СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЖИВЫХ ОРГАНИЗМОВ

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЖИВЫХ ОРГАНИЗМОВ


RU (11) 2242763 (13) C1

(51) 7 G01N33/53 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 26.07.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2004.12.20 
(21) Регистрационный номер заявки: 2003107776/15 
(22) Дата подачи заявки: 2003.03.12 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2003.03.12 
(45) Опубликовано: 2004.12.20 
(56) Аналоги изобретения: Гематология детского возраста: Руководство для врачей. /Под ред. Н.А.Алексеева. - СПб.: Гиппократ, 1998, с.97-105. Иммунологические методы исследования. - М.: Мир, 1988, с.502 и 503. Иммуногенетика человека. Т.1. - М.: Мир, 1994, с.155-175. 
(72) Имя изобретателя: Нишева Е.С. (RU); Галустян А.Н. (RU) 
(73) Имя патентообладателя: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия (RU) 
(98) Адрес для переписки: 194100, Санкт-Петербург, ул. Литовская, 2, Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия, патентная служба, О.В. Железняковой 

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЖИВЫХ ОРГАНИЗМОВ
Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, аллергологии, пульмонологии, дерматологии, инфекционной микробиологии, а также ветеринарии. Сущность: создание способа, позволяющего исключить возможность получения ложнозавышенных и ложнозаниженных результатов определения за счет создания условий для сохранения in vitro функциональных свойств нейтрофилов каждого конкретного организма. При этом производят забор крови с антикоагулянтом у обследуемого организма. Осуществляют приготовление смеси для исследования фагоцитоза, содержащей лейкоциты и объект фагоцитоза, в ходе которого сначала вносят объект фагоцитоза в кровь с антикоагулянтом не позднее чем через 30 мин после ее забора, после чего заполняют полученной смесью два капилляра. Производят обработку смеси для исследования фагоцитоза путем инкубации при температуре 37°С каждого из капилляров, причем один из капилляров инкубируют в течение 30 мин, а другой - в течение 2 ч, и центрифугирования каждого из указанных капилляров в течение 10 мин при 1500 об/мин. Непосредственно после центрифугирования производят выделение лейкоцитов путем разъединения каждого из капилляров на границе размещения осадка лейкоцитов и осадка эритроцитов и извлечения осадка лейкоцитов из соответствующей части каждого из разъединенных капилляров. Приготавливают мазки из осадков лейкоцитов, полученных после центрифугирования. Определяют на каждом из мазков число нейтрофилов, вступивших в фагоцитоз, и общее число поглощенных нейрофилами микробов. Рассчитывают показатели фагоцитоза, в качестве которых используют: фагоцитарный индекс, фагоцитарное число, коэффициент фагоцитарного числа и индекс бактерицидности нейтрофилов. Сопоставляют полученные значения показателей фагоцитоза с нормальными величинами и по результатам сопоставления делают вывод о наличии или об отсутствии нарушений фагоцитарной активности нейтрофилов исследуемой периферической крови. Технический результат - расширение арсенала способов оценки фагоцитарной активности крови. 1 з.п.ф-лы, 8 табл.




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, аллергологии, пульмонологии, дерматологии, инфекционной микробиологии, ветеринарии, и может быть использовано при оценке иммунного статуса здорового и больного организма.

Известен способ определения фагоцитарной активности лейкоцитов у больных и здоровых людей [1]. Постановку реакции фагоцитоза согласно способу-аналогу осуществляют следующим образом. В ходе приготовления смеси для исследования фагоцитоза в видалевскую пробирку наливают 0,1 мл 2%-ного лимоннокислого натрия, 0,2 мл исследуемой крови и 0,1 мл взвеси тест-микроба, в качестве которого используют лабораторный штамм стафилококка №209 либо В.mesenthericus (суточная агаровая культура по стандарту) в концентрации 400 млн микробных тел в 1 мл (объект фагоцитоза). Все компоненты тщательно смешивают, после чего производят обработку полученной смеси для исследования фагоцитоза. При этом пробирку помещают на 30 мин в термостат (37°С). После инкубации пробирку со смесью центрифугируют в течение 3 мин при 1000 об/мин. Затем из верхнего слоя осадка готовят мазки, которые фиксируют смесью Никифорова (равные части спирта и эфира) и окрашивают по Романовскому-Гимзе. Под микроскопом просматривают 100 лейкоцитов (общее число лейкоцитов) и подсчитывают общее число поглощенных лейкоцитами микробов. Производят расчет показателей фагоцитоза, в качестве которых используют 2 показателя:

1. Процент фагоцитирующих лейкоцитов, т.е. количество лейкоцитов из 100, проявивших фагоцитарную активность (данный показатель соответствует по смыслу показателю "фагоцитарный индекс", определение которого вводится ниже по тексту при описании способа-прототипа).

2. Фагоцитарное число, т.е. число микробов, поглощенных в среднем одним лейкоцитом.

Для здоровых лиц процент фагоцитирующих лейкоцитов составляет 50-70%, а фагоцитарное число - 2,0-4,0.

Известный способ-аналог [1] не обеспечивает достижения технического результата заявленного способа в связи со следующим. Предусмотренный методикой способа-аналога временной параметр режима инкубирования смеси для исследования фагоцитоза (30 мин) позволяет определять только два показателя фагоцитоза: фагоцитарный индекс (после 30-минутной инкубации) и фагоцитарное число (после 30-минутной инкубации). Указанные показатели отражают поглотительную способность нейтрофилов на начальной стадии фагоцитоза. Отсутствие возможности исследования завершающей стадии фагоцитоза (например, после 2-часовой инкубации) обусловливает невозможность определения таких важных показателей фагоцитоза, как коэффициент фагоцитарного числа и индекс бактерицидности нейтрофилов (для расчета которых используются, в частности, показатели, определяемые на мазках, приготовленных из осадков 2-часовой инкубации). Коэффициент фагоцитарного числа отражает поглотительную способность нейтрофилов на завершающей стадии фагоцитоза, а индекс бактерицидности нейтрофилов - способность фагоцита переваривать захваченные микробы на завершающей стадии фагоцитоза. Оба указанных показателя входят в совокупность показателей фагоцитоза, каждый из которых необходим, а вместе взятые достаточны для того, чтобы обеспечить адекватность оценки реакции фагоцитоза. Это обусловлено, в частности, следующими причинами. Нарушения процесса фагоцитоза могут быть дискретными и затрагивать как комплексно, так и изолированно разные стадии фагоцитоза (хемотаксис, адгезию к микробу, поглощение, переваривание микробов). В связи с этим отсутствие учета показателей, отражающих процесс фагоцитоза в динамике, сводит к минимуму в целом ряде случаев вероятность выявления нарушений в системе фагоцитоза. Кроме того, невозможность оценки бактерицидности нейтрофилов не позволит выявить заболевания с преимущественными нарушениями бактерицидности (такие, как синдром Чедиака-Хигаси и хронический гранулематоз), а также заболевания, в которых нарушения фагоцитоза (в т.ч. нарушения бактерицидности) могут играть ведущую патогенетическую роль (пиодермии; аденофлегмоны; абсцедирующие пневмонии; длительно незаживающие раны; послеоперационные осложнения; вторичные иммунодефициты, вызванные лекарственной терапией и т.п.). Оценка реакции фагоцитоза у таких больных необходима для выбора тактики терапии, поскольку такие же клинические проявления могут быть обусловлены нарушениями в других звеньях иммунитета (таких, как система комплимента, выработка антител). В этой связи методика способа-аналога [1] является принципиально непригодной для оценки фагоцитарной активности нейтрофилов при целом ряде заболеваний (заведомо ошибочные результаты определения).

Методика способа-аналога [1] не предусматривает предварительного разделения лейкоцитов и эритроцитов и выделения лейкоцитов как специальных операций в ходе приготовления смеси для исследования фагоцитоза. Разделение лейкоцитов и эритроцитов производят на стадии обработки смеси для исследования фагоцитоза путем центрифугирования указанной смеси (т.е. после прерывания реакции фагоцитоза на начальной стадии). Используемый в способе-аналоге режим центрифугирования (3 мин при 1000 об/мин) не обеспечивает полного осаждения лейкоцитов, значительная часть их остается в супернатанте. Так, эксперименты авторов изобретения показали, что зависимость количества лейкоцитов в супернатанте от времени центрифугирования (при 1000 об/мин) выглядит следующим образом: 



Согласно способу-аналогу выделение лейкоцитов производят после центрифугирования смеси для исследования фагоцитоза путем отсасывания лейкоцитарной пленки, находящейся на слое эритроцитов. При малой продолжительности центрифугирования (3 мин) указанную пленку образуют прежде всего нейтрофилы, поглотившие микробы (т.е. клетки с большим весом), а нейтрофилы, не вступившие в фагоцитоз (с меньшим весом), могут оставаться в супернатанте. Все это существенно снижает точность определения фагоцитарной активности лейкоцитов. Кроме того, отделение лейкоцитов от эритроцитов путем отсасывания не обеспечивает возможности изолированного выделения лейкоцитов - всегда будет иметь место значительная примесь эритроцитов (эксперименты авторов предложенного способа показали, что при подобной постановке реакции фагоцитоза примесь эритроцитов в мазках может составлять до 360 эритроцитов на 1 лейкоцит). Это существенно усложняет микроскопическую оценку результатов реакции, увеличивая тем самым ее продолжительность. Высокая вероятность травматизации лейкоцитов о дно и стенки пробирки (при перемешивании смеси для исследования фагоцитоза в ходе центрифугирования) обусловливает относительно высокий процент гибели указанных клеток, а также возникновение различных нарушений их функциональных свойств, в т.ч. свойств, ответственных за фагоцитоз, что также снижает точность анализа.

Таким образом, особенности постановки реакции фагоцитоза с использованием способа-аналога [1] обусловливают ограниченную область применения методики (вследствие принципиальной невозможности адекватной оценки результатов реакции при целом ряде заболеваний), а также относительно низкую точность определения фагоцитарной активности лейкоцитов в случаях, когда оценка фагоцитоза с помощью способа-аналога принципиально возможна.

В современных базисных руководствах по иммунологическим методам исследования [2; 3] рекомендуется для широкой лабораторной практики использовать методики, предусматривающие исследование процесса фагоцитоза в полном объеме, с оценкой как начальных, так и завершающих стадий реакции. Кроме того, указанные руководства, как правило, предусматривают предварительное разделение эритроцитов и лейкоцитов с последующим выделением лейкоцитов как специальные операции в ходе приготовления смеси для исследования фагоцитоза.

Наиболее близким к заявленному решению по совокупности существенных признаков является способ определения фагоцитарной активности нейтрофилов /ФАН/ периферической крови у больных и здоровых людей [4]. Способ, принятый за прототип, включает следующие стадии. Производят забор крови с антикоагулянтом у обследуемого пациента. При этом в стерильную пробирку с заранее внесенным раствором 0,6 мл гепарина, разведенного 1:10, вносят 10 мл крови из кубитальной вены. Осуществляют приготовление смеси для исследования фагоцитоза. При этом сначала производят разделение лейкоцитов и эритроцитов с последующим выделением лейкоцитов. В ходе указанной операции кровь тщательно перемешивают и центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин. Плазму вместе со слоем лейкоцитов осторожно отсасывают и помещают в чистую центрифужную пробирку, добавляя 5-6 мл среды 199. Лейкоциты отмывают центрифугированием в течение 10 мин при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют, а находящиеся в осадке лейкоциты ресуспендируют в среде 199 дважды, каждый раз повторяя процедуру "мягкого" центрифугирования. После последнего центрифугирования пипеткой отсасывают надосадочную жидкость и часть клеточной взвеси, оставив в центрифужной пробирке 0,2 мл клеточной взвеси в среде 199. Затем в пробирку, содержащую 0,2 мл лейкоцитов в среде 199, вносят 0,3 мл микробной взвеси, в качестве которой используют взвесь стафилококков (суточная агаровая культура Staphylococcus epidermidis штамм 9198 по стандарту) в концентрации 1 млрд микробных клеток в 1 мл (объект фагоцитоза), после чего добавляют 0,15 мл пула свежих донорских сывороток АВ (IV) группы (опсонизирующий фактор). Осторожным ротированием перемешивают компоненты, после чего производят обработку полученной смеси для исследования фагоцитоза. В ходе указанной стадии полученную смесь термостатируют 30 мин при 37°С. По истечении указанного времени в пробирку добавляют 5 мл прогретого до 37°С изотонического раствора натрия хлорида, встряхивают и центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин. По окончании центрифугирования надосадочную жидкость удаляют и делают мазки из лейкоцитарной взвеси, остатки которой вновь помещают в термостат при 37°С для продолжения инкубации еще в течение 90 мин (суммарное время инкубации 120 мин). Затем мазки приготавливают повторно из осадка двухчасовой (120-минутной) инкубации.

Мазки из осадков лейкоцитов (после 30-минутной и 120-минутной инкубации) готовят на обезжиренных предметных стеклах. Приготовленные мазки сушат на воздухе, затем фиксируют 10 мин в абсолютном метиловом спирте и красят по Романовскому-Гимзе азур-эозином. После окрашивания мазки просматривают под микроскопом в иммерсионной системе: считают не менее 200 клеток (общее число нейтрофилов). Определяют на каждом из мазков число нейтрофилов, вступивших в фагоцитоз, и общее число поглощенных нейтрофилами микробов. Производят расчет показателей фагоцитоза, в качестве которых используют следующие:

1. Фагоцитарный индекс /ФИ/, определяемый по формуле:



2. Фагоцитарное число /ФЧ/ - среднее число микробов, находящихся в 1 нейтрофиле (внутриклеточно), которое определяют по формуле: 



Оба показателя (ФИ и ФЧ) рассчитывают на мазках, сделанных после 30-минутной и 120-минутной инкубации (соответственно ФИ30 и ФИ120; ФЧ30 и ФЧ120).

3. Коэффициент фагоцитарного числа (КФЧ), определяемый по формуле:



4. Индекс бактерицидности нейтрофилов /ИБН/, определяемый по формуле:



где ИБН-индекс бактерицидности нейтрофилов, %,

Ч у - число убитых внутри нейтрофилов микробов;

Чп - общее число поглощенных нейтрофилами микробов. 

5. Опсонический индекс поглощения /ОИП/, определяемый по формуле:



Сопоставляют полученные значения показателей фагоцитоза с нормальными величинами, которые в соответствии с данными работы [4] составляют:



По результатам сопоставления устанавливают наличие или отсутствие изменений каждого из исследуемых показателей фагоцитоза по сравнению с нормой. При нахождении значений всех исследуемых показателей фагоцитоза в пределах нормы делают вывод об отсутствии нарушений ФАН у обследуемого пациента. При наличии отклонений от нормы хотя бы одного из исследуемых показателей фагоцитоза делают вывод о наличии нарушений ФАН у данного пациента.

Способ-прототип [1] не позволяет получить технический результат, достигаемый при использовании заявленного способа, по следующим причинам. Предусмотренное методикой способа-прототипа предварительное разделение лейкоцитов и эритроцитов и выделение лейкоцитов, с одной стороны, обеспечивает относительно высокую чистоту выделения лейкоцитов, способствуя созданию оптимальных условий для микроскопической оценки результатов реакции. Однако, с другой стороны, предварительное разделение лейкоцитов и эритроцитов исключает возможность формирования в ходе центрифугирования "эритроцитарной подушки", которая может выполнять функцию буфера, препятствуя контакту лейкоцитов с дном пробирки. При этом процедура предварительного разделения форменных элементов крови сама по себе сопряжена с многократным центрифугированием (центрифугирование плазмы с лейкоцитами при приготовлении лейкоцитарной взвеси, неоднократное центрифугирование взвеси лейкоцитов при отмывании). В этих условиях в ходе каждого центрифугирования смеси, содержащей лейкоциты (как на стадии приготовления смеси для исследования фагоцитоза - в ходе предварительного разделения лейкоцитов и эритроцитов, так и на стадии обработки указанной смеси), в отсутствии "эритроцитарной подушки" все лейкоциты, контактируя со стенками пробирки, оседают на ее дно. Травматизация лейкоцитов о дно и стенки пробирки в процессе центрифугирования может приводить к возникновению нарушений их функциональных свойств различной степени выраженности (в т.ч. свойств, ответственных за фагоцитоз), а также к гибели указанных клеток. В частности, может иметь место нефизиологичная активация значительного количества лейкоцитов вследствие их адгезии ко дну и к стенкам пробирки. Наличие в способе-прототипе многократного перемешивания смеси, содержащей лейкоциты, как специальной операции (в ходе предварительного разделения форменных элементов крови, перед инкубацией смеси для исследования фагоцитоза в термостате и после инкубации), и в результате непроизвольного встряхивания пробирки при манипулировании в ходе анализа (при помещении пробирки в термостат и извлечении ее из термостата, при помещении пробирки в центрифугу и извлечении ее из центрифуги, при переносе пробирки с места на место и т.п.) также существенно увеличивает возможность травматического контакта лейкоцитов с дном и стенками пробирки. Все это значительно увеличивает вероятность получения ложнозавышенных и ложнозаниженных результатов реакции, существенно снижая точность определения ФАН.

Предварительное разделение лейкоцитов и эритроцитов, в ходе которого происходит удаление аутологичной плазмы крови, приводит к удалению содержащихся в плазме аутологичных факторов. Это обусловливает необходимость внесения в смесь для исследования фагоцитоза опсонизирующего фактора - донорской сыворотки, которая наряду с факторами, улучшающими фагоцитоз, может содержать цитотоксические факторы, повреждающие лейкоциты. В результате этого могут изменяться функциональные свойства лейкоцитов (в т.ч. может иметь место подавление или активация фагоцитоза) и снижаться их жизнеспособность. Это также может способствовать получению ложнозавышенных и ложнозаниженных результатов реакции и снижать точность определения ФАН.

Задачей изобретения является создание способа определения фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови живых организмов, позволяющего исключить возможность получения ложнозавышенных и ложнозаниженных результатов определения за счет создания условий для сохранения in vitro функциональных свойств нейтрофилов каждого конкретного организма, ответственных за фагоцитоз, а также их жизнеспособности на уровне, соответствующем или приближающемся к индивидуально присущему данному организму уровню in vivo, путем устранения механических физико-химических, биологических и/или иммунологических факторов, оказывающих негативное воздействие на процессы хемотаксиса и адгезии нейтрофилов, на процессы поглощения и переваривания ими микробов, а также обусловливающих гибель указанных клеток. 

Поставленная задача решается тем, что в способе определения ФАН периферической крови живых организмов, включающем забор крови с антикоагулянтом; приготовление смеси для исследования фагоцитоза, содержащей лейкоциты и объект фагоцитоза, включая выделение лейкоцитов; обработку смеси для исследования фагоцитоза, включая ее инкубацию в течение 2 ч при температуре 37°С и центрифугирование после 30 мин инкубации и после 2 ч инкубации в течение 10 мин при 1500 об/мин; приготовление мазков из полученных после центрифугирования осадков тридцатиминутной и двухчасовой инкубации с последующим их фиксированием и окрашиванием; определение на каждом из мазков числа нейтрофилов, вступивших в фагоцитоз, и общего числа поглощенных нейтрофилами микробов, расчет показателей фагоцитоза и сопоставление полученных значений показателей фагоцитоза с нормальными величинами, по результатам которого делают вывод о наличии или об отсутствии нарушений ФАН исследуемой периферической крови, согласно изобретению в ходе приготовления смеси для исследования фагоцитоза сначала вносят объект фагоцитоза в кровь с антикоагулянтом не позднее чем через 30 мин после ее забора, после чего заполняют полученной смесью для исследования фагоцитоза два капилляра. Обработку смеси для исследования фагоцитоза производят путем инкубации при температуре 37°С каждого из капилляров, содержащих указанную смесь, причем один из капилляров инкубируют в течение 30 мин, а другой - в течение 2 ч, и центрифугирования каждого из указанных капилляров в течение 10 мин при 1500 об/мин. Выделение лейкоцитов производят непосредственно после центрифугирования путем разъединения каждого из капилляров на границе размещения осадка лейкоцитов и осадка эритроцитов и извлечения осадка лейкоцитов из соответствующей части каждого из разъединенных капилляров. Приготовление мазков осуществляют из осадков лейкоцитов, полученных из каждого из разъединенных капилляров. В качестве показателей фагоцитоза используют фагоцитарный индекс, фагоцитарное число, коэффициент фагоцитарного числа и индекс бактерицидности нейтрофилов. Наиболее эффективным является использование в ходе приготовления смеси для исследования фагоцитоза и ее обработки капилляров с внутренним диаметром 0,2-0,8 мм.

Выбор и обоснование оптимальных характеристик причинно-значимых параметров заявленного способа (т.е. параметров, влияющих на достижение технического результата) осуществляли следующим образом. В качестве причинно-значимых параметров рассматривали:

время от момента забора крови у живого организма до внесения объекта фагоцитоза в кровь с антикоагулянтом (количественный параметр, отражающий условие осуществления действия);

режимы и условия осуществления обработки смеси для исследования фагоцитоза и последующего выделения лейкоцитов как основной фактор, обеспечивающий возможность разделения лейкоцитов и эритроцитов непосредственно в ходе реакции фагоцитоза, а также как фактор оптимизации комплексного действия в отношении условий сохранения функциональных свойств нейтрофилов, в т.ч. ответственных за фагоцитоз, и жизнеспособности указанных клеток.

Выбор оптимального времени от момента забора крови у живого организма до внесения объекта фагоцитоза в кровь с антикоагулянтом осуществляли путем варьирования временного параметра на фоне оптимальных характеристик других параметров заявленной совокупности (т.е. при оптимальных режимах и условиях выполнения действий на стадии обработки смеси для исследования фагоцитоза и действия "выделение лейкоцитов"). При этом у 20 практически здоровых детей в возрасте от 3 до 15 лет брали по 0,6 мл крови из пальца и вносили в пробирки (исходные) с заранее внесенным 5%-ным раствором цитрата натрия (в количестве 0,15 мл на пробирку). Из каждой исходной пробирки (содержащей кровь одного ребенка) отбирали по 6 образцов крови с антикоагулянтом (по 0,1 мл) в отдельные пробирки (6 опытных пробирок). В каждую из опытных пробирок, содержащую образец крови с антикоагулянтом, вносили по 0,05 мл взвеси стафилококков (суточная агаровая культура Staphylococcus epidermidis шт. 9198 по стандарту) в концентрации 1 млрд микробных клеток в 1 мл (объект фагоцитоза) в различные сроки от момента забора крови у обследуемого ребенка: в 1-ю, 2-ю, 3-ю, 4-ю, 5-ю и 6-ю опытные пробирки соответственно, через 5, 15, 30, 45, 60 и 120 мин после взятия крови. Нижняя граница (5 мин) исследуемого интервала, установленная по результатам хронометрирования авторов изобретения, представляла собой минимальное время, необходимое для доставки крови обследуемого ребенка из процедурного кабинета в лабораторию и последующего отбора образцов крови с антикоагулянтом из исходной пробирки в опытные. Таким образом, исследование фагоцитоза производили с использованием образцов крови с различными сроками хранения (перед внесением объекта фагоцитоза). Заполняли полученной в каждой из опытных пробирок смесью для исследования фагоцитоза по два капилляра с внутренним диаметром 0,8 мм и дальнейшую обработку указанной смеси, приготовление мазков и определение клеточных показателей, необходимых для последующего расчета показателей фагоцитоза, проводили в соответствии с методикой заявленного способа.

Для каждой из опытных пробирок определяли ФИ (ФИ30 и ФИ120) по формуле (1) и ФЧ (ФЧ30 и ФЧ120) по формуле (2) (результирующие показатели для сравнительного анализа), сопоставляли их с нормальными величинами, приведенными в работе [4], и устанавливали наличие или отсутствие изменений каждого из исследуемых показателей фагоцитоза по сравнению с нормой.

Кроме того, оценивали жизнеспособность нейтрофилов методом исключения трипанового синего по методике, приведенной в работе [5, с.50]. При этом 10 мкл лейкоцитарной взвеси, полученной после разъединения каждого из капилляров 30- и 120-минутного сроков инкубации (для каждого из образцов крови), смешивали с 10 мкл 0,2%-ного раствора трипанового синего на предметном стекле, накрывали покровным стеклом и помещали под микроскоп. Подсчитывали число голубых клеток (погибших клеток) и неокрашенных клеток (живых клеток) в процентах от общего числа сосчитанных клеток (считали не менее 100 клеток). Для каждой из опытных пробирок (образцов крови) рассчитывали среднее значение указанных показателей, полученных для капилляров 30- и 120-минутного сроков инкубации. В качестве результирующего показателя для сравнительного анализа использовали процент (среднее значение) погибших нейтрофилов от общего числа сосчитанных клеток.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием критерия Вилкоксона-Манна-Уитни [6].

Результаты исследований приведены в табл.1.

Из данных табл.1 видно, что в образцах крови, в которых время между забором крови у обследуемого ребенка и внесением объекта фагоцитоза в кровь с антикоагулянтом варьировало от 5 до 30 мин, значения исследуемых показателей фагоцитоза (ФИ30, ФИ120; ФЧ30, ФЧ120) находились в пределах диапазона нормальных величин при минимальном проценте погибших нейтрофилов (1,1-2,3%). При этом не отмечалось статистически достоверных различий между значениями рассматриваемых показателей (показатели фагоцитоза, процент погибших нейтрофилов) образцов крови со сроками хранения 5, 15 и 30 мин (статистическая обработка данных с использованием критерия Вилкоксона-Манна-Уитни). При использовании в ходе приготовления смеси для исследования фагоцитоза образцов крови с антикоагулянтом, хранившихся более 30 мин, отмечалось статистически значимое снижение по сравнению с нормой всех анализируемых показателей фагоцитоза, а также статистически значимое увеличение процента погибших нейтрофилов (6,1-7,5%). При этом установлено, что различия между значениями каждого из рассматриваемых показателей, определенных при постановке реакции с образцами крови предыдущего и последующего сроков хранения, становятся статистически достоверными, начиная с показателей образцов крови 30-45-минутного сроков хранения.

Выбор и обоснование режимов и условий выполнения действий на стадии обработки смеси для исследования фагоцитоза, а также действия "выделение лейкоцитов" осуществляли следующим образом.

Были проведены сравнительные исследования ФАН, определенной при различных режимах и условиях постановки реакции фагоцитоза, у следующих детей:

- у детей с подтвержденными при клинико-лабораторном обследовании нарушениями фагоцитоза в возрасте от 3 до 12 лет (8 чел.);

- у практически здоровых детей в возрасте от 3 до 15 лет (20 чел.).

Распределение обследуемых детей по группам выглядело следующим образом:

1 группа - больные с синдромом Чедиака-Хигаси (4 чел.);

2 группа - больные с хроническим гранулематозом (2 чел.);

3 группа - больные с синдромом Джоба (2 чел.); 

4 группа - практически здоровые дети (20 чел.).

Согласно данным работы [7] синдром Чедиака-Хигаси относится к врожденным иммунодефицитам, сопровождающимся дефектами фагоцитоза, для которых характерно: дефект гранул нейтрофилов, значительное снижение хемотаксиса нейтрофилов, существенное снижение бактерицидности нейтрофилов.

Больные с синдромом Чедиака-Хигаси (которые составили 1-ю группу) были выявлены при обследовании в стационаре Детской городской больницы №1 Санкт-Петербурга /далее - ДГБ №1/ по поводу рецидивирующих тяжелых инфекций (у всех больных наблюдались рецидивирующие пневмонии, отиты). Диагноз был подтвержден характерным клиническим симптомокомплексом: альбинизм, нистагм, нейтропения, гигантские гранулы в лейкоцитах, рецидивирующие тяжелые инфекции. При исследовании хемотаксиса лейкоцитов периферической крови по методике, приведенной в работе [2, с.333-338], у всех больных было выявлено резкое его снижение по сравнению с нормой. При исследовании крови с помощью теста с нитросиним тетразолием, как это описано в работе [3, с.87-88], у всех больных было отмечено резкое снижение (по сравнению с нормой) восстановления нитросинего тетразолия, что свидетельствовало о глубоком дефекте бактерицидности нейтрофилов.

Хронический гранулематоз согласно данным работы [7] относится к врожденным Х-сцепленным иммунодефицитам, для которых характерно снижение бактерицидности нейтрофилов и уменьшение высвобождения ими активных радикалов кислорода.

Больные с хроническим гранулематозом (2 мальчика, которые составили 2-ю группу) были выявлены при обследовании в стационаре ДГБ №1 по поводу рецидивирующих абсцессов мягких тканей и внутренних органов (один больной через 4 года после постановки диагноза погиб после четвертого рецидива абсцессов печени). У обоих больных при исследовании крови с помощью теста с нитросиним тетразолием [3] было установлено резкое снижение бактерицидности нейтрофилов по сравнению с нормой. При исследовании хемотаксиса по методике [2] отклонений от нормы ни у одного из больных не выявлено. Кроме того, диагноз хронического гранулематоза у погибшего больного был подтвержден данными аутопсии. 

Синдром Джоба, по данным работы [7], относится к врожденным иммунодефицитам, сопровождающимся дефектами фагоцитоза. Для подавляющего большинства больных характерно снижение хемотаксиса нейтрофилов при нормальных показателях бактерицидности нейтрофилов и высвобождения ими активных радикалов кислорода.

Больные с синдромом Джоба (которые составили 3-ю группу) были выявлены при обследовании в стационаре ДГБ №1 по поводу "холодных" абсцессов подкожной клетчатки, рецидивирующих лимфаденитов, аденофлегмон, не сопровождающихся гиперемией кожи и повышением кожной температуры; рецидивирующих синопульмональных инфекций; атипичной (стафилококковой) экземы. При исследовании хемотаксиса лейкоцитов периферической крови по методике [2] у обоих больных было выявлено резкое его снижение. Отклонений теста с нитросиним тетразолием [3] по сравнению с нормой не обнаружено ни у одного из больных.

Четвертую группу составили 20 детей, у которых ни в анамнезе, ни при обследовании (в ходе профилактических осмотров на базе поликлинического отделения №41 ДГБ №1) различными клиническими, инструментальными и лабораторными методами отклонений в состоянии здоровья не выявлено. Эта группа получила название "практически здоровых детей". Показатели хемотаксиса и теста с нитросиним тетразолием, определенные по методикам работ [2; 3], у всех детей 4-ой группы находились в пределах диапазона нормальных значений.

В ходе определения ФАН у обследуемых детей брали по 10 мл крови из вены и вносили в пробирки (исходные) с заранее внесенным 5%-ным раствором цитрата натрия (в количестве 2,5 мл на пробирку). Полученную кровь с антикоагулянтом использовали для постановки трех серий опытов: 

I серия опытов - действия на стадии приготовления смеси для исследования фагоцитоза, на стадии обработки указанной смеси (инкубацию, центрифугирование), а также действие "выделение лейкоцитов" производили с использованием режимов и условий, предусмотренных методикой заявленного способа; в качестве рабочих емкостей в ходе приготовления и обработки смеси для исследования фагоцитоза с последующим выделением лейкоцитов использовали капилляры с внутренним диаметром 0,8 мм;

II серия опытов - действия на стадии приготовления смеси для исследования фагоцитоза и на стадии обработки указанной смеси (инкубацию, центрифугирование) производили с использованием режимов, предусмотренных методикой заявленного способа; действие "выделение лейкоцитов" выполняли после центрифугирования смеси для исследования фагоцитоза (согласно методике заявленного способа) с использованием приемов, предусмотренных известными методиками (способа-прототипа [4], способа-аналога [1] и т.п.); в качестве рабочих емкостей в ходе приготовления и обработки смеси для исследования фагоцитоза с последующим выделением лейкоцитов использовали центрифужные пробирки объемом 10 мл;

III серия опытов - действия на стадии приготовления смеси для исследования фагоцитоза (в т.ч. разделение лейкоцитов и эритроцитов и выделение лейкоцитов) и на стадии обработки указанной смеси (инкубацию, центрифугирование) производили с использованием режимов и условий, предусмотренных методикой способа-прототипа; в качестве рабочих емкостей в ходе приготовления и обработки смеси для исследования фагоцитоза использовали центрифужные пробирки объемом 10 мл.

Для постановки I серии опытов из каждой исходной пробирки (содержащей кровь одного обследуемого ребенка) отбирали 0,1 мл в отдельную (опытную) пробирку. В каждую из опытных пробирок, содержащую кровь с антикоагулянтом, через 10 мин после забора крови у обследуемого ребенка вносили 0,05 мл взвеси стафилококков (суточная агаровая культура Staphylococcus epidermidis шт. 9198 по стандарту) в концентрации 1 млрд микробных клеток в 1 мл (объект фагоцитоза). Заполняли полученной смесью для исследования фагоцитоза два капилляра с внутренним диаметром 0,8 мм (рабочие емкости) и дальнейшую обработку указанной смеси, приготовление мазков и определение клеточных показателей, необходимых для последующего расчета показателей фагоцитоза, проводили в соответствии с методикой заявленного способа. По результатам хронометрирования авторов изобретения дополнительно определяли время, затраченное на подсчет на мазках клеточных показателей, необходимых для последующего расчета показателей фагоцитоза /далее - "время на подсчет клеточных показателей"/ (результирующий показатель для сравнительного анализа).

Для каждой из опытных пробирок определяли ФИ (ФИ30 и ФИ120) по формуле (1), ФЧ (ФЧ30 и ФЧ120) по формуле (2), КФЧ по формуле (3) и ИБН по формуле (4) (результирующие показатели для сравнительного анализа). Сопоставляли полученные значения исследуемых показателей фагоцитоза с нормальными величинами, приведенными в работе [4], и по результатам сопоставления судили (как это описано в методике заявленного способа) о наличии или об отсутствии нарушений ФАН периферической крови (нарушений фагоцитоза) у каждого из обследуемых детей. В качестве результирующего показателя для сравнительного анализа использовали количество детей с выявленными нарушениями фагоцитоза.

В ходе просмотра мазков под микроскопом в иммерсионной системе наряду с клеточными показателями, необходимыми для последующего расчета показателей фагоцитоза, дополнительно подсчитывали также общее число эритроцитов в просмотренных полях зрения и определяли число эритроцитов, приходящихся на 1 нейтрофил (результирующий показатель для сравнительного анализа).

Кроме того, для каждой из опытных пробирок оценивали жизнеспособность нейтрофилов методом исключения трипанового синего по методике работы [5] аналогично описанному выше в ходе постановки эксперимента по выбору оптимальных значений причинно-значимого временного параметра. В качестве результирующего показателя для сравнительного анализа использовали процент погибших нейтрофилов от общего числа сосчитанных клеток.

Для постановки II серии опытов из каждой исходной пробирки (содержащей кровь одного ребенка) отбирали 0,1 мл в отдельную (опытную) пробирку. В каждую из опытных пробирок, содержащую кровь с антикоагулянтом, через 10 мин после забора крови у обследуемого вносили 0,05 мл взвеси стафилококков (культура та же, что и в I серии опытов) в концентрации 1 млрд микробных клеток в 1 мл (объект фагоцитоза) и перемешивали компоненты. Распределяли полученную смесь для исследования фагоцитоза на 2 центрифужные пробирки объемом 10 мл (рабочие пробирки) и инкубировали каждую из рабочих пробирок при температуре 37°С: первую - в течение 30 мин, вторую - в течение 120 мин (2 ч). По окончании срока инкубации содержимое каждой из рабочих пробирок перемешивали, затем каждую из рабочих пробирок центрифугировали в течение 10 мин при 1500 об/мин. После окончания центрифугирования отсасывали пастеровской пипеткой пленку лейкоцитов с поверхности осадка эритроцитов, переносили на обезжиренное предметное стекло и готовили мазок. Приготовление мазков и определение клеточных показателей, необходимых для последующего расчета показателей фагоцитоза, проводили в соответствии с методикой заявленного способа.

Результирующие показатели для сравнительного анализа: показатели фагоцитоза (ФИ, ФЧ, КФЧ, ИБН); количество детей с выявленными нарушениями фагоцитоза; процент погибших нейтрофилов от общего числа сосчитанных клеток; число эритроцитов, приходящихся на 1 нейтрофил; время на подсчет клеточных показателей определяли аналогично описанному выше для I серии опытов.

Для постановки III серии опытов оставшуюся кровь в каждой из исходных пробирок (содержащей кровь одного ребенка) перемешивали и центрифугировали 10 мин при 1000 об/мин. Плазму со слоем лейкоцитов отсасывали пипеткой, помещали в чистую центрифужную пробирку и добавляли 10 мл среды 199. Дважды отмывали лейкоциты в среде 199 путем двухкратного центрифугирования в течение 10 мин при 1000 об/мин. После последнего центрифугирования отсасывали надосадочную жидкость, осадок лейкоцитов ресуспендировали в среде 199 до концентрации 10·106 клеток/мл и вносили по 0,2 мл полученной лейкоцитарной взвеси в две центрифужные пробирки объемом 10 мл (рабочие пробирки). В каждую из рабочих пробирок вносили 0,3 мл взвеси стафилококков (культура та же, что и I серии опытов) в концентрации 1 млрд микробных клеток в 1 мл (объект фагоцитоза), после чего добавляли 0,15 мл пула свежих донорских сывороток АВ (IV) группы (опсонизирующий фактор) (время от момента забора крови у обследуемого ребенка до внесения объекта фагоцитоза в лейкоцитарную взвесь составляло по результатам хронометрирования авторов изобретения 35-45 мин). Перемешивали компоненты и инкубировали каждую из рабочих пробирок при температуре 37°С: первую - в течение 30 мин, вторую - в течение 120 мин (2 ч). По окончании срока инкубации в каждую из рабочих пробирок добавляли 5 мл прогретого до 37°С изотонического раствора натрия хлорида, встряхивали и центрифугировали в течение 10 мин при 1500 об/мин. Параллельное проведение инкубации и центрифугирования рабочих пробирок (вместо предусмотренного методикой способа-прототипа последовательного осуществления указанных действий) введено для обеспечения адекватности стабильных (т.е. не подвергающихся варьированию) условий постановки реакции фагоцитоза во всех трех сериях опытов. Указанная модификация не оказывает негативного влияния на значения анализируемых результирующих показателей.

Приготовление мазков и определение клеточных показателей, необходимых для последующего расчета показателей фагоцитоза, проводили в соответствии с методикой заявленного способа.

Результирующие показатели для сравнительного анализа: показатели фагоцитоза (ФИ, ФЧ, КФЧ, ИБН); количество детей с выявленными нарушениями фагоцитоза; процент погибших нейтрофилов от общего числа сосчитанных клеток; число эритроцитов, приходящихся на 1 нейтрофил; время на подсчет клеточных показателей определяли аналогично описанному выше для I серии опытов.

Статистическую обработку результатов во всех трех сериях опытов проводили с использованием критериев Вилкоксона-Манна-Уитни, Фишера [6].

Результаты исследований представлены в табл.2, 3.

Из данных табл.2 видно, что использование заявленного способа (I серия опытов) позволило выявить дефекты фагоцитоза у всех больных, у которых указанные дефекты были предварительно подтверждены при клинико-лабораторном обследовании. При этом с помощью предложенного способа были выявлены дефекты тех звеньев фагоцитоза, которые, как это следует из данных литературы [7], являются характерными для вышеперечисленных заболеваний. Так, у всех больных с синдромом Чедиака-Хигаси (1-я группа) было выявлено значительное снижение по сравнению с нормой показателей ФИ (ФИ30 и ФИ120), ФЧ (ФЧ30 и ФЧ120) и ИБН (различия статистически достоверны) при незначительном (по сравнению с нормой) снижении КФЧ (различия статистически недостоверны). При хроническом гранулематозе (2-я группа) у обоих больных отмечалось по сравнению с нормальными величинами: существенное снижение показателя ИБН (различия статистически достоверны); незначительное снижение ФИ30 (различия статистически недостоверны) и более значительное снижение ФИ120 (различия статистически достоверны); снижение КФЧ (различия статистически достоверны). В 3-ей группе у всех больных с синдромом Джоба результаты определения с помощью заявленного способа показали значительное снижение по сравнению с нормой показателей ФИ30 и ФИ120 (различия статистически достоверны) при незначительном снижении ФЧ30, ФЧ120, КФЧ и ИБН (различия статистически недостоверны). В то же время результаты обследования практически здоровых детей с применением заявленного способа свидетельствовали об отсутствии нарушений ФАН: у всех детей 4-ой группы все анализируемые показатели фагоцитоза находились в пределах диапазона нормальных величин.

Во II серии опытов были получены ложнозавышенные показатели фагоцитоза:

- у трех больных 1-ой группы и у одного больного 3-ей группы - ФИ30, ФИ120, ФЧ30 и ФЧ120 (различия по сравнению с нормальными величинами статистически достоверны);

- у двух больных 1-ой группы и у одного больного 2-ой группы - ИБН (различия статистически достоверны);

- у одного больного 2-ой группы и у одного больного 3-ей группы - КФЧ (различия статистически достоверны).

Это не позволило выявить дефекты фагоцитоза у трех из четырех больных 1-ой группы, у одного из двух больных 2-ой группы и у одного из двух больных 3-ей группы.

В 4-ой группе (практически здоровые дети) у четырех детей были получены ложнозавышенные показатели: ФИ30, ФИ120, ФЧ30, ФЧ120, КФЧ, ИБН и у одного ребенка - ложнозаниженные: ФИ30, ФЧ30 и ИБН (во всех случаях различия по сравнению с нормальными величинами статистически достоверны). При этом ни у одного из этих детей никаких заболеваний и/или различного рода диагностических, лечебных и/или профилактических процедур, которые могли бы обусловить повышение (интеркуррентные инфекции, гнойно-воспалительные заболевания, травмы, операции, хронические очаги инфекции, проведение профилактических прививок и т.п.) либо понижение (врожденные или приобретенные дефекты фагоцитоза; рентгеновское облучение; лечение гормонами, цитостатиками и т.п.) показателей фагоцитоза ни в анамнезе (в течение 6 месяцев перед определением ФАН), ни при наблюдении за детьми в динамике (в течение 2 месяцев после определения ФАН) не отмечено.

В III серии опытов были получены ложнозавышенные показатели фагоцитоза:

- у двух больных 1-ой группы и у одного больного 3-ей группы - ФИ30, ФИ120, ФЧ30 (различия по сравнению с нормальными величинами статистически достоверны); 

- у одного больного 1-ой группы - ФЧ120 (различия статистически достоверны);

- у двух больных 1-ой группы, у одного больного 2-ой группы и у одного больного 3-ей группы - КФЧ (различия статистически достоверны);

- у двух больных 1-ой группы и у одного больного 3-ей группы - ИБН (различия статистически достоверны).

Это не позволило выявить нарушения в системе фагоцитоза у двух из четырех больных 1-ой группы, у одного из двух больных 2-ой группы и у одного из двух больных 3-ей группы.

В 4-ой группе у пяти детей были получены ложнозавышенные показатели: ФИ30, ФИ120, ФЧ30, ФЧ120, КФЧ, ИБН и у двух детей - ложнозаниженные: ФИ30, ФЧ30 и ИБН (во всех случаях различия по сравнению с нормальными величинами статистически достоверны). При этом ни у одного из этих детей так же, как и во второй серии опытов, не отмечено каких-либо заболеваний и/или диагностических, лечебных и/или профилактических процедур, способных обусловить нарушения в системе фагоцитоза, ни в анамнезе, ни при наблюдении в динамике (при сроках наблюдения, аналогичных II серии опытов). Данные табл.3 показывают, что постановка реакции фагоцитоза с использованием заявленных режимов и условий (I серия опытов) обеспечивает минимальный процент гибели нейтрофилов (2,3-2,5%) по сравнению со II и III сериями опытов. При этом чистота выделения лейкоцитов, о которой судят по количественному значению примеси эритроцитов (определяемой как число эритроцитов, приходящихся на 1 нейтрофил), и, соответственно, время, затрачиваемое на подсчет на мазках клеточных показателей, необходимых для последующего расчета показателей фагоцитоза, в I серии опытов сопоставимы с аналогичными показателями III серии опытов, т.е. при режимах и условиях постановки реакции фагоцитоза, предусмотренных методикой способа-прототипа (различия значений указанных показателей статистически недостоверны). Режимы и условия постановки реакции фагоцитоза во II серии опытов обеспечивают существенно более низкую степень чистоты выделения лейкоцитов - примесь эритроцитов превышает аналогичный показатель I серии опытов в 288-302 раза. Это приводит к увеличению в 3,6-4,2 раза времени, затрачиваемого на подсчет на мазках клеточных показателей, необходимых для последующего расчета показателей фагоцитоза (по сравнению с аналогичными временным показателем I серии опытов). 

Экспериментальные исследования авторов изобретения показали, что использование в ходе постановки реакции фагоцитоза капилляров с внутренним диаметром 0,2-0,8 мм является оптимальным, т.к. обеспечивает наибольшую простоту технического выполнения операции "выделение лейкоцитов" при отсутствии случаев получения ложнозавышенных или ложнозаниженных результатов реакции. При использовании капилляров с внутренним диаметром, превышающим 0,8 мм, имели место технические сложности в ходе выполнения операции "выделение лейкоцитов". В этом случае при разъединении капилляра происходило самопроизвольное (а не индуцированное касанием кончика капилляра к предметному стеклу) вытекание его содержимого во внешнюю среду. Это приводило к увеличению примеси плазмы к осадку лейкоцитов при перенесении его на предметное стекло, что уменьшало густоту лейкоцитарной взвеси и тем самым увеличивало продолжительность микроскопической оценки результатов реакции в 2-3 раза. Кроме того, при использовании капилляров с внутренним диаметром 1,0 и 1,2 мм были получены ложнозавышенные показатели фагоцитоза в 6-10% случаев и ложнозаниженные показатели - в 5-7% случаев. Применение капилляров с внутренним диаметром менее 0,2 мм (0,1 мм) приводило в ряде случаев (особенно у больных с лейкопениями, гранулоцитопениями и т.д.) к получению мазков низкого качества - в 10-15% случаев при микроскопическом анализе всего мазка выявлялось менее 200 нейтрофилов. При постановке реакции фагоцитоза с использованием капилляров с внутренним диаметром 0,1 мм были получены ложнозаниженные показатели фагоцитоза в 4-7% случаев, а ложнозавышенные - в 4-5% случаев.

Достижение обеспечиваемого изобретением технического результата обусловлено следующим. Известно, что для получения наиболее точных результатов иммунологических реакций (в т.ч. реакции фагоцитоза) необходимо создание условий для максимального сохранения in vitro состояния клеток, соответствующего их состоянию in vivo. В частности, известно, что повреждение клеток при центрифугировании происходит при их контакте с дном пробирки, тогда как в суспензии клетки не повреждаются даже при жестких режимах центрифугирования (несколько тысяч g) [5]. Оптимизация условий постановки указанных реакций может достигаться с помощью различных технических средств и приемов (применяемых как изолированно, так и в комплексе), в частности, за счет:

- использования в ходе постановки реакций рабочих емкостей, позволяющих свести к минимуму (или даже полностью исключить) контакт клеток с шероховатыми поверхностями (пробирок из малоадгезивного пластика, например из полипропилена, и т.п.);

- осторожного обращения с клеточной взвесью, что уменьшает механическое повреждение клеток;

- наличия в инкубационной среде факторов (аутологичных или гетерологичных), способствующих сохранению жизнеспособности клеток и их функциональных свойств и т.д. [3].

Однако при анализе патентной и научно-медицинской литературы авторами изобретения не обнаружено методик постановки реакции фагоцитоза, где используемые технические средства и приемы обеспечивали бы возможность разделения крови обследуемого организма на форменные элементы непосредственно в ходе реакции фагоцитоза, а также была бы выявлена и доказана роль указанной модификации методики как фактора оптимизации комплексного действия в отношении условий, обеспечивающих сохранение in vitro функциональных свойств нейтрофилов, ответственных за фагоцитоз, на уровне, соответствующем индивидуально присущему данному организму уровню in vivo.

Осуществление процедуры определения ФАН таким образом, что разделение лейкоцитов и эритроцитов происходит непосредственно в ходе реакции фагоцитоза, стало возможным за счет проведения обработки смеси для исследования фагоцитоза (стадий инкубации, центрифугирования) не в пробирке, а в капилляре. Особенностью капилляров является образование (при их заполнении жидкостью) на внутренней боковой поверхности (стенках) капилляра стабильного слоя жидкости, удерживающегося на стенках за счет сил поверхностного натяжения (пристеночный слой капилляра). В пристеночном слое капилляра происходит, по мнению авторов изобретения, разделение форменных элементов крови по технологии, характерной для жидкостной хроматографии, описанной, например, в работе [8]. При этом стеклянная стенка капилляра выполняет функции стеклянного хроматографического носителя, используемого в практике, в частности, для разделения методом жидкостной хроматографии смеси термически нестойких веществ [8]. В условиях заявленного способа форменные элементы крови под действием гравитационных сил "скользят" в направлении ко дну капилляра по пристеночному слою, который, выступая в роли "поверхности скольжения", одновременно обеспечивает торможение этих элементов. Учитывая различную адгезионную способность форменных элементов крови, степень торможения указанных элементов и, соответственно, скорости их движения существенно различаются. Кроме того, учитывая, что пристеночный слой капилляра образует замкнутую круговую поверхность, вектор движения форменных элементов, в частности лейкоцитов, направлен вниз (ко дну капилляра), при этом травматический контакт клеток со стенками капилляра полностью исключается. Все это создает оптимальные условия для разделения лейкоцитов и эритроцитов и обусловливает то, что процесс разделения лейкоцитов и эритроцитов уже на стадии инкубации смеси для исследования фагоцитоза протекает с относительно высокой интенсивностью. При этом хроматографические эффекты (возникающие при проведении реакции в капилляре), существенно меньшая площадь дна капилляра по сравнению с дном пробирки (при равных объемах содержащейся в указанных емкостях смеси для исследования фагоцитоза), отсутствие перемешивания содержимого капилляра (как специальной операции и в результате непроизвольного встряхивания при манипулировании в ходе анализа) обеспечивают уже на стадии инкубации синхронность протекания процессов разделения форменных элементов крови и формирования "эритроцитарной подушки" и их непрерывность. В связи с этим сформированная на стадии инкубации "эритроцитарная подушка" обладает высокой стабильностью, плотностью и высотой (эксперименты авторов изобретения по обоснованию и условий постановки реакции фагоцитоза: I серия опытов).

При постановке реакции фагоцитоза в пробирке при соблюдении прочих условий и режимов, предусмотренных методикой заявленного способа (эксперименты авторов изобретения по обоснованию режимов и условий постановки реакции фагоцитоза: II серия опытов), на стадии инкубации процесс разделения крови на форменные элементы выражен крайне незначительно (особенно в начальный период инкубации). На указанной стадии отмечаются некоторые признаки начала процесса формирования "эритроцитарной подушки". Однако в силу отсутствия указанных выше специфических для заявленного способа факторов (отсутствие хроматографических эффектов, относительно большая площадь дна пробирки, наличие перемешивания - как специальной операции - перед инкубацией и после инкубации, а также в результате непроизвольного встряхивания пробирки при манипулировании в ходе анализа) процесс формирования "эритроцитарной подушки" носит дискретный характер, отсутствует синхронность протекания процессов разделения лейкоцитов и эритроцитов и процесса формирования "эритроцитарной подушки". В результате этого "эритроцитарная подушка", формируемая на стадии инкубации, крайне нестабильна, обладает низкой плотностью, а ее высота (к концу срока инкубации) в 20-30 раз меньше аналогичного показателя, достигаемого при постановке реакции фагоцитоза в капилляре.

При постановке реакции фагоцитоза в капилляре на стадии центрифугирования, где происходит резкая интенсификация процесса разделения форменных элементов крови, "эритроцитарная подушка" еще более уплотняется, при этом отсутствует возможность ее смещения относительно дна капилляра. В этих условиях лейкоциты в ходе центрифугирования оседают на стабильную, плотную и высокую "эритроцитарную подушку", что полностью исключает возможность контакта указанных клеток с дном капилляра, а также (учитывая пристеночные эффекты) и со стенками капилляра. Это, в свою очередь, сводит к минимуму вероятность травматизации лейкоцитов о дно и стенки капилляра, препятствуя тем самым гибели нейтрофилов, а также возникновению различного рода нарушений их функциональных свойств, в т.ч. свойств, ответственных за фагоцитоз (т.е. свойств, обусловливающих интенсивность протекания процессов хемотаксиса и адгезии указанных клеток, процессов поглощения и переваривания ими микробов). В частности, отсутствие контакта с дном и со стенками капилляра исключает возможность нефизиологичной активации нейтрофилов, в т.ч. нефизиологичной активации их фагоцитарной функции, вследствие процессов адгезии к дну и стенке капилляра.

При постановке реакции фагоцитоза в пробирке с использованием режимов и условий, предусмотренных II серией опытов, процесс разделения лейкоцитов и эритроцитов протекает преимущественно на стадии центрифугирования. На этой же стадии более выраженным (чем на стадии инкубации) становится и процесс формирования "эритроцитарной подушки". Однако, учитывая более поздние (чем в капилляре) сроки образования указанной субстанции и технические особенности пробирок (площадь дна, объем), сформированная в пробирке в результате центрифугирования "эритроцитарная подушка" обладает значительно меньшей плотностью, меньшей высотой и существенно более низкой стабильностью (по сравнению с "эритроцитарной подушкой" капилляра), что обусловливает относительно высокую вероятность ее смещения относительно дна пробирки. В этих условиях существенно возрастает возможность контакта лейкоцитов с дном и со стенками пробирки, что, в свою очередь, увеличивает вероятность травматизации лейкоцитов, приводя тем самым к увеличению процента гибели нейтрофилов, к нарушениям их функциональных свойств, в частности, к изменениям их фагоцитарной активности (подавление или нефизиологичная активация фагоцитоза).

Таким образом, постановка реакции фагоцитоза в капилляре с использованием режимов и условий заявленного способа, позволяя устранить ряд механических и физико-химических факторов, оказывающих негативное влияние на ФАН и их жизнеспособность, существенно снижает вероятность получения ложнозавышенных и ложнозаниженных результатов реакции, повышая тем самым точность определения.

Центрифугирование смеси для исследования фагоцитоза в капилляре (I серия опытов) обеспечивает также более высокое качество разделения форменных элементов крови по сравнению с центрифугированием в пробирке (II серия опытов). Формирование в результате центрифугирования осадка лейкоцитов в капилляре в виде столбика, высота которого превышает аналогичный показатель, получаемый при использовании пробирки, в 40-50 раз, наличие четко выраженной границы раздела между лейкоцитами и эритроцитами, а также более стабильная "эритроцитарная подушка" позволяет осуществлять отделение осадка лейкоцитов от осадка эритроцитов простым разломом капилляра. Это существенно упрощает техническое выполнение операции "выделение лейкоцитов". При этом чистота выделения лейкоцитов (о которой судят по количественному значению примеси эритроцитов в мазках) в I серии опытов сопоставима с аналогичным показателем, получаемым при постановке реакции фагоцитоза с использованием предварительно выделенных (по методике способа-прототипа) лейкоцитов (III серия опытов). Это, в свою очередь, обеспечивает сопоставимость условий проведения и продолжительности микроскопической оценки результатов реакции фагоцитоза при ее постановке по методике заявленного способа и способа-прототипа (I и III серии опытов).

Получаемый в ходе центрифугирования смеси для исследования фагоцитоза в пробирке (II серия опытов) осадок лейкоцитов представляет собой нестабильный тонкий слой на поверхности осадка эритроцитов, граница между лейкоцитами и эритроцитами выражена значительно менее четко, а "эритроцитарная подушка" менее стабильна, чем в капилляре. В этих условиях отделение лейкоцитов от эритроцитов простым разломом пробирки (аналогично разлому капилляра) является технически неосуществимым. Отделение осадка лейкоцитов от осадка эритроцитов путем отсасывания лейкоцитарного слоя не обеспечивает возможности выделения лейкоцитов со степенью чистоты, необходимой и достаточной для создания оптимальных условий просмотра мазков. Значительная примесь эритроцитов в мазках существенно затрудняет микроскопическую оценку результатов реакции фагоцитоза и увеличивает ее продолжительность в 3,6-4,2 раза (по сравнению с I серией опытов).

Таким образом, постановка реакции фагоцитоза в капиллярах позволяет проводить процесс разделения лейкоцитов и эритроцитов непосредственно в ходе указанной реакции (на стадии инкубации смеси для исследования фагоцитоза) с последующим завершением его на стадии центрифугирования, а операцию "выделение лейкоцитов" - после завершения реакции фагоцитоза (после центрифугирования). При этом для осуществления процесса разделения лейкоцитов и эритроцитов не требуется специальных дополнительных операций (в противоположность способу-прототипу); операция "выделение лейкоцитов" относительно проста по техническому выполнению, а условия проведения и продолжительность микроскопической оценки результатов реакции фагоцитоза при реализации заявленной последовательности действий (в сочетании с режимами и условиями их выполнения) сопоставимы с аналогичными показателями, получаемыми при реализации последовательности действий (в сочетании с режимами и условиями их выполнения) способа-прототипа. Таким образом, заявленная последовательность действий обеспечивает относительную простоту технического исполнения процедуры определения ФАН и позволяет сократить ее общую продолжительность на 30-40 мин по сравнению с прототипом.

Предусмотренное методикой заявленного способа использование в качестве одного из компонентов смеси для исследования фагоцитоза цельной крови обследуемого организма, разделение лейкоцитов и эритроцитов непосредственно в ходе реакции фагоцитоза и выделение лейкоцитов после завершения реакции фагоцитоза обусловливают наличие в реакционной смеси наряду с лейкоцитами также плазмы крови и эритроцитов. С одной стороны, это позволяет сохранить содержащиеся в плазме крови аутологичные факторы, способствующие, по мнению авторов изобретения, сохранению функциональных свойств нейтрофилов, в т.ч. их фагоцитарной активности, а также их жизнеспособности. В этих условиях исключается необходимость внесения в смесь для исследования фагоцитоза опсонизирующего фактора - донорской сыворотки, которая, по мнению авторов заявленного способа, может содержать цитотоксические факторы, повреждающие нейтрофилы. Тем самым исключается возможность нарушений фагоцитарной функции нейтрофилов, а также их жизнеспособности, обусловленных негативным воздействием указанных иммунологических факторов.

С другой стороны, наличие эритроцитов в смеси для исследования фагоцитоза с момента начала реакции фагоцитоза, по мнению авторов предложенного решения, также может способствовать сохранению функциональных свойств лейкоцитов и их жизнеспособности ввиду следующего. Известно, что эритроциты обладают большой сорбционной поверхностью, вследствие чего на их поверхности могут сорбироваться различные вещества [9], в т.ч. биологически активные вещества, такие как химокины и цитокины, а также микробы (в частности, стафилококки). Авторы изобретения предполагают, что сорбированные на поверхности эритроцита биологически активные вещества (такие, как гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор; интерлейкины: ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-18 и т.п.) могут позитивно влиять на функциональные свойства лейкоцитов (в т.ч. ответственные за фагоцитоз) и на их жизнеспособность как при непосредственном контакте лейкоцитов и эритроцитов, так и в результате высвобождения указанных биологически активных веществ в реакционную среду. Кроме того, по мнению авторов изобретения, сорбированные на поверхности эритроцитов стафилококки легче подвергаются процессу фагоцитоза, чем стафилококки, находящиеся в растворе.

Таким образом, последовательность действий заявленного способа в сочетании с качественным составом смеси для исследования фагоцитоза позволяет устранить иммунологические факторы, которые могут негативно влиять на фагоцитарную функцию нейтрофилов и на их жизнеспособность, способствуя тем самым сохранению функциональных свойств нейтрофилов, в т.ч. ответственных за фагоцитоз. Это также вносит свой вклад в снижение вероятности получения ложнозавышенных и ложнозаниженных результатов реакции и, соответственно, повышает точность определения ФАН.

Приготовление смеси для исследования фагоцитоза с учетом оптимальных сроков хранения крови обследуемого организма (с антикоагулянтом) перед внесением в нее объекта фагоцитоза способствует сохранению жизнеспособности нейтрофилов и их функциональных свойств, в т.ч. ответственных за фагоцитоз, на уровне, соответствующем или приближающемся к уровню, присущему данному организму in vivo. При хранении крови обследуемого организма свыше 30 мин имеет место существенное нарушение функциональных свойств нейтрофилов, что, по мнению авторов изобретения, обусловлено гибелью указанных клеток, нарушением естественных процессов их хемотаксиса и адгезии, поглощения и переваривания ими микробов. Таким образом, использование в ходе постановки реакции фагоцитоза образцов крови обследуемого организма, сроки хранения которых (перед внесением объекта фагоцитоза) не превышают верхней границы интервала оптимальных значений указанного параметра, позволяет исключить возможность нарушений фагоцитарной функции нейтрофилов, а также снижения их жизнеспособности, обусловленных негативным воздействием указанного биологического фактора, что значимо снижает вероятность получения ложнозавышенных и ложнозаниженных результатов реакции.

Кроме того, заявленные условия и режимы осуществления действий обеспечивают дополнительное усиление технического результата, а также достижение дополнительных преимуществ в частных случаях реализации изобретения. Использование в ходе постановки реакции фагоцитоза капилляров, внутренний диаметр которых находится в пределах интервала оптимальных значений (0,2-0,8 мм), обусловливает оптимальные параметры просвета капилляра. В этих условиях толщина пристеночного слоя капилляра достаточна для того, чтобы обеспечить "скольжение" лейкоцитов в направлении ко дну капилляра при исключении возможности "пробивания" пристеночного слоя указанными клетками ("пробивание" пристеночного слоя имеет место при использовании капилляров с внутренним диаметром более 0,8 мм). Это позволяет практически полностью исключить контакт лейкоцитов со стенками капилляра, что дополнительно способствует снижению вероятности нефизиологичной активации нейтрофилов вследствие их адгезии к стенкам капилляра, а также травматизации указанных клеток о стенки капилляра. Оптимальные параметры просвета капилляра позволяют также получать осадок лейкоцитов, объем которого является достаточным для приготовления качественных мазков, содержащих необходимое для подсчета количество нейтрофилов (не менее 200 клеток), что дополнительно способствует созданию оптимальных условий для микроскопической оценки результатов реакции. Все это дополнительно снижает вероятность получения ложнозавышенных и ложнозаниженных результатов определения ФАН. Кроме того, использование капилляров с оптимальным внутренним диаметром обеспечивает отсутствие затруднений технического характера при выполнении операции "выделение лейкоцитов" (исключается самопроизвольное вытекание содержимого капилляра во внешнюю среду), что позволяет получать лейкоцитарную взвесь оптимальной густоты (при нанесении ее на предметное стекло). Это дополнительно способствует сокращению продолжительности микроскопической оценки результатов реакции.

Таким образом, именно заявленная последовательность действий в сочетании с режимами и условиями их выполнения позволяет устранить механические, физико-химические, биологические и/или иммунологические факторы, оказывающие негативное воздействие на жизнеспособность нейтрофилов периферической крови обследуемого организма, на процессы хемотаксиса и адгезии указанных клеток, а также на процессы поглощения и переваривания ими микробов. Это создает условия для сохранения in vitro функциональных свойств нейтрофилов каждого конкретного организма, ответственных за фагоцитоз, на уровне, соответствующем или приближающемся к индивидуально присущему данному организму уровню in vivo. Это, в свою очередь, позволяет практически полностью исключить возможность получения ложнозавышенных и ложнозаниженных результатов реакции, обеспечивая тем самым повышение точности определения ФАН. При этом из известного уровня техники не выявляется, по мнению заявителя, влияние предписываемых изобретением преобразований, характеризуемых отличительными от прототипа существенными признаками, на достижение технического результата.

Способ осуществляют следующим образом. Производят забор крови с антикоагулянтом у обследуемого организма. При этом в стерильную пробирку с заранее внесенным 5%-ным раствором цитрата натрия вносят кровь, взятую из пальца или из вены обследуемого организма при соотношении раствора цитрата натрия и крови 1:4. Осуществляют приготовление смеси для исследования фагоцитоза и ее обработку. При этом в пробирку, содержащую кровь с антикоагулянтом, не позднее чем через 30 мин после забора крови вносят микробную взвесь, например взвесь стафилококков (в качестве которой используют, например, суточную агаровую культуру Staphylococcus epidermidis, штамм 9198 по стандарту), в концентрации 1 млрд микробных клеток в 1 мл (объект фагоцитоза) при соотношении крови с антикоагулянтом и объекта фагоцитоза 2:1. Заполняют полученной смесью для исследования фагоцитоза два капилляра, внутренний диаметр которых составляет 0,2-0,8 мм. Запаивают один из концов каждого из капилляров смесью воска с парафином и помещают оба капилляра в термостат в вертикальном положении. Инкубируют при температуре 37°С каждый их капилляров, содержащих смесь для исследования фагоцитоза, один из капилляров - в течение 30 мин, а другой - в течение 120 мин (2 ч). По окончании срока инкубации каждый из капилляров центрифугируют в течение 10 мин при 1500 об/мин. После окончания центрифугирования разъединяют каждый из капилляров, например, путем надпиливания пилочкой для вскрытия ампул на границе размещения осадка лейкоцитов и осадка эритроцитов с последующим разламыванием каждого из капилляров. Извлекают осадок лейкоцитов из соответствующей концевой части каждого из разъединенных капилляров, например, путем перенесения осадка лейкоцитов из каждого капилляра на обезжиренное предметное стекло (касаясь кончиком концевой части капилляра, содержащей лейкоциты, предметного стекла).

Приготавливают мазки из осадка лейкоцитов, извлеченного из каждого из разъединенных капилляров. Приготовленные мазки сушат на воздухе, затем фиксируют 10 мин в абсолютном метиловом спирте и красят по Романовскому-Гимзе азур-эозином. После окрашивания мазки просматривают под микроскопом в иммерсионной системе: считают не менее 200 клеток (общее число нейтрофилов). Определяют на каждом из мазков число нейтрофилов, вступивших в фагоцитоз, и общее число поглощенных нейтрофилами микробов /далее - "клеточные показатели, необходимые для последующего расчета показателей фагоцитоза"/. Производят расчет показателей фагоцитоза, в качестве которых используют следующие:

1. ФИ, определяемый по формуле (1).

2. ФЧ, определяемый по формуле (2).

Оба показателя (ФИ и ФЧ) рассчитывают на мазках, приготовленных из осадков 30- и 120-минутной инкубации (соответственно, ФИ30 и ФИ120; ФЧ30 и ФЧ120).

3. КФЧ, определяемый по формуле (3).

4. ИБН, определяемый по формуле (4).

Показатели, входящие в формулу (4), - число убитых внутри нейтрофилов микробов (Чу) и общее число поглощенных нейтрофилами микробов (Чп, Чп ) оценивают, например, путем посева на плотные питательные среды (агар) отмытого и лизированного осадка лейкоцитов по методике, приведенной в работе [2, с.384-386] /далее - "бактериологические показатели, необходимые для последующего расчета ИБН"/. При этом Чу определяют по формуле:



где Чп - количество колониеобразующих единиц /КОЕ/ стафилококка при посеве лизированного осадка лейкоцитов, инкубированных в течение 30 мин;

ЧП - количество КОЕ стафилококка при посеве лизированного осадка лейкоцитов, инкубированных в течение 120 мин;

Ч у - разность между количеством КОЕ стафилококка при посеве лизированного осадка лейкоцитов, инкубированных в течение 30 мин, и количеством КОЕ стафилококка при посеве лизированного осадка лейкоцитов, инкубированных в течение 120 мин.

Сопоставляют полученные значения показателей фагоцитоза с нормальными (для того вида организмов, к которым относится обследуемый организм) величинами. При обследовании больных и здоровых людей используют, например, нормальные величины, приведенные в работе [4]. Устанавливают наличие или отсутствие изменений каждого из исследуемых показателей фагоцитоза по сравнению с нормой. При нахождении значений всех исследуемых показателей фагоцитоза в пределах нормы делают вывод об отсутствии нарушений ФАН обследуемого организма. При наличии отклонений от нормы хотя бы одного из исследуемых показателей фагоцитоза делают вывод о наличии нарушений ФАН данного организма. 

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Больной Сережа Т., 7 лет. Обратился в поликлиническое отделение №41 ДГБ №1 с жалобами на кашель, повышение температуры тела до 38,5°С. Болен в течение 5-ти дней. Получал симптоматическую терапию (жаропонижающие и отхаркивающие средства), но состояние ухудшалось, в связи с чем обратился в ДГБ №1. В анамнезе у больного отмечены рецидивирующие пневмонии, фурункулезы, аденофлегмоны, остеомиелиты с раннего возраста (с возраста 1 мес). Ребенок также наблюдается невропатологом по поводу отставания в психомоторном развитии, нистагма.

У пациента было проведено определение ФАН с использованием заявленного способа и способа-прототипа. В ходе определения ФАН у обследуемого ребенка взяли 10 мл крови из вены и внесли в стерильную пробирку (исходную) с заранее внесенным в количестве 2,5 мл 5%-ным раствором цитрата натрия. Полученную кровь с антикоагулянтом использовали для постановки реакции фагоцитоза по методике заявленного способа и по методике способа-прототипа. 

В ходе определения ФАН с помощью заявленного способа из исходной пробирки, содержащей кровь с антикоагулянтом, отобрали 0,1 мл в отдельную (опытную пробирку). Затем в опытную пробирку через 8 мин после забора крови у обследуемого ребенка (время определяли по результатам хронометрирования авторов изобретения) внесли 0,05 мл взвеси стафилококков (суточная агаровая культура Staphylococcus epidermidis, шт. 9198 по стандарту) в концентрации 1 млрд микробных клеток в 1 мл. Заполнили полученной смесью для исследования фагоцитоза два капилляра с внутренним диаметром 0,8 мм. Запаяли один из концов каждого из капилляров смесью воска с парафином и поместили оба капилляра в термостат в вертикальном положении. Инкубировали при температуре 37°С каждый из капилляров, содержащих смесь для исследования фагоцитоза: один из капилляров - в течение 30 мин, а другой - в течение 120 мин (2 ч). По окончании срока инкубации каждый из капилляров центрифугировали в течение 10 мин при 1500 об/мин. После окончания центрифугирования разъединили каждый из капилляров путем надпиливания пилочкой для вскрытия ампул на границе размещения осадка лейкоцитов и осадка эритроцитов с последующим разламыванием каждого из капилляров. Извлекли осадок лейкоцитов из соответствующей концевой части каждого из разъединенных капилляров путем перенесения осадка лейкоцитов из каждого капилляра на обезжиренное предметное стекло (касаясь кончиком концевой части капилляра, содержащей лейкоциты, предметного стекла).

Приготовили мазки из осадка лейкоцитов, извлеченного из каждого из разъединенных капилляров. Приготовленные мазки высушили на воздухе, затем фиксировали 10 мин в абсолютном метиловом спирте и красили по Романовскому-Гимзе азур-эозином. После окрашивания каждый из мазков просмотрели под микроскопом в иммерсионной системе: считали 200 клеток (общее число нейтрофилов). Определили на каждом из мазков клеточные показатели, необходимые для последующего расчета показателей фагоцитоза:



Рассчитали показатели фагоцитоза: ФИ - по формуле (1), ФЧ - по формуле (2), КФЧ - по формуле (3):











Определили бактериологические показатели, необходимые для последующего расчета ИБН, путем посева на плотные питательные среды (агар) отмытого и лизированного осадка лейкоцитов, инкубированных в течение 30 мин и в течение 120 мин (по методике [2]):



Рассчитали число убитых внутри нейтрофилов микробов (Ч у) как разность между количеством КОЕ стафилококка при посеве лизированного осадка лейкоцитов, инкубированных в течение 30 мин, и количеством КОЕ стафилококка при посеве лизированного осадка лейкоцитов, инкубированных в течение 120 мин, по формуле (5):

Чу=156-101=55 КОЕ стафилококка

Рассчитали показатель ИБН по формуле (4):



Результаты определений и расчетов представлены в сводной табл.4.

При сопоставлении полученных значений показателей фагоцитоза с нормальными величинами, приведенными в работе [4], выявлено: ФИ30, ФИ120, ФЧ30, ФЧ120 и ИБН - существенно снижены (значения указанных показателей находятся за пределами нижней границы интервалов значений соответствующих нормальных величин); КФЧ - в пределах нормы. Таким образом, результаты, полученные с помощью заявленного способа, свидетельствовали о наличии дефекта в фагоцитарном звене иммунитета, а именно - о наличии нарушений как начальной, так и завершающей стадий процесса фагоцитоза. Время, затраченное на процедуру определения, составило (по результатам хронометрирования авторов предложенного способа) 146 мин (2,4 ч).

Параллельно у пациента было проведено определение ФАН по методике способа-прототипа [4]. При этом оставшуюся в исходной пробирке кровь с антикоагулянтом перемешали, после чего ее центрифугировали 10 мин при 1000 об/мин. Плазм со слоем лейкоцитов отсосали пипеткой, поместили в чистую центрифужную пробирку и добавили 10 мл среды 199. Дважды отмыли лейкоциты в среде 199 путем двухкратного центрифугирования в течение 10 мин при 1000 об/мин. После последнего центрифугирования отсосали пипеткой надосадочную жидкость и часть клеточной взвеси, оставив в центрифужной пробирке 0,2 мл клеточной взвеси в среде 199. Затем в пробирку, содержащую 0,2 мл лейкоцитов в среде 199, внесли 0,3 мл взвеси стафилококков (культура та же, что и при определении ФАН заявленным способом) в концентрации 1 млрд микробных клеток в 1 мл, после чего добавили 0,15 мл пула свежих донорских сывороток АВ (IV) группы (время от момента забора крови у обследуемого ребенка до внесения объекта фагоцитоза в лейкоцитарную взвесь составило, по результатам хронометрирования авторов изобретения, 43 мин). Перемешали компоненты и термостатировали полученную смесь для исследования фагоцитоза 30 мин при температуре 37°С. По истечении указанного времени в пробирку добавили 5 мл прогретого до 37°С изотонического раствора натрия хлорида, встряхнули и центрифугировали 10 мин при 1500 об/мин. По окончании центрифугирования надосадочную жидкость удалили и сделали мазки из лейкоцитарной взвеси, остатки которой поместили в термостат при 37°С для продолжения инкубации еще в течение 90 мин (суммарное время инкубации 120 мин). Затем мазки приготовили повторно из осадка 120-минутной инкубации. Мазки из осадков лейкоцитов (после 30-минутной и 120-минутной инкубации) готовили на обезжиренных предметных стеклах. Фиксирование и окрашивание мазков производили так же, как и при определении ФАН заявленным способом. На каждом из мазков определили клеточные показатели, необходимые для последующего расчета показателей фагоцитоза, и рассчитали показатели фагоцитоза: ФИ, ФЧ, КФЧ - аналогично заявленному способу. Определили бактериологические показатели, необходимые для последующего расчета ИБН, и рассчитали ИБН аналогично заявленному способу.

Результаты определений и расчетов приведены в сводной табл.4.

Сопоставление результатов определения с нормальными величинами [4] показало, что полученные значения всех исследуемых показателей фагоцитоза находились в пределах интервалов значений соответствующих нормальных величин. Таким образом, способ-прототип не выявил нарушений ФАН. Длительность процедуры определения, по результатам хронометрирования авторов изобретения, составила 198 мин (3,2 ч).

Проведено комплексное обследование пациента. При клиническом осмотре отмечены альбинизм, серебристое свечение волос при освещении электрической лампой, отсутствие отложения пигмента в сетчатке. На рентгенограмме грудной клетки выявлена инфильтрация в нижней доле правого легкого.

Результаты лабораторного обследования

В анализе крови выявлена нейтропения:

Нb 116 г/л; Еr 3,8·1012 /л; лейкоциты 5,6·109%; тромбоциты 180·10 12/л; палочкоядерные 7%; сегментоядерные 8%; эозинофилы 4%; лимфоциты 70%; базофилы 2%; моноциты 9%; СОЭ 25 мм/ч.

В иммунограмме выявлено:

1) незначительное снижение относительного количества Т-лимфоцитов, незначительное увеличение количества В-лимфоцитов:

CD3 48% (норма 50-76%);

CD4 35% (норма 31-46%);

CD8 28% (норма 26-40%);

CD16 15% (норма 9-16%);

CD20 18% (норма 11-16%);

CD25 25% (норма 13-24%);

2) незначительное увеличение концентрации иммуноглобулина М (Ig М):

Ig G 690 мг % (норма 583-1783 мг %);

Ig М 150 мг % (норма 24-112 мг %);

Ig A 95 мг % (норма 85-559 мг %);

3) содержание компонентов системы комплемента соответствовало норме:

C1q 130 мкг/мл (норма 100-250 мкг/мл);

С3 850 мкг/мл (норма 700-1800 мкг/мл); 

С3а 0,07 мкг/мл (норма 0,05-0,15 мкг/мл);

С4 400 мкг/мл (норма 200-500 мкг/мл);

С5а 0,025 мкг/мл (норма 0,01-0,03 мкг/мл);

4) спонтанная и индуцированная продукция цитокинов незначительно отличалась от нормы:



5) уровень циркулирующих иммунных комплексов /ЦИК/ соответствовал норме:

112 ед./мл (норма до 120 ед./мл);

6) существенное снижение хемотаксиса нейтрофилов:

индекс миграции под влиянием FMLP 0,2 (норма 2,6-2,8);

7) незначительное снижение теста с нитросиним тетразолием:

гранулы формазана выявлены в 8% нейтрофилов (норма 11-40%).

С учетом анамнеза, клинической картины и проведенного комплексного лабораторного обследования был поставлен диагноз: Синдром Чедиака-Хигаси. Учитывая, что синдром Чедиака-Хигаси согласно данным работы [7] относится к врожденным иммунодефицитам, сопровождающимся дефектами фагоцитоза, результаты комплексного обследования подтвердили результаты определения ФАН, полученные с помощью заявленного способа, и позволили расценить результаты определения ФАН по способу-прототипу как ложнозавышенные. 

Пример 2

Больная Татьяна С., 14 лет. Обратилась в поликлиническое отделение №41 ДГБ №1 с жалобами на гнойничковые высыпания на коже, повышение температуры тела до 37,8°С. Ухудшение состояния отмечено две недели назад: гнойничковые высыпания на коже (фурункулы) появлялись на различных участках тела (правое плечо, брюшная стенка, бедра). Девочка получала лечение в участковой поликлинике (повязки с фурацилином, различными мазями, вскрытие фурункулов), но фурункулы появлялись на новых участках тела. В анамнезе у пациентки с 1,5 лет отмечался рецидивирующий фурункулез с обострениями в осеннее-зимнее время года.

У пациентки было проведено определение ФАН с использованием заявленного способа и способа-прототипа аналогично примеру 1.

При определении ФАН с помощью заявленного способа были использованы капилляры с внутренним диаметром 0,6 мм. Время от момента забора крови у обследуемого ребенка до внесения в кровь с антикоагулянтом объекта фагоцитоза составило 16 мин.

Результаты определений и расчетов приведены в сводной табл.5.

При сопоставлении полученных значений показателей фагоцитоза с нормальными величинами выявлено существенное снижение ФЧ30, ФЧ120 и ИБН при незначительном снижении ФИ30, ФИ120 (КФЧ несколько повышен), что свидетельствовало о наличии дефекта в фагоцитарном звене иммунитета, а именно - о наличии нарушений как начальной, так и завершающей стадий процесса фагоцитоза. На процедуру определения затрачено 152 мин (2,5 ч). 

Параллельно у пациентки было проведено определение ФАН с помощью способа-прототипа. Время от момента забора крови у обследуемого ребенка до внесения объекта фагоцитоза в лейкоцитарную взвесь составило 45 мин.

Результаты определений и расчетов приведены в сводной табл.5.

Результаты сопоставления полученных с помощью способа-прототипа значений показателей фагоцитоза с нормальными величинами оказались аналогичными соответствующим результатам сопоставления данных, полученных с помощью заявленного способа (существенное снижение ФЧ30, ФЧ120 и ИБН, незначительное снижение ФИ30, ФИ120, повышение КФЧ). Это позволило сделать выводы, аналогичные выводам заявленного способа (наличие дефекта в фагоцитарном звене иммунитета; наличие нарушений как начальной, так и завершающей стадий процесса фагоцитоза). Процедура определения заняла 198 мин (3,3 ч).

Проведено комплексное обследование пациентки аналогично примеру 1. При клиническом осмотре выявлено наличие фурункулов на правом бедре, на правой голени, левом предплечье; температура тела 37°С. Физическое развитие ребенка соответствовало возрасту. Повторное исследование сахара крови и сахарных кривых не выявило отклонений от нормы.

Результаты лабораторного обследования

В анализе крови выявлен лейкоцитоз с нейтрофильным сдвигом влево: Нb 135 г/л; Er 4,1·1012/л; лейкоциты 15,7·109/л; тромбоциты 220·1012 /л; юные 3%; палочкоядерные 15%; сегментоядерные 48%; эозинофилы 2%; лимфоциты 25%; моноциты 7%; СОЭ 32 мм/ч.

В иммунограмме выявлено:

1) незначительное увеличение количества В-лимфоцитов: 

CD3 56%;

CD4 34%;

CD8 27%;

CD16 12%; 

CD20 19%;

CD25 25%;

2) концентрация иммуноглобулинов соответствовала возрастной норме:

Ig G 840 мг % (норма 575-1607 мг %);

Ig M 130 мг % (норма 26-135 мг %);

Ig A 230 мг % (норма 86-588 мг %);

3) содержание компонентов системы комплемента соответствовало норме:

C1q 210 мкг/мл; 

С3 1200 мкг/мл;

С3а 0,12 мкг/мл;

С4 450 мкг/мл; 

С5а 0,018 мкг/мл;

4) спонтанная и индуцированная продукция цитокинов незначительно отличалась от нормы:



5) уровень ЦИК соответствовал норме:

118 ед./мл; 

6) хемотаксис нейтрофилов соответствовал норме:

индекс миграции под влиянием FMLP 2,6;

7) снижение теста с нитросиним тетразолием:

гранулы формазана выявлены в 6% нейтрофилов.

Данные комплексного обследования позволили сделать вывод, что причиной рецидивирующего фурункулеза у ребенка является иммунодефицит - дефект фагоцитоза, поскольку при оценке остальных звеньев иммунитета отклонений от нормы не выявлено. Таким образом, в данном случае имело место совпадение результатов определения ФАН с помощью заявленного способа и способа-прототипа. При этом результаты фагоцитарной реакции коррелировали с данными комплексного обследования.

Пример 3

Ребенок Николай П., 16 лет. Обследовался в поликлиническом отделении №41 ДГБ №1 в порядке диспансеризации. Жалоб при осмотре не предъявлял. В анамнезе редкие (1-2 раза в год) ОРВИ.

У мальчика было проведено определение ФАН с использованием заявленного способа и способа-прототипа аналогично примеру 1.

В ходе определения ФАН по методике заявленного способа были использованы капилляры с внутренним диаметром 0,2 мм. Время от момента взятия крови у обследуемого ребенка до внесения объекта фагоцитоза в кровь с антикоагулянтом составило 5 мин.

Результаты определений и расчетов приведены в сводной табл.6.

При сопоставлении полученных значений показателей фагоцитоза с нормальными величинами отклонений от нормы не выявлено, что позволило сделать вывод об отсутствии нарушений в системе фагоцитоза у обследованного ребенка. Продолжительность процедуры определения - 136 мин (2,3 ч).

Параллельно у мальчика было проведено определение ФАН по способу-прототипу. Время от момента взятия крови у обследуемого ребенка до внесения объекта фагоцитоза в лейкоцитарную взвесь составило 36 мин.

Результаты определений и расчетов представлены в сводной табл.6.

В результате сопоставления полученных с помощью способа-прототипа данных с нормальными величинами выявлено существенное снижение ФЧ30, ФЧ120 и ИБН, на основании чего можно было сделать вывод о том, что у ребенка имеются серьезные нарушения в системе фагоцитоза (на начальной и на завершающей стадиях процесса фагоцитоза). Длительность процедуры определения 178 мин (3,0 ч).

Проведено комплексное обследование ребенка. При клиническом осмотре выявлено плоскостопие. Отклонений со стороны других органов и систем не обнаружено.

Результаты лабораторного обследования: 

В анализе крови отклонений от нормы не выявлено:

Нb 145 г/л; Er 4,5·1012/л; лейкоциты 6,3·10 9%; тромбоциты 250·1012/л; палочкоядерные 3%; сегментоядерные 53%; эозинофилы 2%; лимфоциты 37%; моноциты 5%; СОЭ 3 мм/ч. В иммунограмме:

1) содержание Т- и В-лимфоцитов соответствовало норме:

CD3 40%;

CD4 43%;

CD8 32%;

CD16 15%;

CD20 12%;

CD25 21%;

2) концентрация иммуноглобулинов соответствовала возрастной норме: 

Ig G 1250 мг % (норма 770-1510 мг %);

Ig M 112 мг % (норма 67-208 мг %);

Ig A 185 мг % (норма 134-297 мг %);

3) содержание компонентов системы комплемента соответствовало норме:

C1q 210 мкг/мл;

С3 950 мкг/мл;

С3а 0,11 мкг/мл;

С4 410 мкг/мл;

С5а 0,015 мкг/мл;

4) спонтанная и индуцированная продукция цитокинов соответствовала норме:



5) уровень ЦИК соответствовал норме:

96 ед./мл;

6) хемотаксис нейтрофилов соответствовал норме:

индекс миграции под влиянием FMLP 2,7;

7) тест с нитросиним тетразолием соответствовал норме:

гранулы формазана выявлены в 38% нейтрофилов.

Данные комплексного обследования показали следующее. У ребенка обнаружена ортопедическая патология: плоскостопие. Заболеваний, которые свидетельствовали бы об отклонениях в системе иммунитета, не отмечено. В частности, не выявлено никаких заболеваний, которые могли бы обусловить снижение показателей фагоцитоза. Не проводилось также лечебных, диагностических и/или профилактических процедур, которые могли бы вызвать снижение показателей фагоцитоза. Таким образом, результаты комплексного обследования, которые свидетельствовали об отсутствии нарушений ФАН, подтвердили результаты определения, полученные с помощью заявленного способа, и дали возможность расценить результаты определения ФАН по способу-прототипу как ложнозаниженные.

Заявленный способ был использован при обследовании 342 детей в возрасте от 3 до 15 лет, которое проводилось на базе ДГБ №1 (в поликлиническом отделении №41). Для сравнения определение ФАН проводили с помощью способа-прототипа [4].

Всем детям было также проведено комплексное обследование с использованием различных клинических, инструментальных и лабораторных методов, включая иммунологические методы (определение количества Т- и В-лимфоцитов; концентрации иммуноглобулинов А, М, G; содержания компонентов системы комплемента; определение спонтанной и индуцированной продукции цитокинов; определение уровня ЦИК; определение ФАН и т.д.). Определение ФАН в ходе комплексного обследования проводили путем исследования хемотаксиса лейкоцитов периферической крови по методике, приведенной в работе [2], и путем постановки теста с нитросиним тетразолием по методике, изложенной в работе [3]. С учетом анамнеза, клинической картины и проведенного комплексного обследования были поставлены клинические диагнозы (далее - "результаты контрольного комплексного обследования /ККО/"). При этом обследованные дети были распределены на следующие группы:

I группа - больные с синдромом Чедиака-Хигаси (2 чел.);

II группа - больные с рецидивирующим фурункулезом (12 чел.); 

III группа - больные с рецидивирующими лимфаденитами (6 чел.);

IV группа - больные с рецидивирующими отитами, синуситами, пневмониями (11 чел.);

V группа - больные с хроническими гастритами, дуоденитами, дискинезиями желчевыводящих путей (112 чел.);

VI группа - больные с врожденными пороками сердца (48 чел.);

VII группа - больные с нарушениями опорно-двигательного аппарата (сколиоз, плоскостопие, дисплазия тазобедренного сустава) (136 чел.);

VIII группа - практически здоровые дети (15 чел.).

Статистическую обработку результатов обследования проводили с использованием критериев Фишера и Вилкоксона-Манна-Уитни [6].

Полученные результаты представлены в табл.7, 8. В таблице 7 дан сравнительный анализ точности определения ФАН у детей с различными заболеваниями (по группам) и у практически здоровых детей с помощью заявленного способа и способа-прототипа. В табл. 8 приведены суммарные данные, характеризующие эффективность заявленного способа и способа-прототипа.

Из табл.7 видно, что нарушения ФАН были подтверждены с помощью ККО у 22 детей (у 2 больных с синдромом Чедиака-Хигаси (I группа); у 12 больных с рецидивирующим фурункулезом (II группа); у 5 больных с рецидивирующими лимфаденитами (III группа); у 3 больных с рецидивирующими отитами, синуситами, пневмониями (IV группа)).

При использовании заявленного способа были выявлены нарушения ФАН у всех указанных больных. Вместе с тем отсутствие нарушений ФАН, установленное с помощью предложенного способа, во всех случаях (320 детей) полностью коррелировало с результатами ККО (у 1 больного III группы; у 8 больных IV группы, а также у всех больных V-VII групп и у практически здоровых детей (VIII группа)).

С помощью способа-прототипа были выявлены нарушения в системе фагоцитоза (подтвержденные ККО) у 15 больных (у 1 больного с синдромом Чедиака-Хигаси (I гр.); у 9 больных с рецидивирующим фурункулезом (II гр.); у 3 больных с рецидивирующими лимфаденитами (III гр.) и у 2 больных с рецидивирующими отитами, синуситами, пневмониями (IV гр.)). У 7 больных с подтвержденными ККО нарушениями ФАН (у 1 больного с синдромом Чедиака-Хигаси (I гр.); у 3 больных с рецидивирующим фурункулезом (II гр.); у 2 больных с рецидивирующими лимфаденитами (III гр.) и у 1 больного с рецидивирующим отитом (IV гр.)) значения показателей фагоцитоза, полученные при применении способа-прототипа, соответствовали нормальным величинам (ложнозавышенные результаты определения). Кроме того, выявленные с помощью способа-прототипа нарушения ФАН в 43 случаях не подтверждались результатами ККО (у 15 больных с хроническими гастритами, дуоденитами, дискинезиями желчевыводящих путей (V гр.): в 11-ти случаях - ложнозавышенные результаты определения, в 4-х случаях - ложнозаниженные; у 3 больных с врожденными пороками сердца (VI гр.): в 2-х случаях - ложнозавышенные результаты, в одном случае - ложнозаниженные; у 21 ребенка с нарушениями опорно-двигательного аппарата (VII группа): в 16-ти случаях - ложнозавышенные результаты, в 5-ти случаях - ложнозаниженные, а также у 4 практически здоровых детей (VIII гр.): в 3-х случаях - ложнозавышенные результаты, в одном случае - ложнозаниженный).

Как следует из данных табл.8, заявленный способ обеспечивает при его реализации 100%-ную точность определения ФАН, что на 14,6% превышает точность определения с помощью способа-прототипа. При этом при подтвержденных ККО нарушениях ФАН результаты определения по способу-прототипу были расценены как ошибочные в 31,8% случаев, а при отсутствии нарушений в системе фагоцитоза (подтвержденном ККО) - в 13,4% случаев (табл.7). Кроме того, заявленный способ, как это видно из табл. 8, позволяет сократить длительность процедуры определения ФАН в среднем в 1,3 раза по сравнению со способом-прототипом (за счет исключения необходимости проведения предварительного разделения лейкоцитов и эритроцитов и выделения лейкоцитов как специальных операций в ходе приготовления смеси для исследования фагоцитоза, осуществления разделения лейкоцитов и эритроцитов непосредственно в ходе реакции фагоцитоза и упрощения операции "выделение лейкоцитов"). При этом продолжительность микроскопической оценки результатов реакции сопоставима с аналогичным показателем способа-прототипа. Таким образом, заявленный способ при его реализации обеспечивает высокую точность определения ФАН при относительной простоте технического исполнения и относительно небольшой продолжительности анализа. 

Источники информации

1. Чернушенко Е.Ф., Когосова Л.С. Иммунология и иммунопатология заболеваний легких. - Киев: Здоровя, 1981. - С.169.

2. Иммунологические методы: Пер. с нем. /Под ред. Г.Фримеля. - М.: Медицина, 1987. - С.333-338, 384-386. 

3. Дуглас С.Д., Куи П.Г. Исследование фагоцитоза в клинической практике: Пер. с англ. - М.: Медицина, 1983. - С.63-64, 87-88. 

4. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник /В.В.Меньшиков, Л.Н.Делекторская, Р.П.Золотницкая и др. Под ред. В.В.Меньшикова. - М.: Медицина, 1987. - С.310-311 (прототип). 

5. Лимфоциты: Методы: Пер. с англ. /Под ред. Дж.Клауса. - М.: Мир, 1990. - С.29.50.

6. Гублер Е.В. Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов. - Л.: Медицина, 1978. - С.72-75, 84-91.

7. Nelson textbook of pediatrics. - 15-th ed. /edited by R.E.Behrman, R.M.Kliegman, A.M.Arvin; senior editor W.E.Nelson. - W.B.Saunders Company, 1996. - P.561-609.

8. Лурье А.А. Хроматографические материалы: Справочник. - М.: Химия, 1978. - С.190-191.

9. Гематология детского возраста: Руководство для врачей. /Под ред. Н.А.Алексеева. - СПб: Гиппократ, 1998. - С.97-105.



ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


1. Способ определения фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови, включающий забор крови с антикоагулянтом, приготовление смеси для исследования фагоцитоза, содержащей лейкоциты и объект фагоцитоза, выделение лейкоцитов, обработку смеси для исследования фагоцитоза инкубацией и центрифугированием, приготовление мазков из полученных после центрифугирования осадков с последующим определением на каждом из мазков числа нейтрофилов, вступивших в фацитоз, и общего числа поглощенных нейтрофилами микробов, расчет показателей фагоцитоза и сопоставление полученных значений показателей фагоцитоза с нормальными величинами, отличающийся тем, что в ходе приготовления смеси для исследования фагоцитоза сначала вносят объект фагоцитоза в кровь с антикоагулянтом не позднее чем через 30 мин после ее забора, после чего заполняют полученной смесью для исследования фагоцитоза два капилляра, обработку смеси производят путем инкубации при температуре 37°С каждого из капилляров, причем один из капилляров инкубируют в течение 30 мин, а другой в течение 2 ч, и центрифугирования каждого из указанных капилляров в течение 10 мин при 1500 об/мин, выделение лейкоцитов производят непосредственно после центрифугирования путем разъединения каждого из капилляров на границе размещения осадка лейкоцитов и осадка эритроцитов и извлечения осадка лейкоцитов из соответствующей части каждого из разъединенных капилляров, приготовление мазков осуществляют из осадков лейкоцитов, а в качестве показателей фагоцитоза используют фагоцитарный индекс, фагоцитарное число, коэффициент фагоцитарного числа и индекс бактерицидности нейтрофилов.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в ходе приготовления смеси для исследования фагоцитоза и ее обработки используют капилляры с внутренним диаметром 0,2-0,8 мм.