, предназначенных для доставки к дыхательным путям человека или животных (9).

В данном описании размер аэрозольных капелек, определенный для данной заявки, соответствует описанному в патенте США 5049338, а именно среднемассовый аэродинамический диаметр (MMAD) составляет 1-3 мкм при геометрическом стандартном отклонении, составляющем приблизительно 1,8-2,2. Однако при низких концентрациях 9-NC и, возможно, других производных камптотецина среднемассовый аэродинамический диаметр может быть менее 1 мкм, например 0,8 мкм. Исследования, раскрытые в настоящем изобретении, показали, что липосомы могут занимать по существу весь объем капельки, если она уравновешена с влажностью окружающей среды.

В данном описании "модель легких Вейбела (Weibel)" относится к классификации структуры человеческих легких, которая распознает 23 последовательных ответвления дыхательных путей человека. Трахею обозначают 0, бронхи и бронхиолы простираются до ветви 16. Данные фрагменты дыхательных путей содержат реснитчатый эпителий и слизистые железы. Вместе они составляют покрытие из реснитчатого эпителия. Ветви 17-23 составляют альвеолярный фрагмент легкого и не имеют реснитчатого эпителия. Таким образом, осевшие частицы не выносятся вверх по дыхательным путям для проглатывания.

В данном описании постулируется, что при контролируемых экспериментальных состояниях гиперкапнии осаждение вдыхаемых частиц лекарственного средства значительно превышает уровни, наблюдаемые при базальных состояниях дыхания. Применение смесей газообразный диоксид углерода/воздух для обеспечения непрерывного потока струйного распылителя может сильно увеличить эффективность доставки дозы лекарственного средства к периферическим участкам легких (образования Вейбела 17-23). По аналогии данная система может эффективно применяться для увеличения биологической эффективности вдыхаемых лекарственных средств. Данный принцип теоретически может применяться с любым лекарственным средством, геном, олигонуклеотидом или белок/пептидной композицией (растворимой, липосомальной, кристаллической или содержащей носитель на основе полимера, такой как полиэтиленимин), и любым струйным распылителем, действующим с использованием газа или воздуха.

Настоящее изобретение в первую очередь направлено на применение газообразного диоксида углерода для увеличения глубины и частоты дыхания в процессе ингаляционной терапии лекарственным средством, вводимым в виде аэрозоля, что приводит к увеличению минутных объемов. Увеличение дыхательного объема легких приводит к повышению осаждения в легких вдыхаемых частиц лекарственного средства, особенно в периферических участках легких, которые могут не вентилироваться полностью при низких уровнях дыхания. Увеличение минутного объема происходит в результате повышения частоты и глубины дыхания, оба данных фактора вносят вклад в увеличение минутного объема. 

Введение лекарственного средства в виде аэрозоля в воздушной смеси, содержащей приблизительно до 10% газообразного диоксида углерода, приводит к увеличению осаждения лекарственного средства в дыхательной системе, значительно улучшая эффективность и терапевтическое действие аэрозольной доставки лекарственного препарата. Предпочтительные концентрации газообразного диоксида углерода включают 2,5%, 5% и 7,5%. Аэрозоль может быть введен в течение от 1 до 30 минут, или даже в течение более длительного времени. Усиливающий эффект диоксида углерода становится очевидным в пределах 30 секунд. Влияние диоксида углерода на дыхание является временным и может применяться многократно.

Нижеследующие примеры приведены с целью иллюстрации различных воплощений данного изобретения и не должны пониматься как ограничивающие каким-либо образом настоящее изобретение.

Пример 1

Материалы

РТХ получают от Xechem (New Brunswick, NJ). CPT получают от Sigma (St.Louis, МО), a 9NC от ChemWerth (Woodbridge, CN). Дилауроилфосфатидилхолин (DLPC) получают от Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). DMSO получают от Sigma (St. Louis, МО), а другие органические растворители, имеющие степень чистоты "чистый для ВЭЖХ" получают от Fisher Scientific. Стерильную воду для промывания получают от Baxter Healthcare Corporation (Deerfield, IL).

Мышей ICR (возрастом 7-8 недель) получают от Harlan-Sprague Dawley (Indianapolis, IN) и помещают в стандартные клетки со свободным доступом к пище и воде. Самок мышей C57BL/6 (возрастом 8-9 недель) и самок мышей Balb/C (возрастом 5-7 недель) получают от Harlan-Sprague Dawley (Houston, TX). Уход за всеми животными осуществляют в соответствии с Baylor College of Medicine Institutional Animal Care и Use Committee.

Ген бактериальной хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT, p4119, ссылка 15), главным образом, используют в качестве репортерного гена для измерения экспрессии трансгена. Ген CAT находится под контролем элемента раннего промотора/энхансера человеческого цитомегаловируса (CMV). Люциферазная плазмида (pGL3, Promega, Madison, WI), модифицированная путем вставки промотор/энхансерного элемента CMV и последовательности полиаденилирования человеческого гормона роста, предоставлена Dr.Michael Barry (Center for Cell and Gene Therapy, Baylor). Все плазмиды очищены на колонках Qiagen (Qiagen, Valencia, CA) и не содержат эндотоксина. Количественное определение плазмид осуществляют по УФ-поглощению при 260 нм. Анализ на агарозном геле показал, что плазмиды представляют собой смесь главным образом суперспиральной плазмиды с небольшим количеством плазмиды с одноцепочечным разрывом.

Плазмиду, содержащую ген р53, получают от Dr.Y.K.Fung (Children's Hospital, Los Angeles, CA). Ген р53 находится под контролем промотор/энхансерного элемента человеческого цитомегаловируса (CMV). В качестве контроля используют плазмиду, содержащую ген светящейся люциферазы (Luc), полученную от Dr.Michael Barry (Baylor College of medicine). Плазмиды, очищенные в промышленных масштабах Bayou Biolabs (Harahan, LA), не содержат эндотоксина, и количественное определение данных плазмид осуществляют по УФ-поглощению. Анализ на агарозном геле показал, что плазмиды главным образом находятся в суперспиральной форме при небольшом количестве плазмиды с одноцепочечным разрывом. 

Клеточную линию меланомы B16-F10 получают от Division of Cancer treatment и Diagnosis Center (DCTDC, NCE, Frederick, MD) и культивируют в DMEM, дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой. Показано, что данная клеточная линия образует опухоли в легком (15). Мышам C57BL/6 вводят в хвостовую вену двадцать пять тысяч клеток B16-F10 в 200 мкл среды на одну мышь. Метастазы в легких визуально детектируют в течение двух недель после инокуляции клеток. Клетки используют от 3-12 пассажа.

Пример 2

Статистика

После однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) для сравнения средних значений проводят двусторонний непарный t-тест Стьюдента. Различие считают значимым, если Р0,05. 

Пример 3

Получение липосом

Базовые растворы DLPC, РТХ и камптотецина готовят в т-бутаноле с концентрацией 100, 10 и 1 мг/мл соответственно, используя ранее описанные методы (17). Аликвоты паклитаксела и DLPC смешивают при массовом соотношении 1:10. Массовое соотношение камптотецина к DLPC составляет 1:50. Затем смесь лекарственное средство - фосфолипид замораживают в жидком азоте и лиофилизируют в течение ночи до получения сухого порошка. Готовые формы хранят в герметично закрытом состоянии при -20°С. Перед применением смесь разбавляют стерильной водой для смачивания и энергично перемешивают до получения гомогенной суспензии многослойных липосом. Исходные концентрации камптотецина и паклитаксела в суспензии перед распылением составляют 0,5 мг/мл и 10 мг/мл соответственно. Размер липосом до и после распыления определяют, используя Nicomp Submicron Particle Sizer Model 370 9NICOMP, Santa Barbara, CA.

Пример 4

Характеристики размеров аэрозольных частиц

Характеристики аэрозольных частиц, содержащих лекарственные средства, заключенные в липосомах, оценивают, используя дозатор размеров для неживых рассеянных частиц Andersen/AFCM (Andersen Instruments, Atlanta, GA) no описанной методике (31). Концентрацию лекарственного средства в аэрозолях, полученных с использованием воздушных или газовых смесей, истекающих со скоростью 10 л/мин из распылителя AERO-MIST, также измеряют путем сбора образцов в течение 3 минут через 1 минуту после начала аэрозолизации. Среднемассовый аэродинамический диаметр (MNAD) и геометрическое стандартное отклонение (GSD) рассчитывают, как описано ранее (30, 31), используя программное обеспечение KaleidaGraph 2.0 (synergy Softwear, Reading, PA).

Пример 5

Аэрозольная доставка паклитаксела и камптотецина

Обработку мышей аэрозолем проводят, как описано ранее (16-18). Вкратце, для получения аэрозольных частиц применяют струйный распылитель AERO-MIST (CIS-USA, Beadford, MA) при скорости воздушного потока 10 л/мин. Мышей помещают в герметично закрытую пластиковую клетку (23×18×13 см) и подвергают действию аэрозоля в течение 30 минут. Аэрозоль получают с использованием нормального воздуха или воздуха, содержащего 5% СО2, который получают путем смешивания нормального воздуха и СО2 с помощью смесителя (Bird 3m, Palm Springs, CA), и концентрации СО2 проверяют с помощью Fluid Fyrite (Bacharach Inc., Pittsburg, PA). Для каждой временной точки 3 мышей удаляют из клетки, умерщвляют, подвергая воздействию изофлурана, USP (Abbott Laboratories, Chicago, IL), и обескровливают. Органы удаляют, взвешивают и держат замороженными при -70°С до экстракции.

Пример 6

Экстракция лекарственного средства из тканей

Перед экстракцией образцы оттаивают и сразу разрезают ножницами на маленькие кусочки. Для того, чтобы экстрагировать паклитаксел из тканей, к каждому образцу добавляют 3 мл этилацетата и гомогенизируют в разрушающем клетки гомогенизаторе mini-beadbeater (Wig-L-Bug, Model 3110В, Crescent Dental MFR, Co., Lyons, IL) в течение 2 минут. Гомогенаты переносят в конические стеклянные центрифужные пробирки объемом 10 мл и центрифугируют 10 мин при 1000×g. Супернатантную фракцию отделяют и органический растворитель упаривают под током воздуха. Остаток разбавляют 0,2 мл смеси метанол: ацетонитрил (2:1, об/об), обрабатывают ультразвуком в ультразвуковом устройстве с водяной баней и центрифугируют 10 мин при 1000×g. Супернатантные фракции нагревают 30 мин при 37°С и анализируют методом ВЭЖХ.

Процедуру экстракции для камптотецина и 9NC проводят по описанному ранее способу (17). Вкратце, для определения эффективности экстракции после оттаивания ткани к органам добавляют 20 мкг 9NC в 20 мкл в качестве внутреннего стандарта. Образцы разрезают на маленькие кусочки и к каждому образцу добавляют 1 мл 1% водного раствора уксусной кислоты, рН 3,2. После гомогенизации в mini-beadbeater гомогенаты центрифугируют при 1000×g в течение 5 мин. Супернатантные фракции повторно экстрагируют 8 мл метиленхлорида. Органическую фракцию отделяют и сушат на воздухе при комнатной температуре. Высушенные образцы разбавляют 0,2 мл ацетонитрила.

Пример 7

Анализ ВЭЖХ 

Паклитаксел количественно определяют методом ВЭЖХ с обращенной фазой с детекцией на детекторе УФ-поглощения Waters 486 при 227 нм (Waters, Milford, MA). Все измерения производят при комнатной температуре на колонке Waters Nova-Pak C18 (3,9×150 см). Мобильная фаза состоит из 49% ацетонитрила и 51% воды. Скорость потока составляет 1,5 мл/мин. Вводят аликвоту каждого образца объемом 25 мкл и данные анализируют с помощью Waters millennium Software. Для определения эффективности экстракции РТХ проводят процедуры, идентичные процедурам, при которых к каждой ткани добавляют известное количество паклитаксела и сравнивают с экстрагированным количеством паклитаксела. Эффективность экстракции (%) рассчитывают как ((количество паклитаксела после экстракции)/(количество добавленного паклитаксела))×100. Для всех тестируемых тканей средняя эффективность экстракции составляет 89±4% (данные не показаны), и данный показатель используют для расчета конечных концентраций лекарственного средства в тканях.

ВЭЖХ анализ камптотецина проводят, используя колонку Waters Nova-Pak C18 (3,9×150 см) (17). Хроматограммы для камптотецина прочитывают на сканирующем флуоресцентном детекторе Waters 470 ( возбуждения=360 нм, испускания=455 нм), тогда как 9NC детектируют с помощью детектора УФ-поглощения Waters 440 при 254 нм. Мобильная фаза состоит из 30% ацетонитрила и 70% 0,1% раствора уксусной кислоты в воде, рН 3,5 со скоростью потока 1,2 мл/мин (16, 17).

Пример 8

Аэрозольные характеристики липосомных композиций 

Свойства CPT-DLPC и PTX-DLPC липосом и их аэрозольные характеристики приведены в таблице 1. Применение смеси 5% CO 2-воздух не изменяет концентрацию ни лекарственного средства в аэрозоле, ни MMAD и GSD (Р>0,1; двусторонний критерий Стьюдента). В процессе распыления уменьшается размер липосомных частиц в растворе от микро- до нано-частиц для обеих лекарственных композиций. Размер CPT-DLPC уменьшается от 2,54±0,91 мкм перед распылением до 0,49±0,07 мкм после распыления с применением смеси 5% СО2-воздух. Для композиции PTX-DLPC данные значения составляют 13,14±12,15 мкм и 0,23±0,17 мкм соответственно. Размер аэрозольных частиц до или после распыления одинаков в случае как PTX-DLPC, так и CPT-DLPC, вводимых в виде аэрозоля с использованием нормального воздуха или смеси 5% СО2 -воздух (Р>0,5; двусторонний критерий Стьюдента).

ТАБЛИЦА 1

Аэрозольные и липосомные характеристики PTX-DLPC и CPT-DLPC композиций при использовании смеси 5% СО2-воздух по сравнению с нормальным воздухом 
Лекарственная форма Состав воздуха Концентрация лекарственного средства в аэрозоле, мкг/мл Аэрозольные капельки Размер липосомных частиц, мкм 
MMAD, мкм GSD До распыления После распыления 
CPT-DLPC, 0,5 мг СРТ/мл Нормальный 5% СО2 9,0±1,3

9,2±1,9 1,6±0,3 1,7±0,5 2,1±0,1 2,3±0,2 3,72±1,10 2,54±0,91 0,34±0,11 0,49±0,07 
PTX-DLPC, 10 мт РТХ/мл Нормальный 5% СО 2 153,0±27

175,0±9 2,0±0,2 2,2±0,2 1,8±0,03 1,9±0,1 12,49±8,06 13,14±12,15 0,13±0,18 0,23±0,17 


Данные приведены как средние значения ± SD (n=3 для каждого значения). MMAD, среднемассовый аэродинамический диаметр; GSD, геометрическое стандартное отклонение

Пример 9

Тканевое распределение и фармакокинетика CPT-DLPC после доставки в виде аэрозоля, полученного с использованием нормального, или содержащего 5% СО2, воздуха

Мышей ICR разделяют на две группы: первая группа (n=4) в течение 30 минут получает CPT-DLPC композицию в виде аэрозоля, полученного с использованием нормального воздуха, следовательно, параметры их дыхания не изменяются в процессе обработки; вторая группа (n=6) вдыхает такую же композицию, но в атмосфере воздуха, содержащего 5% СО2.

Вдыхание аэрозолей, полученных с использованием смеси 5% СО 2-воздух, вызывает значительное увеличение осаждения камптотецина в легких (в 2,1-3,5 раза) (фигура 1). Содержание СРТ составляет 134±123 и 476±216 нг/г легочной ткани мыши для первой и второй группы соответственно. Применение 5% CO2 в воздухе не изменяет характер тканевого распределения. Концентрации лекарственного средства в печени, селезенке, почках, крови и мозге после ингаляции CPT-DLPC аэрозолем, полученным с использованием 5% СО2 в воздухе, также увеличиваются.

Определяют фармакокинетику осаждения камптотецина в легких в процессе и после 30 мин воздействия CPT-DLPC аэрозолей, полученных с использованием нормального или содержащего 5% CO2 воздуха (фигура 2). Легочные концентрации камптотецина увеличиваются в процессе обработки с достижением максимальной концентрации (Cmax) в конце аэрозольной обработки (30 мин), после чего концентрации лекарства в легких начинают падать. Максимальные уровни в дыхательных путях составляют 232±158 и 486±78 нг/г ткани для нормального воздуха и воздуха, содержащего 5% СО2, соответственно. В течение 15 мин после окончания обработки аэрозолем концентрации лекарственного средства уменьшаются по экспоненте. Полупериод выведения (Т1/2) для обоих групп составляет 12-15 мин. Профили фармакокинетических кривых для двух типов обработки очень похожи. Через 90 мин после окончания аэрозолизации (временная точка 120 мин) детектируют только следовые количества лекарственного средства при любом источнике воздуха.

Пример 10

Тканевое распределение и фармакокинетика лекарственного средства РТХ после обработки аэрозолем PTX-DLPC, полученным с использованием нормального или обогащенного СО2 воздуха

Из-за ограничений метода детекции используют липосомальную композицию паклитаксела с концентрацией 10 мг РТХ/мл суспензии. Мышей умерщвляют частично в процессе воздействия (15 мин), в конце обработки (30 мин) и в отдельные моменты времени после конца обработки. Мышей подвергают воздействию PTX-DLPC аэрозоля, полученного с использованием либо нормального воздуха, либо воздуха, содержащего 5% СО2.

Значения Cmax для паклитаксела в легких достигаются в конце обработки (30 мин) при любом источнике воздуха (фигура 3). В группе, для которой применяется воздух, содержащий 5% СО2, значение Cmax является в 4,2 раза выше, чем в группе, для которой применяется воздух окружающей среды (23,1±4,3 и 5,5±0,2 мкг/г соответственно). Данное увеличение, вызванное диоксидом углерода, не зависит от липосомальной композиции (фигура 4). Стерически стабилизированные липосомы с паклитакселем, полученные с использованием димиристилфосфоэтаноламинполи(этиленгликоля) 2000 и дилауроилфосфатидилхолина осаждаются в легких с одинаковыми уровнями, если применяется 5% CO2 в воздухе.

Площадь под кривой (концентрация в легких)-время, полученной при обработке 5% CO2, в 5,7 раз выше, чем в случае кривой, полученной при обработке нормальным воздухом (33,7 и 5,9 мкг-час/г соответственно). В обоих случаях концентрации РТХ в легочной ткани начинают уменьшаться после окончания обработки. Значения Т1/2 и Т1/2 для паклитаксела в легких составляют 0,3 и 1,6 ч соответственно при использовании нормального воздуха для получения аэрозоля. Для паклитаксела, вводимого в виде липосомального аэрозоля, полученного с использованием смеси 5% СО2-воздух, Т1/2 составляет 0,7 ч, а Т1/2 составляет 5,1 ч. Проводят сравнительный анализ для других органов, таких как печень, селезенка, почки и кровь; однако уровни паклитаксела в данных тканях при использовании для аэрозолизации нормального воздуха являются ниже детектируемых уровней.

Тканевое распределение паклитаксела после аэрозольной доставки с использованием смеси 5% CO2-воздух представлено в таблице 2. Наивысшие концентрации лекарственного средства детектируют в легких. Более низкие концентрации обнаруживают в других органах. Анализ области под кривой концентрация-время (AUC) в течение 3 ч периода для различных организмов с использованием правила трапеций дает следующие значения AUC для легких, почек, крови и мозга: 34±2, 9,8±1,9, 2,4±1,4, 2,8±1,5, 0,13±0,10, 0,23±0,2 мкг РТЗ-ч/г ткани соответственно.

ТАБЛИЦА 2

Осаждение РТХ в тканях в процессе и после 30 мин воздействия аэрозоля PTX-DLPC*, полученного с использованием смеси 5% CO2-воздух 
Время (ч) Концентрация РТХ (мг/г ткани) 
Легкие Печень Селезенка Почки Кровь Мозг 
0,25 20,3±7,8 1,5±0,8 0,6±0,3 1,4±0,0 0,25±0,03 0,14±0,16 
0,5 23,1±4,3 5,7±3,0 1,4±0,9 1,6±0,1 0,18±0,08 0,16±0,02 
0,75 18,0±3,6 5,5±1,8 0,5±0,4 1,4±0,1 0,08±0,09 0,11±0,03 
1,0 14,8±9,5 4,8±3,9 2,6±2,7 1,2±0,7 0,07±0,07 0,11±0,03 
1,5 8,7±2,8 2,8±0,8 1,0±1,6 0,7±0,3 0,03±0,06 0,09±0,08 
2,0 6,5±2,9 3,1±0,7 0,6±0,4 0,4±0,3 0,01±0,02 0,04±0,04 
3,0 7,1±2,8 2,3±0,6 0,5±0,2 0,4±0,1 0,01±0,02 0,05±0,05 


Данные приведены как средние значения ± SD от трех экспериментов (в каждом эксперименте органы от трех мышей объединяют и обрабатывают)

Пример 11

Влияние моделей дыхания, индуцированных диоксидом углерода, на осаждение лекарственного средства

Повышенные концентрации лекарственного средства, обнаруживаемые в легких после вдыхания 5% СО2 в воздухе, могут объясняться изменением характера дыхания. Визуально устанавливают, что дыхание мыши в атмосфере воздуха, содержащего 5% CO2 , становится более глубоким и более медленным и возвращается к нормальному сразу после окончания обработки. Гистологический анализ не обнаруживает каких-либо изменений в легочной ткани. Плетизмографические исследования, которые проводились другими исследователями, демонстрируют, что вдыхание воздуха, содержащего 5% СО2, повышает газообмен у млекопитающих в первую очередь из-за увеличения дыхательного объема (приблизительно 170-180%) (18, 19). Среднее осаждение в легких камптотецина и паклитаксела увеличивается приблизительно в 2-4 раза. Такая диспропорция по отношению к увеличению дыхательного объема может иметь место из-за некоторых других физиологических изменений параметров дыхания, например частоты дыхания, респираторной продолжительности циклов вдоха и выдоха и минутного газообмена (13). Удерживание аэрозоля в результате глубокого и полного выдоха с задержкой дыхания увеличивается почти вдвое по сравнению с нормальным дыханием (15).

Пример 12

Получение комплексов PEI-DNA

PEI (25 кДа, разветвленный) получают от Aldrich Chemical (Milwaukee, WI). Готовят базовый раствор PEI с концентрацией 4,3 мг/мл (0,1 М по азоту) в PBS, рН 7-7,5. PEI и ДНК смешивают отдельно в 5 мл воды в требуемых концентрациях. Раствор PEI медленно перемешивают и к нему добавляют раствор ДНК до получения конечного объема 10 мл. Смесь оставляют стоять при комнатной температуре в течение приблизительно 15-20 мин перед распылением. Полученное соотношение загрузки выражают как азот PEI:фосфат ДНК (N:P), оно может быть рассчитано, исходя из того, что ДНК имеет 3 нмоль фосфата на микрограмм, а 1 мкл 0,1М раствора PEI содержит 100 нмоль аминного азота. Соотношение N:P 10:1 соответствует массовому соотношению РЕI-ДНК 1:29:1

Пример 13

Аэрозольная доставка комплексов PEI-ДНК

Мышей помещают в пластиковые клетки, которые перед обработкой аэрозолем герметично запечатывают с помощью ленты (48). В результате получают неограниченную систему для воздействия аэрозоля на все тело. Комплексы PEI-ДНК вводят в виде аэрозоля с помощью распылителя Aero-Mist (CIS-US, Inc., Bedford, MA) со скоростью истечения 10 литров/мин, с использованием воздуха, или воздуха, содержащего 5% СО2. Aero-Mist представляет собой эффективный распылитель с высокой мощностью, который, как показано с помощью каскадного импактора Andersen (Andersen Instruments, Atlanta, GA) no описанному ранее методу (50), продуцирует аэрозоли в оптимальном интервале 1-2 мкм MMAD с геометрическим стандартным отклонением (GSD) 2,9. Источник сухого воздуха (Aridyne 3500, Timeter, Lancaster, PA) доставляется в газовый смеситель Bird 3M (Palm Springs, CA), присоединенный к воздушному компрессору и резервуару с CO 2. Полученная смесь воздуха и CO2 подается в распылитель. Конечную концентрацию, составляющую 5% СО2 в воздухе, определяют с помощью раствора Fyrite (Bacharach, Pittaburgh, PA). Распыление 10 мл раствора занимает приблизительно 30 мин.

Пример 14

CAT анализ

Мышей анестезируют и умерщвляют по достижению каждой временной точки, легкие и другие органы собирают, взвешивают и сразу замораживают. Набор CAT ELISA (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Germany) используют для измерения экспрессии in vivo. Ткани гомогенизируют в 700 мкл лизирующего буфера для CAT анализа, используя шариковый гомогенизатор Wig-L-Bug (Crescent Dental Mfg., Lyons, IL). После центрифугирования гомогенатов 200 мкл экстракта используют для проведения CAT ELISA в формате 96-луночного планшета. Поглощение считывают с помощью устройства для прочтения титрационных микропланшетов (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). В качестве контроля используют мышей Naïve. Активность CAT определяют с помощью стандартной кривой, полученной с использованием очищенного фермента CAT, и выражают как нг САТ/г ткани. Чувствительность анализа дополнительно повышают в соответствии с предложениями производителя так, чтобы обеспечить возможность детектирования белка CAT на таком низком уровне, как 0,1-0,3 пг/лунку.

Пример 15

Анализ люциферазы 

Мышей анестезируют, умерщвляют и собирают легкие. Для измерения экспрессии люциферазы используют набор для анализа люциферазы (Promaga). Легкие гомогенизируют в 1 мл лизирующего буфера для анализа люциферазы с помощью шарикового гомогенизатора Wig-L-Bug. После центрифугирования гомогенатов 10 мкл экстракта добавляют к 50 мкл субстрата люциферазы и люминесценцию считывают в течение 10 сек в 96-луночном планшете на люминометре (Microlumat LB 96 Р, EG & G Berthold, Germany). В качестве контроля используют мышей Naïve. Активность люциферазы выражают как RLU/10с/г ткани. В данной системе 107 RLU соответствует 1 нг люциферазы при использовании очищенной люциферазы от Promega. 

Пример 16

Гистологический анализ тканевых срезов 

Мышей анестезируют изофлураном и умерщвляют обескровливанием через абдоминальную аорту. Легкие выделяют, вводят в них канюлю и фиксируют путем накачивания 10% нейтрального забуференного формалина, заключают в парафин и подвергают процессу гистологического анализа. Тонкие срезы разрезают на 4 мкм и исследуют под микроскопом на наличие каких-либо признаков воспаления или токсичности с помощью окрашивания гематоксилином и эозином.

Пример 17 

Анализ миелопероксидазы (МРО)

Через двадцать четыре часа после воздействия аэрозоля мышей анестезируют изофлураном и умерщвляют обескровливанием через абдоминальную аорту. Легкие собирают после перфузии физиологическим раствором через сердце. Ткань гомогенизируют в бромиде гексадецилтриметиламмония (0,5% НТАВ в 50 мМ фосфатном буфере, рН 6,0; 5 мл НТАВ/г ткани), как описано ранее (51). После центрифугирования определяют активность МРО в супернатанте, используя дигидрохлорид о-диазинидина (0,167 мг/мл) и 0,0005% пероксид водорода. Поглощение измеряют при 460 нм, используя устройство для прочтения титрационных микропланшетов (Molecular Devices). Через 15 мин регистрируют абсолютные значения. В качестве контроля используют мышей Naïve.

Пример 18

Распыление комплексов PEI-ДНК с использованием 5% CO 2 увеличивает экспрессию трансгена в легких по сравнению с нормальным воздухом

Вдыхание воздуха, содержащего 5% СО2, связано с увеличением дыхательного объема и частотой дыхания у мышей и людей (52-54). Если для доставки PEI-ДНК аэрозоля используют воздух, содержащий 5% СО2, то можно визуально определить, что дыхание мышей становится более глубоким и более быстрым. Вдыхание аэрозолей, содержащих 5% СО2, может привести к увеличению вдыхания аэрозольных частиц и, следовательно, к увеличению экспрессии трансгена по сравнению с экспрессией, которая достигается при применении аэрозоля, доставляемого посредством воздуха, в результате увеличения дыхательного объема и частоты дыхания.

Мыши Balb/C получают комплексы PEI-ДНК в виде аэрозоля с использованием либо нормального воздуха, либо воздуха, содержащего 5% CO2. Фиксированное количество CAT плазмиды (1 мг/10 мл раствора) при соотношении N:P, составляющем 10:1, вводят в виде аэрозоля в течение 30 мин, как указано выше.

Легкие собирают через 24 часа и для определения степени трансфекции проводят анализ CAT. Использование воздуха, содержащего пять процентов СО2, приводит к трехкратному увеличению (Р=0,001) детектируемых уровней CAT по сравнению с аэрозолем, распыляемым с использованием просто воздуха (фиг.5). Кроме того, применение 5% СО2 не приводит к изменению размера получаемых аэрозольных частиц, содержащих липосомы с лекарственным средством.

Также исследуют увеличение переноса PEI-ДНК к легким посредством аэрозоля, полученного с использованием различного процентного содержания СО2 в воздухе, при фиксированном количестве CAT плазмиды. Комплексы вводят в виде аэрозоля с использованием 0%, 2,5%, 5%, 10% и контрольных количеств диоксида углерода в воздухе. Анализ активности CAT показывает, что применение или 2,5%, или 10% обеспечивает такой же хороший уровень трансфекции, как и применение 5% СО2 в воздухе (фиг.6).

Возможно увеличение концентрации СО2 оказывает влияние на эффективность трансфекции комплексов PEI-ДНК путем изменения некоторых других физиологических параметров. Однако по сравнению с воздухом СО 2 существенно не изменяет ни рН раствора PEI-ДНК, ни размер частиц получаемых аэрозольных капелек. Наиболее вероятно, что повышение экспрессии трансгена в легких происходит в результате увеличения осаждения аэрозольных частиц. Воздух, содержащий пять процентов СО2, также может оптимизировать аэрозольную доставку других комплексов полимер-ДНК или катионный липид-ДНК (45). Указанное процентное содержание СО2 хорошо переносится людьми и, как было показано, увеличивает минутный объем (54, 55), таким образом, данная стратегия может быть эффективной при легочных заболеваниях человека, при условии, что принимаются во внимание размер, геометрия и физиология человеческой легочной системы.

Пример 19

Перенос ДНК посредством PEI является дозозависимым

Для дальнейшей оптимизации экспрессии трансгена соотношение N:P поддерживают постоянным, равным 10:1, а количество ДНК варьирует от 250 мкг до 4 мг на 10 мл аэрозолизированного раствора. Это приводит к увеличению концентрации в резервуаре, а также общего количества ДНК, распыляемой в виде аэрозоля.

Рассчитано, что производительность распыления из распылителя Aerotech II составляет приблизительно 80%. Приблизительно 72% ДНК, находящейся в резервуаре, доставляется в ингаляционную камеру, как оценивают с помощью полностью стеклянного импинджера (AGI) (50). Остаток улавливается в Т-образном соединении и в системе трубок. На основе облигатного носового дыхания мыши, легочной физиологии (минутный объем и осаждаемая фракция) (50), а также концентрации аэрозоля на выходе (4,8 мкг/литр), количество ДНК, осажденной в легких мыши, оценивают приблизительно как 4-5 мкг в течение 30 мин воздействия аэрозоля (при исходной концентрации в резервуаре, составляющей 2 мг ДНК/10 мл раствора). Данные расчеты основаны на дыхании нормальным воздухом; осаждение может быть выше в присутствии 5% СО2 вследствие увеличения дыхательного объема и частоты дыхания (53).

Комплексы вводят в виде аэрозоля с использованием 5% СО2 в воздухе и 2 мг ДНК, получая наивысший уровень экспрессии CAT в легких (фигура 7). Уровни CAT, определяемые при введении 250 мкг ДНК, статистически не отличаются от уровней в контрольных легких (Р=0,34). Кроме того, при растворении 4 мг ДНК в 10 мл при соотношении N:P, составляющем 10:1, наблюдается выпадение в осадок некоторого количества ДНК, что может объяснять отсутствие дальнейшего увеличения уровня CAT, определяемого в легких по сравнению с 2 мг (Р=0,51).

Следует отметить, что увеличивается как концентрация, так и количество доставляемой ДНК. Однако можно дополнительно повысить экспрессию в легких путем увеличения времени воздействия аэрозоля при оптимальных концентрациях. Данные уровни экспрессии в легких сравнимы с уровнями, получаемыми при использовании других систем доставки (34).

Пример 20

Оптимизация соотношений PEI-ДНК

Хотя PEI может защищать ДНК в процессе распыления и, кроме того, обеспечивает после аэрозольной доставки более высокую экспрессию трансгена в легких по сравнению с большинством других катионных липидов, определение оптимальных параметров доставки генов является полезным. Электростатическое взаимодействие между катионной средой и отрицательно заряженной ДНК является важным фактором, определяющим эффективность трансфекции комплекса. В проведенных ранее исследованиях было установлено оптимальное соотношение PEI-ДНК (N:P) для трансфекции в легких (38, 56). Однако данные исследования включали внутривенный способ доставки PEI-ДНК. Доставка генов посредством аэрозолей требует других условий.

Для определения соотношения зарядов, которое было бы идеальным для доставки аэрозоля in vivo, различные соотношения PEI-ДНК оценивают на способность обеспечивать трансфекцию в легкие. Количество ДНК оставляют постоянным, равным 2 мг, а концентрацию PEI изменяют так, чтобы получить соотношения 5:1, 10:1, 12,5:1, 15:1, 17,5:1 и 20:1. Данные соотношения выбирают на основе ранее проведенных in vivo и in vitro (посредством инстилляции) исследований (43). Комплексы вводят в виде аэрозоля, полученного с использованием 5% СО2 в воздухе. Соотношение N:P, равное 15:1, обеспечивает наивысший уровень экспрессии CAT в легких, тогда как 5:1 приводит к очень низкому уровню экспрессии CAT (фигура 8). Статистически не существует различия между соотношениями 10:1, 12,5:1, 15:1, 17,5:1 и 20:1 (Р>0,1), но имеется существенное различие между соотношениями 15:1 и 20:1 (Р=0,05) и между 10:1 и 15:1 (Р=0,014). 

Для определения оптимального соотношения для плазмиды, отличной от CAT, различные соотношения N:P тестируют на экспрессию гена люциферазы в легких. Тестируемые соотношения составляют 5:1, 10:1, 15:1, 20:1, 30:1 и 40:1. Оптимальная кривая для люциферазы сдвинута вправо по сравнению с кривой для CAT, причем максимальная экспрессия наблюдается при соотношении 20:1 (Р<0,05 по сравнению с другими соотношениями) (фигура 8). Полученные данные позволяют предположить, что для разных плазмид могут требоваться разные соотношения N:P; другой размер люциферазной плазмиды приводит к получению комплекса с PEI, который структурно отличается от комплекса, образованного CAT плазмидой. Это может также происходить в результате различия плазмид по чистоте и соотношению суперспиральной структуры. Тем не менее, существует значительное перекрывание оптимальных соотношений N:P для двух данных плазмид. Оптимальные соотношения для разных плазмид могут быть разными. С учетом вариабельности экспериментальных данных соотношение, находящееся между 10: и 20:1, будет работать подходящим образом. Соотношение ниже 10:1 не обеспечивает очень высокой трансфекции в легких. Данные результаты согласуются с результатами, полученными при использовании разветвленного 25К PEI, хотя способ доставки при этом был внутривенный (56). 

Пример 21

Временная зависимость экспрессии CAT в легких после однократной доставки аэрозоля

Экспрессия CAT также используется для получения кривой временной зависимости экспрессии гена. Анализ продолжительности экспрессии CAT после однократной доставки аэрозоля предоставляет важную информацию для планирования режима лечения при терапевтических исследованиях. Два миллиграмма CAT плазмиды вводят мышам в виде аэрозоля, полученного при использовании 5% СО2 в воздухе, при двух различных соотношениях N:P, 15:1 и 10:1. Разные временные точки, анализируемые для группы 10:1, составляют 1, 2, 3 и 6 дней после воздействия аэрозоля. Легкие и другие ткани собирают в моменты времени, соответствующие разным временным точкам, и сразу замораживают. Все ткани анализируют одновременно после достижения последней временной точки (6 день). В группе 15:1 мышей умерщвляют на 1, 3, 7 и 10 день после обработки аэрозолем. Легкие собирают, взвешивают и замораживают после каждой временной точки и белок CAT анализируют после последней временной точки (10 день).

Для обоих тестируемых соотношений N:P экспрессия CAT является максимальной в точке, соответствующей 24 часам, и остается постоянной (статистически не существует различия между 1 и 3 днем, Р=0,4 для соотношения 15:1 и Р=0,12 для соотношения 10:1) в течение трех дней (фиг.10А и 10В). Через неделю уровень CAT падает приблизительно до 50% от максимальных уровней, и значительные уровни детектируют даже через 10 дней (Р=0,001 по сравнению с контролем). Такие данные позволяют предположить, что доставка может быть более чем адекватной для ряда клинических применений. Продолжительность экспрессии генов до 10 дней является такой же, как полученная при применении других катионных липидов, используемых для инстилляции или аэрозольной доставки генов, или превышает ее (34, 58).

Пример 22

Тканевое распределение трансгена

Внутривенная или интраперитонеальная доставка ДНК векторов, как правило, приводит к экспрессии в ряде тканей. Для того, чтобы определить, действительно ли аэрозольная доставка PEI-ДНК приводит к системной доставке генов, у одной группы мышей собирают разные ткани, как в описанном выше эксперименте (у группы 10:1), и после последней временной точки проводят анализ CAT. Тестируемыми тканями являются легкие, печень, селезенка, почки, тимус, мозг и кровь. Уровень CAT, детектируемый в тканях, отличных от легких, является очень низким и не отличается в значительной степени (Р>0,1 для всех тканей) от уровня, определяемого в контрольных тканях (фигура 11).

Данные по тканевому распределению показывают, что экспрессия гена после аэрозольной доставки в данной системе ограничена легкими, указывая на минимальную системную доставку. В противоположность легким, в таких тканях, как печень, селезенка и почки, в которых обычно обнаруживают детектируемые уровни экспрессии при доставке генов посредством внутривенного или интраперитонеального введения, происходит незначительная или недетектируемая экспрессия CAT при доставке PEI-ДНК посредством аэрозоля. Это важно, если экспрессия интересующего гена ограничена легкими. В других исследованиях для локализации гена в легких используют внутритрахейный способ доставки гена (58). Однако данный способ является несколько инвазивным по сравнению с аэрозолем и обычно приводит к менее однородному осаждению в периферических участках легких. Аэрозольная доставка способствует неинвазивному и однородному распределению частиц по всем легким (49).

Пример 23

Гистологический анализ показывает отсутствие признаков воспаления

Для того, чтобы определить, действительно ли аэрозольная доставка комплексов PEI-ДНК приводит к обнаружению какого-либо рода токсичности или острого воспаления в данной системе, получают комплекс двух миллиграммов плазмиды CAT с PEI, при соотношении N:P, составляющем 15:1, и мышей в течение 30 мин подвергают воздействию аэрозоля, полученного с использованием 5% СО2 в воздухе. Через 24 часа мышей умерщвляют, легкие фиксируют в формалине и окрашивают гематоксилином и эозином. При анализе тонких срезов легких не обнаруживают каких-либо данных, свидетельствующих о гистологических нарушениях, например воспалительной инфильтрации клеток или повреждениях клеток в легких (фигура 12). Доставка генов посредством PEI-ДНК аэрозоля, оптимизированная путем применения 5% CO2 в воздухе, представляется безопасной и высокоспецифичной для легких.

Хотя высокие уровни экспрессии детектируют в данной системе даже через неделю после однократного воздействия аэрозоля, некоторые терапии могут требовать повторной и многократной доставки генов. Необходимо провести изучение влияния пролонгированного воздействия PEI-ДНК аэрозоля на легкие и другие ткани.

Пример 24

Анализ миелопероксидазы не обнаруживает наличия какого-либо воспаления 

Острое воспаление легких отчасти опосредовано удалением полиморфно-ядерных лейкоцитов (PMN) в периферические ткани. Биохимическим маркером полиморфно-ядерных лейкоцитов является миелопероксидаза (МРО), которая представляет собой гем-содержащий фермент, обнаруженный в азурофильных гранулах и часто применяющийся в качестве маркера воспалительного процесса в легких (18). Для оценки инфильтрации нейтрофилов в легкие получают комплекс 2 мг CAT плазмиды с PEI при соотношении N:P, составляющем 15:1, и мышей в течение 30 мин подвергают воздействию аэрозоля, полученного с использованием 5% СО2 в воздухе. Через 24 часа мышей умерщвляют, собирают легкие и проводят анализ миелопероксидазы (таблица 3). 

Значительного различия в содержании миелопероксидазы в нормальных и обработанных аэрозолем легких не наблюдают (Р=0,92). Анализ миелопероксидазы не выявляет какого-либо различия между контрольными и обработанными аэрозолем легкими, т.е. отсутствует различие в абсолютных значениях поглощения (OD) для контрольных и обработанных аэрозолем легких, даже после 15 мин инкубации реакционной смеси (OD составляет 0,078±0,009 для контрольных и 0,084±0,004 для обработанных аэрозолем легких, Р>0,5). 

ТАБЛИЦА 3

Анализ миелопероксидазы (МРО) для оценки инфильтрации нейтрофилов в легкие 
Группа Контроль Аэрозоль 
Активность МРО в легких (А/мин/г ткани) 0,0398±0,01 0,0404±0,008 


Замечание. Получают комплекс двух миллиграммов CAT плазмиды с PEI при соотношении N:P, составляющем 15:1, и комплекс вводят пяти мышам в течение 30 мин в виде аэрозоля, полученного с использованием 5% СО2 в воздухе. Через 24 часа мышей умерщвляют, собирают легкие и проводят анализ МРО. Данные представлены в виде средних значений+SD (n=5 мышей на группу).

Пример 25

Анализ Р53

Экспрессию Р53 определяют с помощью набора ELISA (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Для экспрессии in vitro клетки B16-F10, выращенные в плашках для культивирования тканей (20000 клеток/лунку 48-луночной плашки), трансфицируют комплексами PEI-ДНК в течение 24 ч. Затем культуры промывают и клетки лизируют, используя буфер для лизиса клеток. После центрифугирования 100 мкл лизата используют для ELISA анализа р53. Уровни р53 нормализуют по содержанию общего белка, измеренного с помощью белкового анализа ВСА (Pierce, Rockford, IL). Для экспрессии in vivo мышей подвергают воздействию PEI: р53 аэрозоля, спустя 24 часа их умерщвляют, легкие собирают и взвешивают. Легкие гомогенизируют в 1 мл охлажденного на льду лизирующего буфера (20 мМ Tris, 0,5 мМ EDTA, 1% Nonidet P40, 0,05% SDS, 1 мМ PMSE, 1 мкг/мл пепстатина, 2 мкг/мл лейпептина) с помощью шарикового гомогенизатора Wig-L-Bug (Crescent, Lyons, IL). После центрифугирования при 4°С 100 мкл супернатанта используют для ELISA анализа р53, проводимого в 96-луночном планшете. Поглощение (450 нм) считывают с тройными повторами с помощью устройства для прочтения титрационных микропланшетов Molecular Devices (Sunnyvale, CA). Количество р53 определяют с помощью стандартной кривой, полученной с использованием очищенного р53. С помощью данного анализа можно детектировать такие низкие уровни р53, как 10 пг/мл, а линейный диапазон измерения данного метода составляет 50-1000 пг/мл. Содержание общего белка в легких определяют с помощью белкового анализа ВСА.

Пример 26

Экспрессия р53 в легких мышей после аэрозольной доставки комплексов PEI-р53 

Комплексы PEI-р53 получают по способу, описанному выше для PEI-ДНК. Получают комплекс двух миллиграммов р53 плазмиды и полиэтиленимина при соотношении PEI:ДНК (N:P), составляющем 10:1, и комплекс вводят мышам C57BL/6 в виде аэрозоля, полученного с использованием 5% CO2 в воздухе. Мышей помещают в пластиковые клетки, которые перед обработкой аэрозолем герметично запечатывают с помощью ленты. В результате получают неограниченную систему для воздействия аэрозоля на все тело. Комплексы PEI-р53 вводят в виде аэрозоля с помощью распылителя Aero-Mist в присутствии 5% СО2, как описано выше для аэрозолизации комплексов полиэтиленимин: САТ.

Экспрессию р53 в легких анализируют с помощью ELISA через 24 часа после аэрозольной доставки мышам комплексов PEI-р53. Аэрозольная доставка комплексов приводит приблизительно к четырехкратному увеличению уровней р53, детектируемых в легочной ткани, по сравнению с уровнями, детектируемыми в легких naïve мышей. Уровень р53 у контрольных мышей составляет 0,0398±0,01 пг/мг белка, а уровень у мышей, обработанных аэрозолем, составляет 0,0404±0,008 пг/мг белка (данные приведены в виде средних значений ±SD) (59). Воздействие PEI-Luc не приводит к какому-либо увеличению уровней р53 (данные не показаны). 

Пример 27

Ингибирование B16-F10 метастаз в легких посредством аэрозольной доставки PEI-р53

Мышам C57BL/6 вводят внутривенно 25000 клеток B16-F10 на Q день. Мышей обрабатывают содержащим комплексы полиэтиленимин-р53 аэрозолем, полученным с использованием 5% СО2, дважды в неделю, начиная со следующего дня после инокуляции мышам раковых клеток (на 1, 4, 8, 11, 15, 18 и 22 дни), с последней обработкой на 22 день после инъекции (всего семь обработок аэрозолем). Контрольные группы включают необработанных мышей, мышей, обработанных полиэтилениминовыми или полиэтиленимин-Luc аэрозольными комплексами. Контрольные животные начинают умирать приблизительно на 24 день после инокуляции опухоли, когда лечение заканчивается и эксперимент прекращается. Дозировочный режим при лечении составляет 2 мг плазмиды/10 мл аэрозилизированного раствора при соотношении полиэтиленимин:ДНК (N:P) 10:1. Это общее количество ДНК, вводимой мыши в виде аэрозоля. Количество ДНК, доставляемое одной мыши, оценивают приблизительно как 4-5 мкг в присутствии нормального воздуха, и как более высокое в присутствии 5% СО2 благодаря увеличению дыхательного и минутного объемов.

На 24 день после инокуляции мышей умерщвляют, легкие фиксируют и рассчитывают опухолевый индекс. Мыши, обработанные PEI-р53, имеют очень низкий опухолевый индекс (Р<0,001 по сравнению с другими группами), тогда как все контрольные группы имеют большое количество опухолевых узелков (фигуры 13А, 13В). Большинство необработанных мышей и мышей, обработанных либо одним полиэтиленимином, либо полиэтиленимин-Luc, имеют большое количество неподдающихся счету опухолевых узелков с сопутствующей инвазией в стенку грудной клетки, и имеют метастазы во внелегочной ткани, такой как шея и абдоминальные лимфоузлы. Однако все мыши, обработанные комплексами полиэтиленимин-р53, имеют очень маленькие и четкие опухолевые очаги без инвазии в стенку грудной клетки и не имеют внелегочных метастатических опухолей. Один 5% СО 2 не оказывает влияния на рост опухолей по сравнению с мышами, не подвергавшимися обработке (данные не показаны). Также наблюдают значительное различие в массах легких (Р<0,01) между группой, подвергающейся обработке PEI-р53, и всеми контрольными группами (фигура 13С).

Любые патенты или публикации, упомянутые в данном описании, являются характерными для уровня квалификации опытных специалистов в области техники, к которой относится изобретение. Данные патенты и публикации включены в данное описание в качестве ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация была конкретно и особенно определена для включения в качестве ссылки.

Специалист в данной области легко определит, что данное изобретение достаточным образом приспособлено для осуществления поставленных целей и задач, а также для обеспечения упомянутых преимуществ, а также присущих им аспектов. Настоящие примеры наряду со способами, методиками, обработками, молекулами и конкретными соединениями, описанными в данном документе, в настоящий момент представляют предпочтительные воплощения, они являются иллюстративными и их не следует рассматривать как ограничивающие объем изобретения. Изменения, а также другие применения, могут быть осуществлены специалистами в данной области без отступления от сущности изобретения, определяемой объемом формулы изобретения.

Источники информации 

1. Persons et al., Airway deposition of hygroscopic heterodispersed aerosols: results of a computer model. J. Appl. Physiol.63: 1195-1204 (1987).

2. Persons et al., Maximization of pulmonary hygroscopic aerosol deposition.J.Appl.Physiol.63: 1205-1209 (1987).

3. Schlenker, E.H.Ventilation and metabolism of the djungarian hamster (Phodopus sungorus) and the albino mouse. Comp, Biochem. Physiol. 82A:293-295 (1985).

4. Nielsen, et al., Ventilation, CO2 Production, and CO2 exposure effects in conscious, restrained CF-1 mice.Pharmacol. Toxicol. 72: 163-168 (1993).

5. Goldring, et al., Respiratory adjustment to chronic alkalosis in man. J. Clin. Inv.47: 188-202.

6. Stegen.et al., Biological Psychology 49: 109-122 (1998).

7. Hallman, M., et al., Inositol Supplementation In Premature Infants with Respiratory Distress Syndrome, N. Eng. J. Med. 326: 1233-1239 (1992).

8. Knight, V., Viral and Mycoplasmal Infections of the Respiratory Tract.1973, Lea.and Febiger, Phila.Pa., pp.2.

9. Kay, В., Allergy and Allergic Diseases, Blackwell Publications.Oxford, England, Vol.I, pp.730-741 (1997).

10. Burke, et al., Liposomal stabilization of camptothecin's lactone ring. J. Am. Chem. Soc. 114:8318 (1992).

11. Cabanes et al., Comparative in vivo studies with paclitaxel and liposome-encapsulated paclitaxel. Int. J. Oncol. 12: 1035 (1998).

12. Daoud, et al., Antitumor effect of liposome-incorporated camptothecin in human malignant xenografts. Anticancer Drugs 6: 83 (1995). 

13. Davis, J.N and Staag. D. Interrelationships of the volume and time components of individual breaths in resting man. J. Physiol. 245: 481 (1975).

14. Gottschalk, et al., Fundamental investigations for the deposition of aerosols from radioactive solutions in the upper and lower airways. Z.Erkr Atmungsorgane 153: 355 (1979).

15. Hershey, et al., Inhalation chemotherapy for macroscipic primary or metastatic lung tumors: proof of principle using dogs with spontaneously occuring tumors as a model. Clin. Cancer Res. 5: 2653 (1999).

16. Knight et al., Anticancer effect of 9-nitrocamptothecin liposome aerosol on human cancer xenografts in nude mice. Cancer Chemother.Pharmacol. 44: 177 (1999).

17. Koshkina, et al., Distribution of camptothecin after delivery as a liposome aerosol or following intramuscular injection in mice. Cancer Chemother. Pharmacol. 44: 187 (1999). 

18. Koshkina, et al., 9-Nitrocamptothecin liposome aerosol treatment of melanoma and osteosarcoma lung metastases in mice. Clin. Cancer Res. (in press).

19. Mortola, J.P. and Lanthier, C. Theventilatory and metabolic response to hyprcapnia in newborn mammalian species. Respiration Physiol. 103:263.

20. Nielsen, et al., Ventilation, CO2 production, and CO2 exposure effects in conscious, restrained CF-1 mice.Phrmcol Toxicol.72:163 (1993).

21. Rajkumar, S.V.and Adjei, A.A. A review of the pharmacology and clinical activity of new chemotherapeutic agents in lung cancer. Cancer Treat Rev. 24: 35-3 (1998).

22. Rowinsky, E.K.and donehower, R.C. Drug therapy: puclitaxel (Taxol). N.Engl.J.Med.332: 1004 (1995).

23. Sharma, et al., Activity of paclitaxel liposome formulations against human ovarian tumor xenografts. Int. J. Cancer 71: 103 (1997).

24. Socinski, M.A. Single-agent paclitaxel in treatment of advanced non-small lung cancer. Oncologist 4: 408 (1999).

25. Stehlin, et al., Phase I clinical trial and pnarmacokinetics results with oral administration of 20-(S)-camptothecin. In: Potmesil M., Pinedo, H., eds. Camptothecins, new anticancer agents. CRC Press. Boca Raton, FL: 59 (1995).

26. Steward, W.P.and Dunlop, D.J. New drugs in the treatment of non-small cell cancer. Ann. Oncol. 6: S49 (1995).

27. Sugarman, et al., Lipid-complexed camptothecin: formulation andinitial biodistribution and antitumor activity studies. Cancer Chemoiher. Parmacol. 37: 531 (1996). 

28. Verschraegen, et al., A phase I clinical and pharmacological study of oral 9-nitrocamptothecin, a novel water-insoluble topoisomerase I inhibitor. Anti-Cancer Drugs 9: 36 (1998).

29. Vidgren, el al., A study of 99mtechnetium-labelled beclomethasone dipropionate dilauroylphosphatidylcholine liposome aerosol in normal volunteers. Int. J. Pharm. 115: 209 (1995).

30. Waldrep, et al., Operating characteristics of 18 different continuous-flow jet nebulizers with beclomethasone dipropionate liposome aerosol. Chest 105: 106 (1994).

31. Waldrep, et al., High dose cyclosporin A and budesonide-liposome aerosols. Int. J. Pharm.12:27 (1997). 

32. Yamashiro, et al., Total work rate of breathing optimization in CO2-inhalation and exercise. J. Appl. Physiol. 38: 702 (1975).

33. Templeton et al., Improved DNA:liposome complexes for increased systemic delivery and gene expression. Nat. Biotechnol. 15: 647-652 (1997).

34. Eastman, S.J., et al., A concentrated and stable aerosol formulation of cationic lipid:DNA complexes giving high level gene expression in mouse lung. Hum. Gene Ther.8: 165-773 (1997).

35. Li, S., and Huang, L., In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-orotamine-DNA (LPD) complexes. Gen. Ther. 4:891-900 (1997).

36. Boussif, О., et al., A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivi: Polyethyleneimine.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92: 7297-7301 (1995).

37. Godbey, et al., Tracking the intracellular path of poly (ethylenimine)/DNA complexes for gene therapy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5177-5181 (1999).

38. Ferrari, et al., Polyethylenimine shows properties of interest for cystic fibrosis gene therapy. Biochim. Biophys. Acta 1447: 219-225 (1999). 

39. Goula, et al., Polyethylenimine-based intravenous delivery of transgenes to mouse lung. Gene Ther. 5: 1291-1295 (1998).

40. Abdallah, et al., A powerful nonviral vector for in vivo gene transfer into the adult mammalian brain: Polyethylenimine. Hum. Gene. Ther. 7: 1947-1954 (1996).

41. Boleta. et al., Nonviral gene delivery to rat kidney with polyethyleneimine. Hum. Gene. Ther. 8: 1243-1251 (1997).

42. Coil, et al., In vivo delivery to tumors f DNA complexed with linear polyethylenimine. Hum. Gene Ther. 10: 1659-1666 (1999).

43. Schwartz, et al..Delivery of DNA-cationic liposome complexes by small particle aerosol. Hum. Gene Ther. 7: 731-741 (1996).

44. Densmore, C.L., et al. Aerosol delivery of robust polyethyleneimine-DNA complexes for gene therapy and genetic immunization. Mol. Ther.1: 180-188 (2000).

45. Densmore, et al., Gene transfer by guanidium-cholesterol: dioleoylphosphatidyl-ethanolamine liposome-DNA complexes in aerosol. J. Gene Med. 1: 251-264 (1999).

46. Ernst, N., et al., Interactions of liposomal and polycationic transfection complexes with pulmonary surfactant. J. Gene Med. 1: 331-340 (1999).

47. Liu, et al., Cationic liposome-mediated intravenous gene delivery. J. Biol. Chem. 270: 24864-24870 (1995). 

48. Koshkina, et al., Distribution of camptothecin after delivery as a liposome aerosol or following intramuscular infection in mice. Cancer Chemother. Pharmacol. 44: 187-192 (1999).

49. Vidgren, M. et al. A study of 99mtchnetium-labeled beclomethasone dipropionate dilauroylphosphatidylcholine liposorne aerosol in normal volunteers. Int. J. Pharm. 115: 209-216 (1995).

50. Knight, et al., Anticancer effect of 9-nitrocamptothecin liposome aerosol on human cancer xenografts in nude mice. Cancer Chemother. Pharmacol. 44: 177-186 (1999).

51. Goldblum, et al., Lung myeloperoxidase as a measure of pulmonary leukostasis in rabbits. J.Appl/Physiol. 59: 1978-1985 (1985).

52. Schlenker, E.H.Ventilation and metabolism of the djungarian hamster (phodopus sungorus) and the albino mouse.Сотр. Biochem. Physiol 82A: 293-295 (1985).

53. Nielsen. et al., Ventialtion, CO2 production and СО2 exposure effects in conscious, restrained CF-1 mice. Pharmacol. Toxicol. 72: 163-168 (1993). 

54. Goldring. et al., Respiratory adjustment to chronic metabolic alkalosis in man. J. Clin. Invest. 47: 188-202 (1968). 

55. Goldring, et al., Regulation of alveolar ventilation in respiratory failure. Am. J. Med.Sci. 269: 160-170 (1975).

56. Bagonzi, A., et al.Comparison between cationic polymers and lipids in mediating systemic gene delivery to the lungs. Gene Ther. 6: 1995-2004 (1999).

57. Lee, E.R., et al.Detailed analysis of structure and formulations of cationic lipids for efficient gene transfer to lung. Hum. Gene ther.7: 1701-1717 (1996).

58. Meyer, et al., Intratracheal gene delivery to mouse airway: Characterization of plasmid DMA expression and pharmacokinetics. Gene Ther. 2: 450-460 (1995).

59. Fidler. I.J., and Nicolson. G.L.Tumor cell and host properties affecting the implantation and survival of blood-borne metastatic variants of B16 melanoma. Isr. J. Med. Sci. 14:35-50 (1973).




ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


1. Способ увеличения осаждения в дыхательных путях человека или животного лекарственного средства, вводимого в виде аэрозоля, включающий стадию введения указанного лекарственного средства в виде аэрозоля в воздушной смеси, содержащей приблизительно от 2,5% до приблизительно 10% газообразного диоксида углерода. 

2. Способ по п.1, где указанная воздушная смесь содержит приблизительно 2,5% газообразного диоксида углерода.

3. Способ по п.1, где указанная воздушная смесь содержит приблизительно 5% газообразного диоксида углерода.

4. Способ по п.1, где указанная воздушная смесь содержит приблизительно 7,5% газообразного диоксида углерода.

5. Способ по п.1, где указанный аэрозоль вводят в течение периода времени, составляющего приблизительно от 1 мин до приблизительно 30 мин.

6. Способ по п.1, где указанное лекарственное средство вводят в виде аэрозоля с помощью струйного распылителя.

7. Способ по п.1, где указанным лекарственным средством является лекарственное средство, растворимое в воде или буфере.

8. Способ по п.7, где указанное лекарственное средство, растворимое в воде или буфере, выбирают из группы, состоящей из антибиотика, муколитика, бронхолитического средства, парасимпатического агента, фермента и антивирусного агента.

9. Способ по п.1, где указанным лекарственным средством является нерастворимое лекарственное средство, доставляемое посредством носителя.

10. Способ по п.9, где указанный носитель выбирают из группы, состоящей из липосомы, полимера с замедленным высвобождением и поликатионного полимера.

11. Способ по п.10, где указанная липосома является традиционой липосомой или стерически стабилизированной липосомой, полученной из модифицированных фосфолипидов.

12. Способ по п.11, где указанную традиционную липосому получают из липида, включающего фосфатидилхолин.

13. Способ по п.12, где указанный фосфатидилхолин представляет собой дилауроилфосфатидилхолин. 

14. Способ по п.11, где указанную стерически стабилизированную липосому получают из фосфолипидов, модифицированных полиэтиленгликолем. 

15. Способ по п.14, где указанный модифицированный фосфолипид представляет собой димиристилфосфоэтаноламин-полиэтиленгликоль 2000.

16. Способ по п.10, где указанная липосома несет липофильное лекарственное средство в липосомальной лекарственной форме.

17. Способ по п.16, где указанное липофильное лекарственное средство выбрано из группы, состоящей из амфотерицина В, нистатина, глюкокортикоидов и иммунодепрессантов.

18. Способ по п.17, где указанное средство выбрано из группы, состоящей из камптотецина, производных камптотецина и паклитаксела.

19. Способ по п.1, где указанное средство выбрано из группы, состоящей из терапевтических белков, терапевтических пептидов, ДНК генов, смысловых олигонуклеотидов, антисмысловых олигонуклеотидов и вирусных векторов.

20. Способ по п.19, где указанный ген ДНК представляет собой ген хлорамфениколацетилтрансферазы или р53.

21. Способ по п.19, где указанный ген ДНК доставляется посредством поликатионного полимерного носителя или катионной липосомы.

22. Способ по п.21, где указанным поликатионным полимером является полиэтиленимин. 

23. Способ по п.22, где соотношение азота полиэтиленимина к фосфату ДНК (азот:фосфат) составляет от приблизительно 10:1 до приблизительно 20:1.

24. Способ по п.23, где указанное соотношение азота полиэтиленимина к фосфату ДНК составляет 10:1.