СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ НЕВРОЛОГИЧЕСКИХ РАССТРОЙСТВ У ДЕТЕЙ РАННЕГО ВОЗРАСТА С ПЕРИНАТАЛЬНЫМ ПОРАЖЕНИЕМ ЦНС

СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ НЕВРОЛОГИЧЕСКИХ РАССТРОЙСТВ У ДЕТЕЙ РАННЕГО ВОЗРАСТА С ПЕРИНАТАЛЬНЫМ ПОРАЖЕНИЕМ ЦНС


RU (11) 2286575 (13) C1

(51) МПК
G01N 33/53 (2006.01)
G01N 33/50 (2006.01) 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 10.08.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(14) Дата публикации: 2006.10.27 
(21) Регистрационный номер заявки: 2005116108/15 
(22) Дата подачи заявки: 2005.05.26 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2005.05.26 
(45) Опубликовано: 2006.10.27 
(56) Аналоги изобретения: RU 2092164 C1, 10.10.1997. RU 2157534 C1, 10.10.2000. RU 2121682 C1, 10.11.1998. SU 1837226 A1, 30.08.1993. ЯВОРСКАЯ Э.Ф. Клиническое значение изменений уровня нейрон-специфической енолазы у новорожденных детей с перинатальной патологией центральной нервной системы, Автореф. дис. к.м.н., М., 1990. THORNBERG E et al, Neuron specific enolase in
asphyxiated newborns: association with encephalopathy and cerebral function monitor trace, Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed. 1995 Jan; 72 (1): F 39-42, (реф.), PMID: 7743283 [он-лайн] [2006.01.23.], найдено из БД PubMed.

(72) Имя изобретателя: Афонин Александр Алексеевич (RU); Авилов Сергей Евгеньевич (RU); Шокарев Александр Викторович (RU); Зайцева Надежда Григорьевна (RU); Строгулин Владимир Владимирович (RU); Афонина Тамара Андреевна (RU) 
(73) Имя патентообладателя: Ростовский НИИ акушерства и педиатрии МЗСР РФ (RU) 
(98) Адрес для переписки: 344012, г.Ростов-на-Дону, ул. Мечникова, 43, РНИИАП, патентный отдел 

(54) СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ НЕВРОЛОГИЧЕСКИХ РАССТРОЙСТВ У ДЕТЕЙ РАННЕГО ВОЗРАСТА С ПЕРИНАТАЛЬНЫМ ПОРАЖЕНИЕМ ЦНС
Изобретение относится к области медицины, а именно к педиатрии. Для прогнозирования течения неврологических расстройств у детей раннего возраста с перинатальным поражением ЦНС в сыворотке крови новорожденного определяют нейроспецифическую енолазу и гомокарнозин и рассчитывают прогностический коэффициент: Р=0,328×ГК+0,0004×НСЕ 2-0,041×НСЕ+0,604, где НСЕ - нейроспецифическая енолаза (в нг/м), ГК - гомокарнозин (в нмоль/м). Если величина рассчитанного коэффициента меньше 0,54, то прогнозируют благоприятное течение заболевания на фоне стандартной базисной терапии с исчезновением неврологической симптоматики к концу первого года жизни. В случае, если рассчитанный коэффициент будет больше 0,54, прогнозируют неблагоприятное течение заболевания. Для осуществления способа требуется достаточно малое количество сыворотки. Способ обеспечивает высокую чувствительность и диагностическую точность. 1 табл.




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Изобретение относится к области медицины, а именно к педиатрии, и найдет использование для прогнозирования исходов перинатального поражения ЦНС средней степени тяжести у детей первого года жизни.

Проблема перинатального постгипоксического поражения мозга является чрезвычайно актуальной и находится в центре внимания научных исследований. Неврологическая картина у новорожденных детей с перинатальным постгипоксическим поражением ЦНС во многом зависит от степени зрелости мозга, тяжести его повреждения, сопутствующих заболеваний. Однако клиническая симптоматика не всегда отражает истинную тяжесть и степень поражения ЦНС, что, в частности, может быть обусловлено высоким потенциалом нейропластичности головного мозга ребенка первого года жизни. Этим можно объяснить тот факт, что исход заболевания, в том числе и неблагоприятный, становится очевидным лишь к 9-12 месяцам жизни (Ю.И.Барашнев, 2001). По мнению некоторых авторов (J.L.Wayenberg et al., 1994) наиболее ценной для прогноза гипоксических поражений головного мозга является динамика неврологических нарушений. Также прогностически неблагоприятными у детей с гипоксически-ишемическим поражением ЦНС являются стойкие некупирующиеся судороги в первые дни жизни. В то же время известно, что клиническая картина не всегда отражает истинную тяжесть состояния, степень поражения ЦНС и дальнейший прогноз развития ребенка (М.И.Баканов и соавт., 2003).

Наблюдения ряда исследователей (C.J.Peden et al., 1993; B.Azzarelli et al., 1996) показали, что нейросонография рассматривается как скрининговый метод, для выделения группы детей, которой необходимо провести более глубокие компьютерно-томографическое, магнитно-резонансное, протонно-спектроскопическое исследования. Однако некоторые авторы (H.F.R.Prechtl et al., 1993) подчеркивают, что ЭЭГ и видеозапись спонтанной двигательной активности в первые сутки жизни у детей с энцефалопатией более ценны, чем неврологический осмотр и данные нейросонографии. При использовании нейросонографии исследователи склонны принимать во внимание преимущественно грубые повреждения мозговой ткани: внутрижелудочковое кровоизлияние, перивентрикулярную лейкомаляцию. Выявляемым ишемическим очагам и мелким кистам не придается существенного значения. Основным аргументом при этом является обнаружение указанных дефектов только при повторном обследовании новорожденных.

С этих позиций очень актуальным является поиск диагностических и прогностических маркеров, отражающих сохранение и выраженность патологических изменений нервной системы с целью адекватного и своевременного терапевтического вмешательства в патологический процесс, когда лечение приходится на фазу обратимых нарушений.

При изучении патентной и научно-медицинской литературы выявлен ряд способов для прогнозирования состояния ЦИС и исходов заболевания у новорожденных.

Известно, что при действии различных патологических агентов, в том числе ишемии, имеющей место при перинатальном поражении ЦНС, возникают различные виды альтерации нейрональных мембран. Этот процесс сопровождается высоким уровнем в крови нейроспецифических белков, которые используют в качестве маркеров различных патологических изменений, происходящих в ЦНС (Н.Н.Володин и соавт., 1998; R.Tabakman et al., 2002). Эти белки являются тканеспецифическими для нервной системы и гистогенетически относятся к нейроэпителиальной ткани, т.е. нейронам и глиальным компонентам нервной системы. При этом значимые изменения уровней НСБ в ликворе и крови можно зафиксировать значительно раньше, чем те структурные нарушения, которые выявляются современными методами инструментального и лабораторного обследования.

Известен способ определения состояния новорожденного (А.с. СССР № 1416917, 1988 г.), который предусматривает непосредственно после рождения определение содержания малонового диальдегида в плазме крови, взятой из пульсирующей артерии и вены пуповины, с последующим вычислением отношения первого показателя ко второму, и при величине 1,0-1,3 констатируют удовлетворительное состояние, 1,4-1,6 - состояние с высоким перинатальным риском, 1,7 и более тяжелое. Однако этот способ имеет ряд недостатков: необходим двухкратный забор крови /из артерии и вены/; артериовенозная разница зависит от большого числа параметров, которые трудно учесть, кроме того, показатели ПОЛ изменяются при большом спектре патологических состояний, что делает метод менее точным и специфичным, создание специальных условий и временных затрат.

Способ прогнозирования течения и исходов гипоксически-ишемических поражений центральной нервной системы у новорожденных с респираторным дистресс-синдромом (патент РФ №2192779, 2002.11.20), заключающийся в том, что с помощью компьютерного анализа обработки определяют показатели спектральной мощности - ритма, его пространственное распределение и, если с первых суток реанимации максимальные показатели спектральной мощности отмечаются в затылочных и теменных зонах, достигая соответственно 119-160 мкВ2 и 106-138 мкВ2, а на 2-3 сутки мощностные характеристики - ритма достоверно преобладают в левом полушарий по сравнению с правым, прогнозируют благоприятный исход заболевания.

По данным Н.Н.Володина и соавт. (2001 г.) современные методы инструментальной диагностики, позволяющие проводить прижизненную визуализацию различных отделов ЦНС, определять обширность и локализацию тех или иных структурных повреждений, остаются неинформативными на ранних стадиях патологических процессов, которые развиваются в нервной ткани вскоре после перенесенного неблагоприятного воздействия.

Прототипом заявляемого изобретения выбран способ прогнозирования развития новорожденного (патент РФ №2092164, 1997.10.10), заключающийся в том, что в пуповинной крови определяют содержание связанной воды эритроцитов, которое свидетельствует о состоянии компенсаторных процессов новорожденного ребенка и позволяет судить о его развитии и, при содержании связанной воды эритроцитов менее 12,5%, прогнозируют удовлетворительное развитие новорожденного, а при содержании связанной воды эритроцитов более 12,5% прогнозируют развитие с перинатальным риском. Данный способ имеет чувствительность 86,7 специфичность 85,4 предсказательную ценность положительного теста 86,7. Данный способ не оценивает течение и исход патологии и позволяет прогнозировать только нарушение компенсаторных процессов, только в первые сутки жизни.

Этот факт является основанием для расширения поиска более чувствительных методов диагностики и контроля за состоянием ЦНС у детей.

Задача изобретения - разработка более информативного метода для раннего и своевременного выявления осложненного течения неврологического заболевания.

Поставленная задача решается тем, что у новорожденного в сыворотке крови определяют нейроспецифичесую енолазу и гомокарнозин, подставляют полученные значения в формулу

Р=0,328×ГК+0,0004×НСЕ 2-0,041×НСЕ+0,604,

где НСЕ - нейроспецифическая енолаза (в нг/м);

ГК - гомокарнозин (в нмоль/м),

и рассчитывают прогностический коэффициент Р. Если полученный коэффициент Р окажется меньше 0,54, то прогнозируют благоприятное течение заболевания на фоне стандартной базисной терапии с исчезновением неврологической симптоматики к концу первого года жизни. Если же полученный коэффициент Р будет больше 0,54, прогнозируют неблагоприятное течение заболевания. Для расчетов используют программу Polyanalist.

При помощи заявляемого способа повышается точность прогнозирования течения патологии ЦНС у детей раннего возраста:

Точность метода 91,25%.

Чувствительность метода 90,70%.

Специфичность метода 93,58%.

Техническим результатом изобретения является ускорение, упрощение и повышение точности прогнозирования течения неврологических расстройств у детей раннего возраста.

Согласно данным литературы (В.А.Березин, Я.В.Белик, 1990; Н.Н.Володин и соавт., 1998; A.Garcia-Alix et al.,1994; A. Rodrnguez-Nucer et al., 1999; R.P.Berger et al., 2002) большое количество научных исследований посвящено оценке диагностической и прогностической информативности нейроспецифической енолазы (НСЕ), увеличение концентрации которой в сыворотке крови человека может служить маркером повреждения клеточных мембран нейронов головного мозга. Енолаза (2 фосфо-Д-глицератгидролаза) является гликолитическим ферментом, представленным изоэнзимными димерами с молекулярной массой примерно 80 тыс. дальтон. Эти димеры представляют собой комбинации трех иммунологически отличных субъединиц: , , . За последние годы идентифицированы 5 изоферментов енолазы: , , , , . Изофермент с субъединичным составом , названный нейроспецифической енолазой (НСЕ), содержится в цитоплазме и дендритах нейронов и нейроэндокринных клетках (М.И.Баканов и соавт., 2003; V.M.Pickel al., 1976; P.J.Marangos D.Schmechel et al., 1979; К.Kato et al., 1982) и на сегодняшний день считается одним из наиболее специфических маркеров их поражения. Нейроспецифическая енолаза, участвуя в процессах гликолиза, выполняет в нейронах ферментативную функцию. В сыворотке крови в норме НСЕ присутствует в концентрациях от 2 до 5 нг/мл. В нормальных условиях гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) является непроницаемым для специфических маркеров поражения клеток головного мозга. Значительное проникновение фермента через поврежденные плазматические мембраны клеток мозга при перинатальных поражениях ЦНС может свидетельствовать о выраженности структурно-функциональных и деструктивных нарушений цитомембран мозга (М.И.Баканов и соавт., 2003). Многие исследователи (В.А.Березин, Я.В.Белик, 1990; Э.Ф.Яворская, 1990; В.Н.Подкопаев, 1991; J.Karkela et al, 1993; D.Tirschwell et al., 1997; S.Dunker et al., 2001; A.Rodrnguez-Nucer et al., 2001) отмечают быстрое нарастание концентрации НСЕ в крови при гипоксии, травмах головного мозга и других патологических состояниях, сопровождающихся массовой деструкцией нейронов.

Существенную диагностическую и прогностическую значимость имеет определение в крови детей, перенесших перинатальную гипоксию мозгоспецифического соединения - гомокарнозина (С.Б.Бережанская, 1988). Гомокарнозин - дипептид, состоящий из гамма-аминомаслянной кислоты (ГАМК) и гистидина, синтезируется только в мозге с участием фермента гомокарнозин-карнозинсинтетазы. Его относят к тормозным медиаторам ЦНС, участвующим в формировании и осуществлении функций головного мозга (А.А.Кричевская и соавт., 1985; R.Tabakman et al., 2002). По мнению А.А.Болдырева (1994), карнозин и его производные обладают выраженным стабилизирующим действием на клеточные структуры и биомакромолекулы, в том числе ДНК. Гомокарнозин нейроспецифичен и в других тканях и биологических жидкостях не обнаруживается (J.N.Van Balgooy et al., 1975). Несмотря на то, что гомокарнозин хорошо проникает через гематоэнцефалический барьер, в ликворе здоровых людей он отсутствует. В литературу имеются сведения о повышении содержания гомокарнозина в мозге и ликворе у неврологических больных. Так, Т.И.Бондаренко и соавт. (1982) выявили увеличение в 10-18 раз концентрации этого пептида в ликворе детей с гидроцефалией по сравнению с контролем, а также повышение содержания гомокарнозина в ликворе и крови детей, страдающих эпилепсией и лейкодистрофией. По мнению О.А.Petroff et al. (2000), у детей с различными заболеваниями ЦНС происходит нарушение метаболизма гомокарнозина в ткани мозга.

Предшествующие исследования в совокупности с собственными исследованиями позволили разработать простую доступную методику прогнозирования течения неврологических расстройств у детей раннего возраста с перинатальным пораженим ЦНС. Математическая обработка полученных данных позволила разработать формулу, имеющую прогностическую значимость для оценки исхода перинатального поражения ЦНС к концу первого года жизни:

Р=0,328×ГК+0,0004×НСЕ 2-0,041×НСЕ+0,604,

где НСЕ - нейроспецифическая енолаза (в нг/м);

ГК - гомокарнозин (в нмоль/м).

Если прогностический коэффициент Р является меньше 0,54, то можно прогнозировать благоприятное течение заболевания на фоне стандартной базисной терапии с исчезновением неврологической симптоматики к концу первого года жизни, если полученный коэффициент является больше 0,54, прогнозируют неблагоприятное течение заболевания.

Подробное описание метода

Заявленный метод осуществляется следующим образом. У новорожденного с перинатальным поражением ЦНС берут 1 мл венозной крови, которую отдают на исследование.

Для оценки состояния гематоэнцефалического барьера проводят определение концентрации нейроспецифических компонентов сыворотки крови: определение содержания нейроспецифической енолазы (НСЕ) иммуноферментным методом с помощью коммерческих наборов и аппаратуры фирмы "Roshe" (Швейцария). Для этого брали 25 мкл сыворотки крови, параллельно ставили контрольные и стандартные пробы, добавляли по 250 мкл анти-НСЕ - реагента и шарик, покрытый моноклональными антителами к НСЕ. После инкубации в течение 60 минут при 37°С шарики промывали и добавляли 250 мкл раствора пероксидазы и антител к иммуноглобулинам, проводили повторную инкубацию в тех же условиях и добавляли 250 мкл раствора 0-фенилендиамина. Пробы инкубировали при 18-26°С в темноте в течение 30 минут. Реакцию останавливали добавлением 1 мл серной кислоты и измеряли оптическую плотность образцов при длине волны 492 нм.

Концентрацию гомокарнозина в крови вены новорожденного определяют методом А.В.Young, S.H.Snyder (1973) в модификации Т.И.Бондаренко и М.Г.Маклецовой (1982). Для этого безбелковые центрифугаты сыворотки крови пропускали через колонку со смолой Дауэкс 50 W×8 в натриевой форме, уравновешенную 0,1 М натрий-ацетатным буфером (рН 4,6), с последующим последовательным промыванием 1 мл 0,1 н, 7 мл 1 н, 2 мл 1,5 н и 1 мл 3 н соляной кислотой. Собирали и высушивали фракцию, вымываемую 3 н HCl, в которой содержится гомокарнозин. Растворяли в 0,1 мл воды и проводили электрофорез в 0,1 н боратном буфере рН 10,0 при напряжении 300 В в течение 3 часов. Полученные фореграммы окрашивали диазотированной сульфаниловой кислотой по Паули. Пятна на фореграммах, соответствующих местоположению гомокарнозина, вырезали, заливали 3 мл воды и через 30 минут колориметрировали при длине волны 500 нм.

Работоспособность заявляемого способа подтверждается следующими клиническими примерами.

Пример 1. Ребенок А-ва. Родился 11.07.03 г. (ист. болезни №4468) у женщины 19 лет, от 1 беременности, протекавшей на фоне раннего и позднего гестоза, осложненной миопией обоих глаз, фетоплацентарной недостаточностью, 1 родов в состоянии средней тяжести, массой 3600 г, длиной 54 см, оценка по шкале Апгар 7-8 баллов. Кожные покровы и слизистые субиктеричной окраски, чистые, дыхание проводится во все отделы, хрипов нет. С рождения у ребенка отмечается неврологическая симптоматика. Ребенок осмотрен невропатологом. Диагноз: Перинатальное поражение ЦНС, среднетяжелое течение, гипертензионный синдром, синдром нервно-рефлекторной возбудимости.

В возрасте 1 месяца у ребенка взята кровь на HCE - 48,1 (нг/мл), ГК - 2,54 (нмоль/л)

Р=0,328×2,54+0,0004×48,12-0,041×48,1+0,604

Р=0,39, т.е. Р меньше 0,54.

Вывод: полученные результаты свидетельствовали о благоприятном исходе заболевания (исчезновении неврологической симптоматики на первом году жизни).

Ребенок с перинатальным поражением ЦНС средней степени тяжести получал базисную терапию, проводимую по временным отраслевым стандартам объема медицинской помощи детям, утвержденным в 1998 г. (приказ №151 от 7 мая 1998 г., МЗ РФ, г.Москва). Терапия включала дегидратационные, противосудорожные препараты, средства, улучшающие мозговое кровообращение и регулирующие метаболические процессы в центральной нервной системе.

В возрасте 9 месяцев жизни ребенок консультирован невропатологом. Диагноз: Здоров.

Пример 2. Ребенок Б-ев. Родился 10.10.03 г. (ист. болезни №2248) у женщины 36 лет, беременность которой протекала на фоне раннего и позднего гестоза, фетоплацентарной недостаточности, анемии. Ребенок родился в состоянии средней тяжести, массой 3200 г, длиной 51 см, оценкой по шкале Алгар 7-8 баллов. Кожные покровы и слизистые розовые, чистые, дыхание проводится во все отделы, хрипов нет. С рождения у ребенка отмечается неврологическая симптоматика. Ребенок консультирован невропатологом. Диагноз: Перинатальное поражение ЦНС, среднетяжелое течение, гипертензионный синдром, синдром вегето-висцеральных нарушений, пирамидный синдром.

В возрасте 1 месяца у ребенка взята кровь на HCE - 57,7 (нг/мл), ГК - 3,86 (нмоль/л).

Р=0,328×3,86+0,0004+57,7 2-0,041×57,7+0,604

Р=0,835, т.е. Р больше 0,54.

Вывод: полученные данные свидетельствуют о возможности неблагоприятного исхода заболевания (т.е. сохранении неврологической симптоматики к первому году жизни).

Ребенок с перинатальным поражением ЦНС средней степени тяжести получал базисную терапию, проводимую по временным отраслевым стандартам объема медицинской помощи детям, утвержденным в 1998 г. (приказ №151 от 7 мая 1998 г., МЗ РФ, г.Москва). Терапия включала дегидратационные, противосудорожные препараты, средства, улучшающие мозговое кровообращение и регулирующие метаболические процессы в центральной нервной системе. Однако, несмотря на проводимое лечение, неврологическая симптоматика сохранялась после первого года жизни.

В возрасте 12 месяцев жизни ребенок консультирован невропатологом. Диагноз: Перинатальное поражение ЦНС, среднетяжелое течение, гипертензионный синдром, пирамидный синдром. Лечение ребенка продолжено.

Проведенные нами многочисленные биохимические исследования убедительно доказывают, что у детей, родившихся с перинатальными повреждениями ЦНС средней степени тяжести, имели место значительные отклонения в системе ГК и НСЕ, свидетельствующие о глубоком повреждении нейронов мозга. В представленной таблице показаны индивидуальные показатели в наблюдаемых группах детей.

Интервалы индивидуальных показателей у детей с перинатальным поражением ЦНС средней степени тяжести 
I группа II группа 
n=47 n=53 
исчезновение неврологической симптоматики к концу первого года жизни сохранение неврологической симптоматики к концу первого года жизни 
НСЕ (в нг/мл) 32,4-46,5 47,4-78,1 
ГК (в нмоль/л) 2,02-2,68 2,79-3,92 
Р Р<0,54. Р>0,54 


Здесь: НСЕ - нейроспецифическая енолаза (в нг/м);

ГК - гомокарнозин (в нмоль/м);

P - прогностический коэффициент.

Таким образом, проведенные нами биохимические исследования позволили выявить определенные критерии, на основании которых можно прогнозировать исход неврологических нарушений у детей к концу первого года жизни. Так, если у новорожденных с перинатальным поражением ЦНС средней степени тяжести рассчитан коэффициент Р меньше 0,54, то можно достоверно прогнозировать исчезновение неврологической симптоматики на первом году жизни, а если коэффициент Р больше 0,54, то можно достоверно прогнозировать стойкое сохранение неврологической симптоматики у детей на протяжении первого года жизни. Полученные знания позволят педиатрам и невропатологам своевременно назначать детям адекватную терапию и снизить количество осложнений.

Наиболее существенным преимуществом заявляемого способа является чрезвычайно малое количество сыворотки (1,0 мл), необходимой для исследования, в сочетании с высокой чувствительностью и диагностической точностью. Кроме того, способ не травматичен и не имеет противопоказаний.

Способ апробирован на значительном по объему клиническом материале и найдет широкое применение в педиатрической практике.


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ прогнозирования течения неврологических расстройств у детей раннего возраста с перинатальным поражением ЦНС путем исследования крови, отличающийся тем, что у новорожденного в сыворотке крови определяют нейроспецифическую енолазу и гомокарнозин, и рассчитывают прогностический коэффициент по формуле:

Р=0,328×ГК+0,0004×НСЕ2-0,041×НСЕ+0,604,

где Р - прогностический коэффициент;

НСЕ - нейроспецифическая енолаза, в нг/м;

ГК - гомокарнозин, в нмоль/м,

и если полученный коэффициент является меньше 0,54, то прогнозируют благоприятное течение заболевания на фоне стандартной базисной терапии с исчезновением неврологической симптоматики к концу первого года жизни, в случае, если полученный коэффициент является больше 0,54, прогнозируют неблагоприятное течение заболевания.