СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ВНЕПЕЧЕНОЧНОЙ ПЕРСИСТЕНЦИИ ВИРУСНЫХ АНТИГЕНОВ В ТКАНЯХ У ДЕТЕЙ, БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ГЕПАТИТОМ В, ИЛИ ДЕЛЬТА, ИЛИ С

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ВНЕПЕЧЕНОЧНОЙ ПЕРСИСТЕНЦИИ ВИРУСНЫХ АНТИГЕНОВ В ТКАНЯХ У ДЕТЕЙ, БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ГЕПАТИТОМ В, ИЛИ ДЕЛЬТА, ИЛИ С

RU (11) 2146825 (13) C1

(51) 7 G01N33/576 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
к патенту Российской Федерации 
Статус: по данным на 28.03.2007 - прекратил действие 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2000.03.20 
(21) Регистрационный номер заявки: 98109122/14 
(22) Дата подачи заявки: 1998.05.07 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 1998.05.07 
(45) Опубликовано: 2000.03.20 
(56) Аналоги изобретения: Жданов В.М. и др. Вирусные гепатиты. - М.: Медицина, 1986, с.215-218. Григорьев П.Я. и др. Диагностика и лечение хронических болезней органов пищеварения. - М.: Медицина, 1990, с.161-167. RU 2065164 C1, 10.08.96. US 4642285 A, 10.02.87. WO 94/25874 A1, 10.11.94. WO 94/27153 A1, 24.11.94. WO 94/11737 A1, 26.05.94. EP 0154392 A2, 11.09.85. 
(71) Имя заявителя: Харламова Флора Семеновна; Учайкин Василий Федорович; Чередниченко Татьяна Васильевна; Конев Владимир Александрович; Ковалев Олег Борисович; Писарева Екатерина Александровна 
(72) Имя изобретателя: Харламова Ф.С.; Учайкин В.Ф.; Чередниченко Т.В.; Конев В.А.; Ковалев О.Б.; Писарева Е.А. 
(73) Имя патентообладателя: Харламова Флора Семеновна; Учайкин Василий Федорович; Чередниченко Татьяна Васильевна; Конев Владимир Александрович; Ковалев Олег Борисович; Писарева Екатерина Александровна 
(98) Адрес для переписки: 125130, Москва, ул.З. и А.Космодемьянских, д.40, кв.64, Харламовой Ф.С. 

(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ВНЕПЕЧЕНОЧНОЙ ПЕРСИСТЕНЦИИ ВИРУСНЫХ АНТИГЕНОВ В ТКАНЯХ У ДЕТЕЙ, БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ГЕПАТИТОМ В, ИЛИ ДЕЛЬТА, ИЛИ С 

Изобретение относится к медицине, в частности педиатрии и патологии клеточного иммунитета. Путем бескровной скарификации эпидермиса кожи получают отпечаток клеточного экссудата кожной асептической воспалительной реакции (АВР). У больных гемабластозом на фоне хронического вирусного гепатита получают мазок костно-мозгового пунктата во время диагностической трепанобиопсии. В полученных образцах с помощью специфических сывороток стандартных современных тест-систем для ИФА проводят непрямым методом идентификацию вирусных антигенов гепатита В, или Дельта, или С в макрофагах, лимфоцитах кожной АВР и в клетках костно-мозгового пунктата. Способ чувствителен, не требует применения трудоемких, технически сложных приемов получения специфических сывороток, дорогостоящих реактивов и аппаратуры. 4 ил., 1 табл. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Область применения

Способ относится к медицине (педиатрии), патологии клеточного иммунитета, к диагностике внепеченочной персистенции вирусных антигенов в тканях у детей, больных хроническим гепатитом B, или Дельта, или C, позволяющий контролировать санацию организма от вирусных антигенов на фоне лечения.

Уровень техники.

В настоящее время метод иммуноферментного анализа (ИФА) привлекает внимание многих исследователей, как один из наиболее чувствительных способов определения специфических маркеров инфекционных заболеваний и доступных для внедрения в практику здравоохранения.

Аналоги.

В области инфекционной гепатологии с конца 70-х годов успешно используется в нашей стране и зарубежными исследователями иммунопероксидазный метод (его непрямой вариант) для диагностики вирусных гепатитов A, B, гриппа, хронической герпетической инфекции и др. на препаратах клеток печени и крови, фиксированных на предметном стекле (Давыдова А.А., 80; Кетиладзе Е.С., 78; Avrameas S, 72; Levy H.A. et al, 60; Nakane P.K. et al., 66; Polson A., et al. , 64; Walters G., et al, 76). Для обработки исследуемых препаратов в качестве специфической иммунной сыворотки, а также в качестве второго компонента исходного материала для получения иммунопероксидазных конъюгатов указанными авторами использовались глобулиновые фракции сыворотки реконвалесцентов гепатита A (4-6 мес после выздоровления) и сывороток доноров, содержащих анти-HBs.

С помощью сульфатно-риванолового метода проводилось выделение глобулиновой фракции, используемой в качестве специфической иммунной сыворотки, которая лишена была примесей.

Известен также метод, основанный на осаждении сыворотки сульфатом аммония с последующей хроматографией на колонке с ДЕАЕ-целлюлозой (Levy H.A., Sober H. A., 60) и метод 2-кратного осаждения 20% раствором полиэтиленгликоля (Polson A. , Portgieter G.M. et al, 64) для выделения глобулинвоых фракций, но они трудоемки и требуют большего для проверки чистоты получаемых препаратов; при этом глобулиновые фракции, получаемые этими 2-мя методами, содержат нежелательные примеси неспецифических белков и других веществ, от которых можно избавиться только аффинной хроматографией сложной и трудоемкой процедурой, не всегда приемлемой в условиях лабораторных исследований. Авторы контролировали чистоту получаемых препаратов методом иммуноэлектрофореза с антисывороткой против всех сывороточных белков человека.

Библиография аналогов: 1) Давыдова А.А., Шубладзе А.К., Захарова Н.А. и др. - Вопросы вирусологии, 1980, N 1, с. 100-102.

2) Кетиладзе Е.С., Жданов Н.Н., Херрман Х. и др. - Там же, 1978, N 6, с. 695-699.

3) Avrameas S., Guilbert B. - Biochimie, 1972, v. 54, p. 837-842.

4) Levy H.A., Sober H.A. - Proc. Soc. exp. Biol. (N.Y.) 1960, v. 103, p. 250-251.

5) Polson A. , Potgieter G.M., Largier I.F. et al. - Biochim. Biophis. Acta, 1964, v. 82, p. 463-475.

6) Wolters G., Kuijpers I., Kacaki I. et al. - J. Clin. Path., 1976, v. 29, p. 873-879.

Прототип.

Известен метод иммунофлюоресцентного тестирования антигенов гепатита B (HBsAg и HBeAg) непосредственно в биоптатах печени и материалах аутопсии. Принцип этого метода основан на способности антител, меченных флюоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ), соединяться специфично с гомологичным антигеном. Известны 2 варианта метода: 1) прямой - при котором антиген выявляется меченными антиген-специфическими антителами; 2) непрямой - при котором после реакции специфических антител с антигеном (1 этап) применяется флюоресциирующая антисыворотка к сыворотке того вида животного (антикроличья, антилошадиная и т.д.), на котором была приготовлена сыворотка для индикации антигена (2 этап).

Исследование HBsAg и HBeAg проводится в формалинфиксированных парафиновых средах, субстратах суспензии органов и в изолированных печеночных клетках.

Под покровное стекло на срезы, находящиеся во влажной камере, наносят на один препарат анти-HBs-глобулины, а на другой - анти-HBe-глобулины, взятые в рабочем разведении. Затем влажную камеру помещают на 45-60 мин в термостат при 37oC. Этого времени вполне достаточно для проникновения антител в клетки и специфического взаимодействия их с антигенами. После этого покровные стекла удаляют, конъюгаты встряхивают и препараты помещают в разные сосуды с забуференным раствором натрия хлорида, охлажденным до 4oC на 20-30o мин со сменой его не менее 3 раз. Затем препараты докрашивают 30 мин при t - 37oC антивидовым ФИТЦ-глобулином. После этого вновь промывают в забуференном изотоническом растворе натрия хлорида 20-30 мин со сменой не менее 2 раз, подсушивают под объективом в люминесцентном микроскопе МЛ-2, используя светофильтры СС-15-2, ФС-1-4, БС-8,2 и в качестве вторичного - светофильтр N 2.

Интенсивность специфического свечения значительно вариабельна и не всегда адекватна количеству антигена из-за преобладающего фонового свечения парафиновых срезов, которое интерферирует с антигенспецифическим, что снижает процент положительных результатов.

Библиография прототипа.

1. Mathiesen L, Fauezholdt L., Moller A. et al. Immunofluorescence stadies for hepatitis A virus, hepatitis B surface and cor antigen in liver biopsies from patients with acute viral hepatitis - Gastroenterology, 1979, v. 77, # 4, pt. 1, p. 623-628.

2. Жданов В.М., В.А. Ананьев, В.М. Стаханова - Вирусные гепатиты - Москва, Медицина, 1986, с. 215-218.

Критика аналогов и прототипа.

Перечисленные аналоги и прототип непрямого ИФА, используемых для идентификации вирусных антигенов гепатитов A и B в клетках печени и периферической крови, отличаются от предлагаемого метода недостаточной чувствительностью, технологической сложностью с применением дорогостоящих реактивов, аппаратуры и сложной технологии получения кроличьей иммунной сыворотки против IgG человека.

Сущность изобретения.

Нами предлагается способ диагностики внепеченочной персистенции вирусных антигенов в тканях у детей, больных хроническим гепатитом B, или Дельта, или C с помощью непрямого иммуноферментного анализа (ИФА), при котором в макрофагах и лимфоцитах экссудата кожной асептической воспалительной реакции - АВР (тест "кожного окна" по Rebuck J.W.), а также в клетках костномозгового пунктата с помощью специфических сывороток стандартных тест-систем ИФА проводят идентификацию вирусных антигенов (HBeAg, HDAg, HCV-антигенов). Указанным способом проводится также динамическая оценка эффективности противовирусной и иммунокорригирующей терапии в отношении санации организма от вирусов-возбудителей данного заболевания.

Дополнительной целью является безопасность заявленного метода для жизни больного - малая травматизация больного ребенка - проведение бескровной скарификации кожи, а для больных с хроническим гепатитом на фоне гемобластоза - получение отпечатка костномозгового пункта только при проведении диагностической трепанобиопсии по поводу гемобластоза.

Решение этой задачи достигается (в отличие от аналогов и прототипа) тем, что в предлагаемом способе исключаются пункционная биопсия печени или забор периферической крови, а проводится на предплечье скарификация кожи (эпидермиса) до дермального слоя капилляров - кровотечение не допускается (участок размером 0,5х0,5 см), на который накладывается стерильное стекло, фиксируемое лейкопластырем. Через 24 часа стекло с отпечатком клеточного экссудата АВР, содержащего макрофаги и лимфоциты, снимается, высушивается и фиксируется ацетоном. В дальнейшем проводится ингибирование эндогенной пероксидазы в клетках АВР 0,1 М раствором азида натрия с 1% перекисью водорода в течение 10 мин при t - 20oC. После этого препарат промывается дважды в фосфатном буфере pH - 7,2 - 7,4 и однократно в дистиллированной воде (фиг. 1).

Для идентификации HBeAg в макрофагах или лимфоцитах кожной АВР на отпечаток клеточного экссудата капают иммунную специфическую сыворотку, содержащую "anti-HBe", с которой контакт длится в течение 30-40 мин во влажной камере при t - 37oC. После промывания в фосфатном буфере pH - 7,2-7,4 и дистиллированной воде аналогично проводится контакт с "anti-HBe"-конъюгатом мышиных моноклональных антител с пероксидазой хрена в течение 20-30 мин при 37oC во влажной камере. Затем препарат промывается в фосфатном буфере и дистиллированной воде подобно ранее описанному. Субстратная реакции проводится с 1 частью 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (5 ммоль/л) в диметилсульфоксиде с водой по 250 мкл с 4 частями субстратного буфера (перекиси водорода в цитратном буфере) при 37oC в течение 15 мин. Останавливают реакцию добавлением 1 мл серной кислоты. Высушивают и микроскопируют в световом микроскопе с иммерсией (об. 90). Коричневое окрашивание цитоплазмы и ядра клеток свидетельствует об идентификации HBeAg в макрофагах или лимфоцитах (фиг. 2).

Для проведения этого ИФА использовалась тест-система HBeAg EIA COBAS CORE "Roche" Российско-Швейцарского предприятия.

Для идентификации HDAg в клетках АВР (макрофагах и лимфоцитах) использовали диагностическую тест-систему "Вектогеп-Д" АО "Вектор-Бест".

Контакт препарата проводился в течение 24 часов со специфической сывороткой, содержащей "anti-Delta", разведенной в 10 мл дистиллированной воды. После промывания в фосфатном буфере и дистиллированной воде указанным ранее способом, проводилась в течение 1 часов при t - 37oC инкубация препарата клеток с конъюгатом - 1,3 мл (антител к вирусу гепатита Дельта, меченных пероксидазой хрена), разведенным в 12 мл фосфатного буфера. После инкубации препарат промывался в фосфатном буфере. Субстратная реакция проводилась в течение 30 мин при t - 25oC. Цитратно-фосфатный буферный раствор с перекисью водорода - 5 мл служил растворителем для 1 таблетки ортофенилдиамина (ОФД).

Реакцию останавливали добавлением стоп-реагента и высушивали. Препараты микроскопировали с иммерсией в световом микроскопе (об. 90). Буро-коричневое окрашивание цитоплазмы клеток свидетельствовало об идентификации HDAg (фиг. 3).

Для идентификации HCV вирусных антигенов "Core-c и NS4-c" в клетках (макрофагах и лимфоцитах) зоны АВР, препараты обрабатывались 10 мкл специфической сыворотки, содержащей "anti-HCV" в течение 30-40 мин при t - 37oC. Затем промывались фосфатным буферным раствором. В дальнейшем проводилась инкубация препарата клеток со 100 мкл конъюгата (диагностических антител против иммуноглобулинов человека, связанных с пероксидазой хрена) в течение 20-30 мин при t - 37oC. После промывания в фосфатно-буферном растворе, проводилась субстратная реакция (1 таблетка хромогена - ортофенилдиамина растворялась в 13 мл субстратной буферной смеси с гидроперитом). На препарат клеток наносилось 100 мкл раствора хромогена, контакт с которым длился в течение 15 мин при t - 15-25oC. Остановка субстратной реакции осуществлялась добавлением 50 мкл раствора серной кислоты (1 моль/л). Препараты высушивались и микроскопировались с иммерсией (об. 90). Коричневое окрашивание цитоплазмы клеток свидетельствовало об идентификации указанных антигенов HCV (фиг. 4).

Для проведения данного непрямого ИФА использовалась тест-система "HepasCan" Биотехнологической Компании Биосервис. Аналогичным образом проводилась идентификация HBsAg и HBeAg в клетках костномозгового пунктата (мазках на стекле).

Указанными тест-системами было обследовано 97 детей с хроническими гепатитами В, Д и С. Из них у 65 детей был хронический гепатит В (у 25 - на фоне гемобластоза), у 17 - хронический гепатит Д и у 15 - хронический гепатит С. (см. табл.).

Для идентификации вирусных маркеров в клетках костного мозга у всех больных гемобластозом и у 5 больных (4 - с ХГВ и у 1 - с ХГД) без гемобластоза проводилась трепанобиопсия. Контрольную группу составили 5 больных гемобластозом, у которых имел место умеренно выраженный синдром цитолиза, при этом в сыворотке крови маркеры указанных вирусов не обнаруживались. Кроме того, в контрольной группе были больные с кишечной инфекцией и ОРВИ, у которых также проводился ИФА сыворотки крови на указанные вирусные антигены (10 чел. ).

У всех больных исследовали клеточный экссудат зоны АВР в тесте "кожного окна" по Rebuck J.W., (55), с целью идентификации вирусных маркеров, однако у больных, страдающих гемобластозом на фоне ХГВ, ее проведение было малоэффективным в связи с тем, что у них в силу иммунодепрессии, отсутствовала миграция клеток. Тем не менее, при проведении непрямого ИФА у этих больных, отмечалось коричневое окрашивание экссудата в отпечатках АВР, что косвенно свидетельствовало об HBV-антигенемии в коже.

Результаты проведенных исследований у больных с ХГВ и ХГД приводятся в таблице 1, где помимо предлагаемых нами модификаций непрямого ИФА, представлены данные по идентификации HBsAg в макрофагах АВР и клетках костного мозга по методу В.И. Васильевой с использованием более ранних трудоемких технологий НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи.

Среди больных хроническим гепатитом C в макрофагах кожи у 66,7% больных идентифицировались указанные антигены HCV, что в среднем составило при минимальной и умеренной активности 81 клеток, а при высокой степени активности - 52 клеток с положительным окрашиванием на антигены.

Внепеченочная персистенция вирусных антигенов выявляется на фоне нарушения фагоцитарной активности клеток системы мононуклеарных фагоцитов и гуморального звена фагоцитарной системы, что обусловливает генерализованное поражение различных систем и органов помимо печени при хронических вирусных гепатитах и является предпосылкой для применения иммунокорригирующей и противовирусной терапии. Индикатором эффективности указанной терапии при данном заболевании следует считать предлагаемые методы непрямого ИФА для оценки санации организма от вирусных антигенов. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



Способ диагностики внепеченочной персистенции вирусных антигенов в тканях у детей, больных хроническим гепатитом В, или Дельта, или С, с помощью непрямого иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что путем бескровной скарификации эпидермиса кожи получают отпечаток клеточного экссудата кожной асептической воспалительной реакции, а у больных гемобластозом на фоне хронического вирусного гепатита получают мазок костно-мозгового пунктата, в которых с помощью специфических сывороток стандартных тест-систем ИФА проводят индентификацию в макрофагах, лимфоцитах кожной асептической воспалительной реакции и в клетках костного мозга антигенов вируса В, или Дельта, или С.