СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НЕПЕРЕНОСИМОСТИ ОРГАНИЗМОМ РЕБЕНКА СУЛЬФИТОВ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ЛЕЙКОТРИЕНОВ В ЛАВАЖЕ ИЗ РОТОВОЙ ПОЛОСТИ ПОСЛЕ ЭКСПОЗИЦИИ С УКАЗАННЫМ СОЕДИНЕНИЕМ

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НЕПЕРЕНОСИМОСТИ ОРГАНИЗМОМ РЕБЕНКА СУЛЬФИТОВ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ЛЕЙКОТРИЕНОВ В ЛАВАЖЕ ИЗ РОТОВОЙ ПОЛОСТИ ПОСЛЕ ЭКСПОЗИЦИИ С УКАЗАННЫМ СОЕДИНЕНИЕМ


RU (11) 2155963 (13) C2

(51) 7 G01N33/84 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 09.07.2007 - прекратил действие 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2000.09.10 
(21) Регистрационный номер заявки: 95120223/14 
(22) Дата подачи заявки: 1995.11.28 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 1995.11.28 
(45) Опубликовано: 2000.09.10 
(56) Аналоги изобретения: ПОТЕМКИНА А.М. Применение подъязычной пробы для этиологической диагностики пищевой аллергии у детей. - Вопросы охраны материнства и детства, 1981, N 7, с.15-18. EP 0085362 A2, 10.08.1983. WO 94/27147 A1, 24.11.1984. US 4853325 A, 01.08.1989. US 4812402 A, 14.03.1989. JP 61262657 A, 02.12.1986. JP 03134565 A, 07.06.1991. 
(71) Имя заявителя: Московский научно-исследовательский институт педиатрии и детской хирургии 
(72) Имя изобретателя: Святкина О.Б.; Пампура А.Н.; Бобровская Т.А.; Погомий Н.Н.; Амур-Санан А.И. 
(73) Имя патентообладателя: Московский научно-исследовательский институт педиатрии и детской хирургии 
(98) Адрес для переписки: 127412, Москва, ул.Талдомская 2, Московский НИИ педиатрии и детской хирургии МЗ МП РФ 

(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НЕПЕРЕНОСИМОСТИ ОРГАНИЗМОМ РЕБЕНКА СУЛЬФИТОВ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ЛЕЙКОТРИЕНОВ В ЛАВАЖЕ ИЗ РОТОВОЙ ПОЛОСТИ ПОСЛЕ ЭКСПОЗИЦИИ С УКАЗАННЫМ СОЕДИНЕНИЕМ 

Изобретение относится к медицине, в частности аллергологии, педиатрии и основан на возможности определения непереносимости при воздействии причиннозначимых соединений, вызывающих патологические реакции. В смыве из ротовой полости, полученном после экспозиции с сульфитом натрия, определяют уровень лейкотриенов. При увеличении указанного уровня лейкотриенов относительно контроля диагностируют непереносимость сульфитов организмом ребенка. Способ неинвазивен, позволяет получить достоверные результаты. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к медицинe (аллергология, педиатрия). В основу работы положена идея о возможности определения медиаторов аллергии в смывах из ротовой полости после провокации соединением, вызывающим реакции непереносимости, с целью диагностики непереносимости отдельных препаратов.

С развитием индустриализации на одно из первых мест в разработках практического здравоохранения выдвигаются вопросы защиты населения от последствий загрязнения окружающей среды. При этом существенная доля в структуре заболеваемости в промышленно развитых регионах принадлежит аллергическим болезням. Это связано как с дополнительной аллергенной нагрузкой, так и со снижением резистентности иммунокомпетентных клеток при прямом токсическом действии ксенобиотиков.

Следует отметить, что концепция генеза аллергической реакции за последнее десятилетие претерпела коренные изменения. Стала очевидной существенность вклада воспалительного звена в этот процесс. Показана значительная роль синтеза и высвобождения целого ряда медиаторов, в том числе и липидных медиаторов аллергии, таких как лейкотриены (ЛТ) и фактор активации тромбоцитов (ФАТ) в реализации аллергической реакции. Эти липидные медиаторы отвечают за воспроизведение патофизиологической фазы аллергического ответа. Они полностью имитируют картину немедленной фазы аллергической реакции и, кроме того, индуцируют воспаление, в ходе которого формируется неспецифическая гиперчувствительность, существенно осложняющая картину заболевания, способствующая его прогрессированию. В связи с этим изменилась и направленность в поисках новых диагностических методов.

Из литературы известно, что трудности диагностики реакций непереносимости обусловлены тем, что наиболее широко применяемые в аллергологии диагностические тесты - аллерголотический анамнез, кожные пробы, определение специфического IgE - при данной патологии недостаточно информативны, особенно при диагностике реакций непереносимости, в механизме и реализации которых может отсутствовать типичный IgE-ответ (непереносимость нестероидных противовоспалительных препаратов, сульфитов). В связи с этим разработка и внедрение в практику здравоохранения новых специфических методов выявления неиммунной гиперчувствительности становятся весьма актуальной.

Наиболее близкими аналогами предлагаемого метода могут являться носовой и ротовой провокационные тесты.

При носовом провокационном тесте определяется обструкция носовых ходов (ринометрия) и уровень высвобождения в лаважную жидкость воспалительных медиаторов (гистамина, простагландинов - Elisa), а также микроскопическое определение клеток в осадке (Alam R. et al., J. Immunol. Meth., 1992, 155, 25-29; Austin C.& Foreman J., Br. J. Clin. Pharm., 1994, 37, 33-36). Метод рекомендован:

1) для использования с диагностической целью при аллергическом рините (иногда только локальный тест подтверждает специфическую сенсибилизацию и позволяет более точно дифференцировать причиннозначимый аллерген) (Huggins К., Lancet, 1975,2,148);

2) для определения эффективности и уточнения механизма действия лекарственных препаратов (ингибиция ранней или замедленной реакции) (Naclerio R., Ann. Allergy, 1993, 71, 292-5; Davies R. et al., Rinol., 1993, 31, 159-174);

3) для определения эффективности действия специфической терапии (Hedling, Clin. Exp. Allergy, 1990, 20, 491-500);

4) для исследования механизмов аллергического ответа (научный аспект).

Провокационный носовой тест имеет огромное значение в качестве модельной системы для исследования иммунных ответов в связи с изучением как секретируемых соединений, так и функционирования провоспалительных клеток при контролируемой аллергической реакции.

Аналогичные исследования возможны и при ротовом провокационном тесте (Потемкина А.М.- Применение подъязычной пробы для этиологической диагностики пищевой аллергии у детей.- Вопросы охраны материнства и детства, 1981, N7, 15-8), который является наиболее близким прототипом предлагаемого метода.

Однако все описанные тесты имеют следующие существенные недостатки:

1) по своей сути они являются провокационными и проводятся до появления клинических симптомов аллергии (ринорея, заложенность носа, гиперемия, жжение, зуд и отек языка и области глотки, зуд кожи, сыпь, суxие хрипы в легких, вплоть до развития приступов удушья, тошнота, боль в животе, диарея), по которым в основном и производится учет. Следовательно, проведение проб опасно для жизни и здоровья больного;

2) описанные тесты не дают возможности для безопасной диагностики реакций непереносимости, возникающих без участия иммунных механизмов (непереносимость сульфитов, аспирина), хотя на сегодняшний день доказано, что непереносимость нестероидных противовоспалительных препаратов встречается у 5-20% больных бронхиальной астмой, а непереносимость сульфитов - у 2-10% больных с аллергией (Simon R., 1987; Settipane G., 1983). При этом несвоевременная диагностика этих состояний приводит не только к утяжелению течения заболевания, но и к тяжелым анафилактоидным реакциям со смертельным исходом (Chester Е., 1984; Nadel J. et al., 1965; Sheppard D. et al., 1980). Кожные пробы для диагностики непереносимости сульфитов не используются, т.к. из-за отсутствия типичного IgE-ответа на сульфиты, которые не являются гаптенами и не образуют полных аллергенов, кожные пробы являются отрицательными. Диагноз непереносимости сульфитов подтверждается в слепом пероральном тесте с увеличивающимися дозами сульфита натрия от 5 до 50 мг в желатиновых капсулах. Бронхоспазм происходит через 15-30 мин, а у некоторых (приблизительно 15%) больных - через час после провокации (Stevenson D. & Simon R., 1981). Проведение подобных проб у детей невозможно из-за опасности для жизни и здоровья.

Предлагаемый нами метод определения лейкотриенов в лаваже из полости рта имеет следующие преимущества:

1) диагностика производится при существенно более низких дозах провоцирующего соединения, не вызывающих патофизиологических реакций у больных благодаря фиксации результатов при определении уровня лейкотриенов в лаваже;

2) так как лейкотриены являются соединениями, ответственными за конечную фазу аллергической реакции - патофизиологический ответ, их наличие в лаваже прямо определяет сосудистые, спастические и бронхообструктивные изменения, характерные для аллергических заболеваний, т.е. позволяет исследовать механизмы аллергического ответа и диагносцировать реакции непереносимости, протекающие по неиммунному механизму;

3) динамическое наблюдение с использованием неинвазивного теста орального лаважа с последующим определением уровня лейкотриенов, уровень и спектр которых максимально близко коррелирует с клиническими проявлениями у больных с аллергией (Круглый Б.И., 1989; Погомий Н.Н., 1990; Пампура А.Н., 1995), может применяться для контроля за проводимой терапией.

Цель изобретения: разработка нового неинвазивного диагностического метода определения непереносимости химических соединений (в том числе в отсутствии типичных IgE-опосредованных реакций), отличающийся определением уровня липидных медиаторов аллергии, основных компонентов медленно действующего вещества анафилаксии - лейкотриенов, в лаважной жидкости ротовой полости, увеличение уровня которых происходит при стимуляции веществом, вызывающим реакции повышенной чувствительности у ребенка.

Описание метода.

Исследуемый ребенок прополаскивает рот обычной кипяченой водой для удаления остатков пищи (после завтрака) и не ест в течение 40 мин. Затем, набрав в рот 5 мл дистиллированной воды, держит ее в течение 5 мин. Сбор смыва производится в чистую сухую баночку объемом не менее 20 мл. Полученную пробу сразу замораживают (при -30oC) или обрабатывают для выделения ЛТ. Осаждение белков проводят добавлением 1 М HCl до pH 3-4 с последующим центрифугированием в течение 10 мин (10000 g, 4C).

Дальнейшую обработку супернатанта проводят в колонках (ODS C18 Alltech, США), предварительно активированных последовательными объемами по 5 мл 70%-ного водного раствора ацетонитрила, затем 20%-ного ацетонитрила и чистой дистиллированной водой. Выделения ЛТ из колонки при последовательном пропускании по 5 мл дистиллированной воды (жидкость удаляют), раствора 20%-ного ацетонитрила (жидкость удаляют) и раствора 70%-ного ацетонитрила - пробу собирают в пробирку, затем упаривают в вакуумном испарителе. Сухой осадок хранят при -30oC (Sherhan C.- HPLS separation and detection of lipoxins.-Meth. Enzymol.-1990, 187, 167-75; Ramis l. et al. - Simultaneous reversed phase extraction of lipoxygenase and cyclooxygenase metabolits of arachidonic acid in nasal secretion, methodological aspects.- J.Chromatogr., 1990, 16, 532 (2), 217-25).

Качественный состав и количество ЛТ определяют на жидкостном хроматографе высокого разрешения (Altex 110 A, УФ детектор, "Spectroflow") при 280 нм с использованием колонок "Ultrаsphere C18 (4,6250 мм) в системе ацетонитрил-вода-уксусная кислота (55: 45: 0.045). Время элюции и количество ЛТ определяют по стандартам LTB4, LTC4, LTE4 ("Serva") (Peters S. et al.// J. Immunol. Methods.- 1983.- V. 64.- P.335-43).

При определении гиперчувствительности к сульфитам ребенок в течение 5 мин (экспозиция) держал во рту 1,3 мМ раствор сульфита натрия. Контролем служат результаты исследования у этих же детей при использовании дистиллированной воды, проводимые накануне.

Нами обследованы 25 детей с различными аллергическими заболеваниями (атопический дерматит, гастроинтестинодермальный синдром и гастроинтестинодермальный синдром в сочетании с бронхиальной астмой) со здоровыми зубами или предварительно санированной полостью рта, без воспалительных проявлений в полости рта из экологически неблагоприятных регионов. Смывы у детей проводились дважды: с дистиллированной водой (5 мл, экспозиция 5 мин) и сульфитом натрия (13 мМ, 5 мл, 5 мин). У всех больных детей в водных смывах были обнаружены лейкотриены (у здоровых детей лейкотриены в смывах из полости рта не определяются). У 13 больных (у 11 из них имелись указания на непереносимость сульфитов в анамнезе) обнаружено увеличение высвобождения медиаторов в присутствии сульфита натрия. Так, исходный уровень ЛТ в лаваже из ротовой полости в группе составлял B4-0,170,01, C4-0,130,0, E4-0,460,03 после провокации сульфитом натрия уровень ЛТ соответственно составил B4 -0,880,14, C4 - 1,230,11, E4 - 2,850,34 (p<0,01). У детей, не имевших гиперчувствительности к сульфитам, уровень ЛТ под воздействием сульфита натрия не изменялся. Кроме того, в качестве контрольной на чувствительность к сульфитам была обследована группа детей с банальным гастритом, ассоциированным с Helicobacter Pilory. У этих больных также не обнаружено увеличения уровня ЛТ в смывах из ротовой полости с сульфитом натрия.

Таким образом, метод определения лейкотриенов в смывах из ротовой полости является достоверным неинвазивным методом для определения гиперчувствительности к сульфитам. Ухудшения состояния детей при проведении этого теста при наблюдении в течение 24 ч нами обнаружено не было.

Больной Иванов Алексей Александрович, (N1117) 14 лет, диагноз: нейродермит, распространенная форма, период обострения.

При комплексном аллергологическом обследовании не было выявлено причиннозначимого аллергена, кожная проба с сульфитом натрия (13 мМ - 0,5 мл в физиологическом растворе) была отрицательной. Из анамнеза известно, что обострение кожного процесса у ребенка связано с употреблением в пищу продуктов, содержащих консерванты. Для диагностики непереносимоcти проводился смыв из полости рта с дистиллированной водой (контроль, 5 мл в течение 5 мин) и с сульфитом натрия (экспозиция 5 мин, 5 мл 1,3 мМ раствора). Реакций местных и общих после проведения пробы при наблюдении в течение последующих суток не было. При анализе водного смыва обнаружено высвобождение ЛТВ4 - 0,75 и ЛТЕ4 - 1,50 нг/мл, в смыве с сульфитом натрия - ЛТВ4 - 3,98 и ЛТЕ4 - 11,4 нг/мл. Таким образом, была подтверждена непереносимость сульфитов у ребенка с нейродермитом и даны рекомендации по диетическому питанию. При катамнестическом наблюдении, проводимом через 6 и 12 месяцев, показана высокая эффективность элиминационной диеты.