СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СТЕРОИДРЕЗИСТЕНТНОСТИ У БОЛЬНЫХ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СТЕРОИДРЕЗИСТЕНТНОСТИ У БОЛЬНЫХ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ


RU (11) 2187816 (13) C1

(51) 7 G01N33/53, G01N33/535, G01N33/537 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 26.07.2007 - прекратил действие 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2002.08.20 
(21) Регистрационный номер заявки: 2001115746/14 
(22) Дата подачи заявки: 2001.06.01 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2001.06.01 
(45) Опубликовано: 2002.08.20 
(56) Аналоги изобретения: VECCHIARELLI A. et al. Effect of corticosteroid treatment on interleukin-1 and tumour necrosis factor secretion by monocytes from subjects with asthma., J. Clin. Exp. Allergy. 1992, vol. 22, p. 365-369. RU 2018848 С1, 30.08.1994. RU 2098823 С1, 10.12.1997. RU 2094800 С1, 27.10.1997. RU 2063044 С1, 27.06.1996. 
(71) Имя заявителя: Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П.Павлова (RU) 
(72) Имя изобретателя: Шапорова Н.Л. (RU); Трофимов В.И. (RU); ШИРИ Зиад Али (LB); Сесь Т.П. (RU); Малышев М.Е. (RU) 
(73) Имя патентообладателя: Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П.Павлова (RU) 
(98) Адрес для переписки: 197022, Санкт-Петербург, фил.1, ул. Л.Толстого, 6/8, С- ПбГМУ им. акад. И.П.Павлова, патентный отдел Г.Б.Сахновской 

(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СТЕРОИДРЕЗИСТЕНТНОСТИ У БОЛЬНЫХ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ 

Изобретение относится к области медицины, а именно к пульмонологии, и может быть использовано для решения вопроса об эффективности терапии глюкокортикоидными гормонами и подбора адекватной дозы препаратов глюкокортикоидных гормонов у больных бронхиальной астмой (БА). Проводят исследование биологической жидкости в динамике на фоне проведения курса терапии глюкокортикоидными гормонами, при этом в качестве биологической жидкости берут мокроту, определяют в ней содержание интерлейкина 8 (IL-8) и при отсутствии снижения его содержания диагностируют стероидрезистентность. Способ позволяет осуществлять диагностику стероидрезистентности у больных в условиях in vivo с высокой информативностью, оценивать влияние гормональной терапии на воспалительные клетки дыхательных путей пациента. 1 табл. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к медицине, а именно к пульмонологии, к способам диагностики стероидрезистентности, и может быть использовано для решения вопроса об эффективности терапии глюкокортикоидными гормонами и подбора адекватной дозы препаратов глюкокортикоидных гормонов у больных бронхиальной астмой (БА).

Использование глюкокортикоидных гормонов в качестве базисной терапии БА в настоящее время является общепризнанным. В клинической практике к гормонозависимым относят те случаи заболевания, которые не удается контролировать противовоспалительной терапией с использованием мембраностабилизаторов (интала, тайледа) в сочетании с обычной бронхолитической терапией, и улучшение состояния больных достигается только с помощью глюкокортикоидных препаратов системного действия. Больные гормонозависимой БА, нуждающиеся в постоянной терапии системными глюкокортикоидами, различаются по чувствительности к этой терапии. Среди них выделяют кортикочувствительных и стероидрезистентных пациентов. К кортикочувствительным относят больных, у которых на фоне приема системных или ингаляционных кортикостероидов ремиссия достигается быстро и поддерживается длительно. Многочисленные осложнения гормональной терапии являются дозозависимыми, именно поэтому вопрос о подборе адекватной дозы препаратов глюкокортикоидных гормонов и диагностике стероидрезистенности является одной из самых актуальных проблем пульмонологии.

Известен способ диагностики стероидрезистентности у больных БА, согласно которому стероидрезистентными считают пациентов, у которых после 7-дневного курса лечения преднизолоном в дозе не менее 20 мг в сутки, объем форсированного выдоха за первую секунду (0ФB1) увеличивается менее чем на 15% по сравнению с исходным (Шмушкович Б.И. Клиническая эффективность и механизмы противовоспалительного действия глюкокортикоидных гормонов в лечении больных бронхиальной астмой // Бронхиальная астма. / Под ред. А.Г. Чучалина - 1997. - Т. 2. - С. 224-253). К недостаткам способа следует отнести высокие дозы назначаемых глюкокортикоидных гормонов.

Известен способ диагностики стероидрезистентности у больных БА, основанный на оценке связывающей способности глюкокортикоидных рецепторов радиолигандным методом (Spahn J.D., Landwehr L.P., Nimmagadda S., Surs W., Leung D. Y. M. , Szefler S.J. Effects of glucocorticoids on lymphocyte activation in patients with steroid-sensitive and steroid-resistant asthma //J. Allergy Clin. Immunol. -1996. - Vol. 98, N. 6. - Р. 1073-1079).

Известен способ диагностики стероидрезистентности у больных БА, основанный на оценке связывающей способности глюкокортикоид-рецепторных комплексов с соответствующими сайтами на ДНК методом изменения электрофоретической подвижности образцов (Adcock IM, Lane SJ, Brown CR, Peters MJ, Lee TH, Barnes, PJ. Differences in binding of glucocorticoid receptor to DNA in steroid-resistant asthma. J Immunol. - 1995. - Vol. 154. - P. 3500-3505).

Известен способ диагностики стероидрезистентности у больных БА, основанный на количественном определении соотношения глюкокортикоидных рецепторов и методом специфических моноклональных антител (Christodoulopoulos Р. , Leung D. Y. M., Elliott M. W., Hogg J. С., Muro S., Toda M., Laberge S., Hamid Q. A. Increased number of glucocorticoid receptor-beta-expressing cells in the airways in fatal asthma // J. Allergy Clin. Immunol. - 2000. - Vol. 106, N. 3. - P.479-484), так как было показано, что глюкокортикоидные рецепторы- подавляют вызванную глюкокортикоидными рецепторами- активацию генов-мишеней в мононуклеарах периферической крови.

Известен способ диагностики стероидрезистентности у больных БА, основанный на подавлении глюкокортикоидными гормонами in vitro фитогемагглютинин индуцированной пролифирации лимфоцитов (Corrigan C.J., Brown P.H., Barnes N. C., Szefler S.J., Tsai J.-J., Frew A.J., et al. Glucocorticoid resistance in chronic asthma: glucocorticoid pharmacokinetics, glucocorticoid receptor characteristics, and inhibition of peripheral blood Т cell proliferation by glucocorticoids in vitro // Am. Rev. Respir. Dis. - 1991- Vol.144. -P. 1016-1025).

Все указанные способы, несмотря на высокую специфичность, чрезвычайно дорогостоящи и доступны хорошо оснащенным специализированным лабораториям, в связи с чем не могут быть применены в практической работе и имеют только фундаментальное значение.

Известен способ диагностики стероидрезистентности у больных БА, включающий определение индуцированной липополисахаридом продукции туморнекротизирующего фактора (TNF) мононуклеарами периферической крови пациентов в динамике на фоне проведения курса терапии глюкокортикоидными гормонами. Диагностический вывод делают исходя из того, что преднизолон подавляет индуцированную липополисахаридом продукцию TNF только у кортикочувствительных, но не у стероидрезистентных пациентов (Vecchiarelli A., Siracusa A., Cenci Е. , et al. Effect of corticosteroid treatment on interleukin-1 and tumour necrosis factor secretion by monocytes from subjects with asthma // J. Clin. Exp. Allergy. -1992. - Vol. 22. - P.365 - 369). Данный способ принят за прототип.

Однако известный способ основан на определении способности мононуклеаров периферической крови пациентов к индуцированной продукции TNF in vitro и требует выделения культуры лимфоцитов.

Задачей изобретения является создание способа диагностики стероидрезистентности у больных БА in vivo, обладающего более высокой информативностью.

Поставленная задача решается тем, что в известном способе диагностики стероидрезистентности у больных бронхиальной астмой, включающем исследование биологической жидкости в динамике на фоне проведения курса терапии глюкокортикоидными гормонами, согласно изобретению в качестве биологической жидкости берут мокроту, определяют в ней содержание интерлейкина 8 (IL-8) и при отсутствии снижения его содержания диагностируют стероидрезистентность.

Предложенный способ диагностики стероидрезистентности основан на определении уровня IL-8 в мокроте больных бронхиальной астмой, т.е. в условиях in vivo, что позволяет оценивать влияние гормональной терапии на воспалительные клетки дыхательных путей пациента, а не искусственно выделенные культуры клеток. Так как IL-8 является иммунным медиатором, основной функцией которого является регуляция хемотаксиса иммуноцитов к месту развертывания патологических процессов, исследование содержания IL-8 в мокроте больных БА является более информативным, чем в крови.

Способ был разработан на основании исследования 18 больных гормонозависимой БА. Кроме традиционной бронхолитической и противовоспалительной, больные получали системную глюкокортикоидную терапию per os в течение одной недели. Среди больных было 9 пациентов, получавших терапию препаратами глюкокортикоидных гормонов через рот в дозе, не превышающей 15 мг преднизолона в сутки (кортикочувствительные пациенты) и 9 больных, получавших более 20 мг преднизолона в сутки через рот (стероидрезистентные пациенты).

У всех пациентов определяли уровень IL-8 в мокроте методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческих наборов ТОО "Цитокин" (Санкт-Петербург, Россия) в фазу обострения и в динамике через 8-14 дней после начала глюкокортикоидной терапии в фазу затихающего обострения или ремиссии заболевания. При этом кортикочувствительные и стероидрезистентные пациенты достоверно отличались по влиянию гормональной терапии на уровень IL-8 в мокроте: у кортикочувствительных больных наблюдали существенное снижение, а у стероидрезистентных пациентов - отсутствие снижения или повышение содержания IL-8 в мокроте в динамике на фоне пероральной гормональной терапии (t=5,0; p<0,05).

Способ осуществляют следующим образом.

Обследуемому больному назначают курс глюкокортикоидной терапии per os и определяют содержание IL-8 в мокроте в динамике: в фазу обострения и на 8-14 день лечения. Определение содержания IL-8 в мокроте проводят методом иммуноферментного анализа в любой известной модификации, например, описанной R. A. Егgег, Т. В. Casale IL-8 and JGE-mediated inflammation. // Eur. Respir. J/ -1998. -V. 11 N 2 - р. 229-306. Перед проведением исследований образцы мокроты необходимо гомогенизировать на ультрацентрифуге со скоростью 5000 оборотов в минуту в течение 30 минут. Анализ проводится в три стадии.

На первой стадии калибровочные пробы с известной концентрацией IL-8, a также исследуемые образцы инкубируют в лунках стрипованного планшета с иммобилизованными на поверхности лунок высокоспецифичными антителами к IL-8.

На второй стадии связавшийся в лунках с антителами IL-8 обрабатывают антителами к IL-8, меченными биотином.

На третьей стадии в лунки вносят конъюгат авидин-пероксидазы.

После удаления избытка конъюгата в лунки вносят субстратную смесь, содержащую перекись водорода и о-фенилендиамин, для выявления комплекса "Антиген- IL-8-Конъюгат". При этом о-фенилендиамин окисляется с образованием красителя, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации IL-8 в анализируемом образце.

Ферментативную реакцию останавливают добавлением стоп-реагента, а интенсивность окраски измеряют на фотометре для иммуноферментного анализа при длине волны 492 нм.

При отсутствии снижения содержания IL-8 диагностируют стероидрезистентность у обследуемого больного.

Способ иллюстрируется следующими клиническими примерами.

Пример 1. Больная П., 53 года. Болеет бронхиальной астмой в течение 7 лет. Течение бронхиальной астмы тяжелое. Доза пероральных глюкокортикоидов в пересчете на преднизолон составляет 25 мг в сутки.

Уровень IL-8 в мокроте при поступлении составил 1731, 726 пг/мл, в динамике, на фоне проводимой терапии, - 4313, 574 пг/мл. Исследование IL-8 в мокроте показало, что уровень IL-8 многократно превышал норму исходно, на фоне терапии снижения уровня IL-8 в мокроте не наблюдали, наоборот, содержание IL-8 в мокроте повысилось в 2,5 раза. Пациентка была расценена как больная стероидрезистентной БА.

Диагноз был подтвержден следующими исследованиями.

Показатели функции внешнего дыхания: OФB1 при поступлении 46,2% должной величины. OФB1 динамике равнялось 42,9% должной величины. Таким образом, терапия пероральными глюкокортикоидами в дозе 25 мг в сутки в пересчете на преднизолон не привела к повышению OФB1 на 15% от исходной величины и показатели функции внешнего дыхания оставались существенно ниже 60% должной.

Показатели гормонального гомеостаза: уровень 11OКС в плазме крови составил 201 нмоль/л при поступлении и 295 нмоль/л в динамике (норма 350 - 372 нмоль/л). Уровень 110КС в плазме крови несмотря на терапию пероральными глюкокортикоидами вырос в 1,5 раза, однако оставался ниже нормы.

Пример 2. Больная О., 52 года. Болеет бронхиальной астмой 8 лет. Течение бронхиальной астмы тяжелое. Доза пероральных глюкокортикоидов в пересчете на преднизолон составляет 10 мг в сутки. Уровень IL-8 в мокроте при поступлении составил 1010, 273 пг/мл, на фоне проводимой терапии 67,223 пг/мл. Исследование IL-8 в мокроте показало, что исходный уровень IL-8 многократно превышал норму, на фоне терапии наблюдалось достоверное снижение (в 15 раз) содержания IL-8 в мокроте, который почти приблизился к верхней границе нормы. Пациентка была расценена как больная кортикочувствительной БА.

Диагноз был подтвержден следующими исследованиями.

Показатели функции внешнего дыхания составили: OФB1 при поступлении 59,8% должной величины. В динамике ОФB1 69,4% должной величины. Из приведенных данных видно, что терапия пероральными глюкокортикоидами в дозе 10 мг в сутки в пересчете на преднизолон привела к стабилизации состояния и улучшению показателей функции внешнего дыхания: ОФB1 возросло на 16,1% от исходной величины.

Показатели гормонального гомеостаза: уровень 11ОКС в плазме крови составил 254 нмоль/л при поступлении и 361 нмоль/л в динамике. Уровень 11ОКС в плазме крови вырос в 1,4 раза и достиг нормальной величины.

Использование предложенного способа позволяет осуществлять диагностику стероидрезистентности у больных БА в условиях in vivo, оценивать влияние гормональной терапии на воспалительные клетки дыхательных путей пациента. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



Способ диагностики стероидрезистентности у больных бронхиальной астмой, включающий исследование биологической жидкости в динамике на фоне курса терапии глюкокортикоидными гормонами, отличающийся тем, что в качестве биологической жидкости берут мокроту, определяют в ней содержание интерлейкина 8 и при отсутствии снижения его содержания диагностируют стероидрезистентность.