СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА У БОЛЬНЫХ РАССЕЯННЫМ СКЛЕРОЗОМ

  СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА У БОЛЬНЫХ РАССЕЯННЫМ СКЛЕРОЗОМ   


(19) RU (11) 2116651 (13) C1

(51) 6 G01N33/53 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
к патенту Российской Федерации 
Статус: по данным на 28.03.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 1998.07.27 
(21) Регистрационный номер заявки: 97102373/14 
(22) Дата подачи заявки: 1997.02.18 
(45) Опубликовано: 1998.07.27 
(56) Аналоги изобретения: RU 94028951 A1, 27.09.96. Munschauer F.E. et al Circulatig CD3+, CD4+, CD 8+ T-lymphocytes in multiple sclerosis. J Clin. Immunol., 1993 Mar., 13(2) , p.113-118. 
(71) Имя заявителя: Аутеншлюс Александр Исаевич; Панкратов Евгений Валерьевич 
(72) Имя изобретателя: Аутеншлюс Александр Исаевич; Панкратов Евгений Валерьевич 
(73) Имя патентообладателя: Аутеншлюс Александр Исаевич; Панкратов Евгений Валерьевич 

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА У БОЛЬНЫХ РАССЕЯННЫМ СКЛЕРОЗОМ 

Способ может быть использован в области медицины, в частности в невропатологии и иммунологии, и позволяет более точно определять активность патологического процесса. У больного рассеянным склерозом проводят количественное определение СД8+ лимфоцитов после инкубации лимфоцитов больного с мозгоспецифическими белками - опыт и после инкубации без мозгоспецифических белков - контроль. Если содержание СД8+ лимфоцитов в опыте по сравнению с контролем возрастает выше уровня, характерного для больных в состоянии ремиссии, делают вывод об активном патологическом процессе у больного рассеянным склерозом. 1 табл. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к области медицины, а именно к невропатологии и иммунологии, и предназначено для определения активности патологического процесса у больных рассеянным склерозом (РС), т. е. для определения состояний обострения и ремиссии у данных больных. Способ может быть использован также для оценки эффективности лечения.

Предлагаемый способ по своей сути относится к методам диагностики РС. Методы диагностики РС делят на две группы:

1. Методы выявления субклинических очагов демиелинизации;

2. Методы, позволяющие судить об активности патологического процесса.

Первая группа методов разработана достаточно полно. К ней относятся, например, методы, основанные на магниторезонансной томографии и транскраниальной магнитостимуляции (Перкин Г.Д. Диагностические тесты в неврологии. -М. : Медицина, 1994, гл. 6.1.6., с. 129-131, гл. 6.1.5., с. 128), с помощью которых выявляют демиелинизацию нервных волокон.

Ко второй группе относятся методы, позволяющие определить те или иные показатели иммунного статуса, например содержание СД4+ лимфоцитов при активном процессе и при ремиссии - у клинически стабильных больных, у которых содержание этих клеток снижалось. Вторая группа методов, к которой относится предлагаемое изобретение, разработана значительно меньше, чем первая.

Известна работа ряда авторов (Munschauer F.E. et al.Circulating CD3+, CD4+,CD8+ T-lymphocytes m multiple sclerosis.J.CIin.lmmunol.l993 Mar; 13(2), p. 113-118), в которой показано, что у больных PC при поражении центральной нервной системы (ЦНС) выявлено значительное увеличение СД3+, СД4+ и СД8+ лимфоцитов, циркулирующих в крови, по сравнению со здоровыми лицами. Больные с другими заболеваниями имели уровень этих клеток выше, чем у здоровых лиц (доноров), но ниже, чем у больных PC. При эффективном лечении больных PC происходило снижение количества вышеуказанных клеток.

Эта работа могла бы лечь в основу способа определения активности патологического процесса у больных PC, так как определение повышенного содержания в крови больного СД3+, СД4+, СД8+ лимфоцитов по сравнению со здоровыми лицами обозначало бы обострение (активный процесс), а снижение содержания клеток до уровня их содержания у здоровых лиц означало бы наступление ремиссии (потеря активности). Однако такой способ имел бы невысокую точность.

Исходя из того, что PC является аутоиммунным заболеванием, т. e. клетки иммунной системы реагируют на мозговую ткань как на чужеродную и осуществляют цитотоксический эффект, количественное определение в крови тех или иных лимфоцитов не дает достаточного основания судить об активности процесса, т. к. неизвестна цитотоксическая реакция клеток на мозгоспецифические белки (МСБ), т. e. количественные характеристики лимфоцитов у больных PC не отражают активность аутоиммунного процесса, обусловленного цитотоксической реакцией лимфоцитов, что не дает возможности более точного определения активности патологического процесса у больных PC. Кроме того, сравнение показателей конкретного больного со среднестатистическими показателями для здоровых и больных людей заведомо сильно снижает чувствительность способа, т. к. показатели конкретного человека (ремиссия и обострение) могут довольно сильно отклоняться от среднестатистических данных.

Сущность предлагаемого изобретения состоит в том, что у больного PC в какой-либо биологической жидкости, например в крови, проводят количественное определение лимфоцитов, имеющих СД8 антиген, являющийся маркером СД8+ лимфоцитов - супрессорных/цитотоксических клеток (количество СД8+ лимфоцитов по отношению ко всем лимфоцитам, выраженное в процентах) после инкубации лимфоцитов больного с МСБ (опыт) и после инкубации лимфоцитов без МСБ (контроль).

Если содержание СД8+ лимфоцитов в опыте по сравнению с контролем возрастает выше уровня, характерного для больных в состоянии ремиссии, делают вывод об активном патологическом процессе у больного, если данный уровень не превышается - делают вывод об отсутствии у больного активного процесса.

Способ является новым, так как сведений о нем или об аналогичном способе не имеется в источниках по современному уровню техники.

Способ соответствует критерию "изобретательский уровень", так как авторы впервые обнаружили связь между состоянием больного (активный процесс или ремиссия) и тем показателем, который определяется по данному способу, а именно, впервые обнаружили, что при активном патологическом процессе у больного PC содержание СД8+ лимфоцитов после инкубации лимфоцитов крови больного с МСБ достоверно превышает содержание СД8+ лимфоцитов после инкубации без МСБ.

Авторы определяли у больных PC при активном процессе и при ремиссии содержание и других лимфоцитов - СД3+, СД4+, СД16+ клеток в пробах после инкубации с МСБ и после инкубации без МСБ. Однако оказалось, что только для показателя СД8+ лимфоцитов (ЛФ) наблюдается вышеуказанная связь с активностью процесса у больных PC. Стоящие за обнаруженным фактом процессы не изучены.

Количественное определение СД8+ЛФ.

Этот признак вынесен в ограничительную часть формулы, т. к. является общим для предлагаемого способа и способа, основанного на работе Munschauser F.E. et al, указанной в разделе " уровень техники ".

Авторы предлагаемого изобретения обнаружили, что после инкубации лимфоцитов больного PC с МСБ в пробе появляется дополнительное количество ЛФ, имеющих СД8 антиген, причем в случае активного патологического процесса у больного это дополнительное количество (т. e. превышение опыта над контролем) выше некоторого уровня, а в состоянии ремиссии - ниже этого уровня или равно ему. Поэтому признак "количественное определение СД8+ ЛФ" необходим для того, чтобы такое превышение обнаружить.

Данный признак может иметь различные формы выполнения. Это может быть визуальный подсчет клеток под микроскопом. Это может быть также автоматизированный или полуавтоматизированный подсчет клеток. На основе использования какой-либо метки, флюоресцентной или радиоактивной, выявляющей СД8-антиген. Тогда количество клеток будет определяться не их числом, а в других единицах. Количественное определение СД8+ ЛФ может быть выполнено в расчете на 100 ЛФ или на количество ЛФ, содержащихся в 1 мл крови больного.

Инкубация лимфоцитов больного в присутствии МСБ и без МСБ.

Инкубация проводится при температуре, обеспечивающей жизнедеятельность клеток и выявление СД8 антигенов на ЛФ. Общепринятой температурой для инкубации клеток in vitro является З7oC. Однако температура может быть и иной - несколько выше или ниже, в связи с чем может быть, например, несколько изменено время инкубации. Время инкубации должно быть достаточным для протекания процессов, приводящих к появлению дополнительных СД8+ ЛФ (достаточным для выраженности (экспрессии) на поверхности ЛФ СД8 антигенов). Оно может составлять два часа. Но оно может быть изменено, как уже указывалось выше, например, при изменении температуры инкубации или других приемов, составляющих данный способ, что является вообще общим правилом для каждого способа - изменение в одном приеме приводит к взаимосвязанным изменениям в других приемах, чтобы был получен тот же самый результат. В данном случае режим инкубации, температура и время должны быть такими, чтобы обеспечить протекание процессов, приводящих в присутствии МСБ к появлению дополнительных по сравнению с контролем (где отсутствует МСБ) ЛФ, выявляемых как СД8+ ЛФ, которые в отсутствие МСБ выявляются как СД8+ ЛФ в меньшем количестве. Присутствие МСБ в опыте обязательно во всех случаях выполнения изобретения.

Дополнительное количество СД8+ ЛФ может иметь место (может выявляться) и в пробах больных в состоянии ремиссии, если их ЛФ инкубировать в присутствии МСБ. Но в остром состоянии (при активном патологическом процессе) это дополнительное количество превышает некоторый уровень, характерный для больных в состоянии ремиссии. При том способе количественной оценки, который мы использовали (визуальный подсчет под микроскопом), а также описанных нами в разделе "Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения" режимных моментах, концентрациях препаратов и проч., этот уровень, отделяющий больных в состоянии ремиссии и в остром состоянии, составляет 14%. То есть, если содержание СД8+ ЛФ в опыте превышает их содержание в контроле на 14% и больше, это означает, что у больного идет активный патологический процесс, если превышение содержания СД8+ ЛФ в опыте по сравнению с контролем составляет меньше 14% - больной находится в состоянии ремиссии. Этот уровень был выбран на том основании, что у 91% больных в острой стадии, превышение опыта над контролем было на 14% процентов и более, а у больных в состоянии ремиссии в 82% имелось превышение опыта над контролем менее чем на 14%. При варьировании приемов способа данный количественный критерий может измениться и поэтому должен быть специально определен.

Содержание СД8+ ЛФ может быть определено в любой биологической жидкости организма - в крови, спинномозговой жидкости и т.п.

Выделение лимфоцитов из гепаринизированной венозной крови человека осуществляли по общепринятой методике (Новиков Д.К..Новикова В.И. Клеточные методы иммунодиагностики. - Минск: Беларусь, 1979, глава 2, с.20-27).

Ресуспендированные в 300 мкл раствора Хэнкса лимфоциты делят на 2 части по 150 мкл в каждой пробирке и добавляют в одну пробирку 150 мкл раствора Хэнкса - контроль, а в другую 150 мкл раствора Хэнкса с растворенным в нем 120 мкг мозгоспецифических белков - опыт.

Получение мозгоспецифических белков проводят по известной методике (Иммунологические методы. Под ред. Х.Фримеля.-М.: Мир, 1979, с.254-255).

Обе пробирки помещают в термостат при температуре, принятой для поддержания нормальной жизнедеятельности клеток in vitro - около 37oC, например 37,0, на 2 ч, т.е. на период, достаточный для экспрессии СД8 антигена. Затем в каждую пробирку добавляют до 10 мл среды 199 и центрифугируют 5 - 7 минут при 1500 оборотов в минуту, сливают надосадочную жидкость, ресуспендируют осадок в 50 мкл среды 199 и добавляют в каждую пробирку 20 мкл мышиных моноклональных антител ICO-31 против антигена СД8 ЛФ человека, производства НПЦ "Медбиоспектр", г. Москва.

Пробирки оставляют при комнатной температуре на 30 мин. После чего добавляют в каждую пробирку по 1 мл раствора Хэнкса и центрифугируют 5 - 7 мин при 1500 об/мин, затем сливают надосадочную жидкость, ресуспендируют осадок в 50 мкл раствора Хэнкса и вносят в каждую пробирку по 20 мкл антител, против иммуноглобулинов G мыши, меченных флюоресцеинизотиоцианатом производства НПЦ "Медбиоспектр", г. Москва. Пробирки помещают в холодильник при +4oC на 30 мин, после чего содержимое пробирок - лимфоциты дважды отмывают центрифугированием в 1 мл физраствора (5 - 7 мин при 1500 об/мин.) и ресуспендируют в 50 мкл физиологического раствора. Затем клетки помещают на предметное стекло, покрывают сверху покровным стеклом и наблюдают под люминесцентным микроскопом при объективе 90 и окуляре 7. Учитывают свечение клеток в каждой из пробирок. Подсчитывают только количество светящихся лимфоцитов на 100 лимфоцитов из контрольной и опытной пробирок.

У больных до начала лечения при активном процессе отмечены демиелинизация головного и спинного мозга, нарушения проводимости нервных волокон. Они характеризовались наличием цереброспинальной формы заболевания, которая выражалась в зрительных нарушениях, в подкорковых нарушениях в виде тремора, координаторных дисфункциях, в двигательных нарушениях - спастический тетрапарез, в тазовых расстройствах по центральному типу.

При ремиссии, после эффективного лечения, процесс демиелинизации остановлен. Наблюдается улучшение проводимости нервных волокон, отмечается уменьшение либо почти полное купирование двигательных нарушений, координаторных расстройств, исчезновение тремора, уменьшение тазовых дисфункций.

Пример 1. Больной С-в, 28 лет, поступил на лечение с диагнозом РС. У больного отмечены демиелинизационные очаги в левом полушарии (тотально) и спинном мозге, атрофия коры, атрофия мозжечка, кисты лобной доли. Выявлено значительное нарушение проводимости нервных волокон. Отмечаются грубый тремор, грубая спастика в ногах, тазовые расстройства. У больного активный патологический процесс.

Результаты обследования по предлагаемому изобретению: количество СД8+ ЛФ на 100 ЛФ при инкубации без МСБ-30 (относительное количество); относительное количество при инкубации с МСБ-38. Процент превышения, рассчитанный следующим образом (38-30) / 30 100%, составил 27%.

После лечения: остановлен процесс демиелинизации головного мозга, нет демиелинизационных очагов в спинном мозге, нет роста кисты лобной доли. Улучшилась проводимость нервных волокон в два раза, нет тремора, нет спастики, нет тазовых расстройств. У больного наступила потеря активности патологического процесса (ремиссия). Результаты обследования по предлагаемому способу - 8%.

Пример 2. Больная К-ва, 34 года, поступила на лечение с диагнозом РС, у больной отмечены демиелинизация головного и спинного мозга, нарушения проводимости нервных волокон, грубая атаксия, скандирование речи, спастический тетрапарез (в ногах почти плегия), т.е. у больной отмечен активный патологический процесс.

Результаты обследования по предлагаемому способу - 45%, что соответствует активному процессу.

После лечения у больной остановлен процесс демиелинизации, улучшилась проводимость нервных волокон, уменьшились атаксия, спастика и скандирование речи. Произошла стабилизация процесса и началась стадия ремиссии. Результат обследования по предлагаемому способу - 13%. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



Способ определения активности патологического процесса у больных рассеянным склерозом, включающий количественное определение СД8+ лимфоцитов, отличающийся тем, что такое определение проводят после инкубации лимфоцитов больного с мозгоспецифическими белками - опыт и после инкубации лимфоцитов без мозгоспецифических белков - контроль, и если содержание СД8+ лимфоцитов в опыте по сравнению с контролем возрастает выше уровня, характерного для больных в состоянии ремиссии, делают вывод об активном патологическом процессе у больного.