СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСНЕЙТРАЛИЗУЮЩИХ АНТИТЕЛ ПРИ ВИРУСНОЙ ДИАРЕЕ - БОЛЕЗНИ СЛИЗИСТЫХ ОБОЛОЧЕК КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСНЕЙТРАЛИЗУЮЩИХ АНТИТЕЛ ПРИ ВИРУСНОЙ ДИАРЕЕ - БОЛЕЗНИ СЛИЗИСТЫХ ОБОЛОЧЕК КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА


RU (11) 2255976 (13) C2

(51) 7 C12N5/00, A61K39/00 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 10.08.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(14) Дата публикации: 2005.07.10 
(21) Регистрационный номер заявки: 2003124954/15 
(22) Дата подачи заявки: 2003.08.11 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2003.08.11 
(43) Дата публикации заявки: 2005.02.10 
(45) Опубликовано: 2005.07.10 
(56) Аналоги изобретения: В.Н.Сюрин и др. “Диагностика вирусных болезней животных”, Справочник, Москва, “Агропромиздат”, 1991, - стр.195-211. “Антитела. Методы” под ред. Д.Кэтти, Москва, “Мир”, 1991, 164-195. P.M.Хаитов “Иммуногенетика и иммунология: резистентность к инфекции, Ташкент, 1991, стр.32-38. 
(72) Имя изобретателя: Глотов А.Г. (RU); Глотова Т.И. (RU) 
(73) Имя патентообладателя: Государственное научное учреждение Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Сибирского отделения Россельхозакадемии (ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН) (RU) 
(98) Адрес для переписки: 630501, Новосибирская обл., Новосибирский р-н, пос.Краснообск, а/я 708, ГНУ ИЭВС и ДВ, директору, чл.-корр. РАСХН А.С.Донченко 

(54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСНЕЙТРАЛИЗУЮЩИХ АНТИТЕЛ ПРИ ВИРУСНОЙ ДИАРЕЕ - БОЛЕЗНИ СЛИЗИСТЫХ ОБОЛОЧЕК КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к способам серологической диагностики инфекционных заболеваний крупного рогатого скота, в частности вирусной диареи - болезни слизистых (ВД КРС), а также оценке напряженности иммунитета у вакцинированных животных. Сущность изобретения состоит в том, что разработан способ, включающий выращивание перевиваемой линии культуры клеток КСТ (коронарные сосуды эмбриона коровы) в питательной среде Игла MEM с 20 мг/мл канамицина и 10% лошадиной сыворотки. Двукратные разведения инактивированных испытуемых проб сыворотки от животных (56°С, 30 минут) смешивают в равном объеме (0,05 мл) со 100 ТЦД50/0,1мл вируса и инкубируют 1 час при 37°С в CO2 инкубаторе. По окончании инкубации добавляют 0,1 мл суспензии культуры клеток КСТ в питательной среде Игла MEM, содержащей 20 мг/мл канамицина и 5% (2,5% конечная концентрация) лошадиной сыворотки. Концентрация клеток в культуре составляет 3,5×105. Учет реакции проводят через 3 дня по мере наступления цитопатогенного действия вируса в контрольных лунках, содержащих рабочую дозу вируса. Технический результат - расширение арсенала диагностических иммунологических способов для ветеринарных целей. 1 з.п.ф-лы, 2 табл.




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Изобретение относится к ветеринарии, а именно к ветеринарной вирусологии, и может быть использовано в лабораторной практике для серологической диагностики инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных, в частности для выявления вируснейтрализующих антител к вирусу вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота (ВД КРС).

До настоящего времени основным способом диагностики ВД КРС является длительная процедура, основанная на постановке реакции нейтрализации в первично трипсинизированных культурах клеток макрометодом.

Сущность метода заключается в специфическом действии нейтрализующих антител сыворотки крови подавлять способность вируса вызывать цитопатическое действие в культуре клеток.

Ее проводят в первично трипсинизированных культурах клеток ПЭК (почка эмбриона коровы) или ТБ (тестикулы бычка) по общепринятой методике. В качестве ростовой добавки для культуры клеток используется сыворотка крупного рогатого скота в количестве 10%. Культуры клеток получаются путем трипсинизации органов телят (почки, тестикулы).

Компоненты реакции: исследуемые пробы сыворотки, питательная среда и вирус используются в объеме не менее 1 мл. Реакция ставится макрометодом в биологических пробирках объемом 15 см3. В качестве рабочей дозы используют 100-400 ТЦД50/мл вируса. Рабочее разведение вируса и испытуемых проб сыворотки смешивают непосредственно перед реакцией, и после инкубации в течение одного часа вносят в сформировавшийся монослой культуры клеток.

Результаты реакции учитываются на 5-7 дни по мере наступления цитопатического действия вируса в контрольных пробирках (Сюрин В.Н. и др. Диагностика вирусных болезней животных: Справочник. - М.: Агропромиздат, 1991. - 528 с).

К недостаткам данного способа относятся: 

1. Возможность контаминации нормальной сыворотки и первично трипсинизированных культур клеток КРС антителами к вирусу, а также самим вирусом (цитопатогенными и нецитопатогенными вариантами), что искажает результаты реакции и требует поиска серонегативных к вирусу животных-доноров.

2. Использование длительной и трудоемкой процедуры трипсинизации полученных внутренних органов животных.

3. Наличие гетерогенной популяции клеток в первично трипсинизированных культурах клеток.

4. Наличие больших объемов компонентов реакции и длительность постановки и учета. 

5. Использование большого количества пробирок, особенно при массовых серологических исследованиях.

Наиболее близким решением, принятым за прототип, и наиболее близким к заявляемому по технической сущности и достигаемому эффекту, является следующий способ ретроспективной серологической диагностики ВД КРС (Dirk Deregt, Siv Smithson and Gerry C. Kozub. A short Incubation Serum Neutralization Test for Bovine Viral Diarrhea Virus// Can. J. Vet. Res. - 1992. - 56. - 161-164).

Способ включает использование первично трипсинизированной культуры клеток почки эмбриона коровы (ПЭК), полученной из свободного от ВД стада, и 10% сыворотки крови от телят также из свободного от ВД стада. Реакция проводится микрометодом в пластиковых платах.

Учет проводится через 5 дней. Рабочая доза вируса составляет 100 ТЦД50/0,1 мл .

К недостаткам данного способа относится необходимость поиска серонегативного в отношении ВД КРС стада, получение первично трипсинизированной культуры клеток и длительность учета реакции (5 дней).

Технической задачей изобретения является постановка реакции в микропланшетах, замена первично трипсинизированной культуры клеток на перевиваемую, сыворотки крови теленка на сыворотку крови лошади, изменение объема сыворотки крови лошади (до 5%) при культивировании культуры клеток и сокращение сроков учета реакции до 3 дней.

Сущность изобретения заключается в том, что в известном способе выявления вируснейтрализующих антител к вирусу ВД КРС, согласно изобретению, реакцию нейтрализации проводят микрометодом с использованием перевиваемой линии культуры клеток КСТ (коронарные сосуды эмбриона коровы).

Сущность изобретения заключается также в том, что культуру клеток КСТ выращивают в питательной среде Игла MEM с 20 мг/мл канамицина и 10% сыворотки крови лошади.

Сущность изобретения заключается также в том, что реакцию проводят в микропланшетах для культур клеток.

Сущность изобретения заключается также в том, что после инкубации равных объемов (0,05 мл) двукратных разведений исследуемой сыворотки животных и 100 ТЦЦ50/0,1 мл вируса при 37°С в СО2-инкубаторе добавляют 0,1 мл суспензии культуры клеток КСТ в концентрации клеток 3,5×10 5 в питательной среде Игла MEM, содержащей 20 мг/мл канамицина и 5% (2,5% конечная концентрация) сыворотки крови лошади соответственно.

Сущность изобретения заключается также в том, что учет реакции проводят через 3 дня.

Учет реакции проводят по мере наступления цитопатогенного действия (ЦПД) вируса в контрольных лунках, содержащих рабочую дозу вируса - 100 ТЦД50/0,1 мл. Высшее разведение сыворотки, полностью нейтрализующее ЦПД вируса в 50% инфицированных лунок, принимается за титр сыворотки. В реакции используются контроли: отрицательный контроль - сыворотки от неинфицированного КРС. Положительный - гипериммунная моноспецифическая сыворотка кролика.

Сущность технического решения раскрыта в примерах конкретного осуществления способа.

Пример 1. Выращивание перевиваемой линии культуры клеток КСТ.

Культуру клеток КСТ выращивают в культуральных матрасах емкостью 25 см3 в питательной среде Игла MEM. Для этого суспензию клеток, ресуспендированных в среде Игла MEM, в концентрации 1,2×105 в объеме 5 мл вносят в одноразовый матрас. В качестве ростостимулирующей добавки в суспензию клеток вносят 0,5 мл сыворотки крови лошади. Смесь перемешивают и помещают в условия термостата при 37°С на 48 часов. По мере формирования монослоя клеток в матрас вносят 5 мл питательной среды Игла MEM без сыворотки крови лошади и инкубируют в течение 3-5 суток до момента постановки реакции нейтрализации.

Пример 2. Подготовка исследуемых проб сыворотки крови от животных.

Исследуемые пробы сыворотки крови от больных животных прогревают на водяной бане в течение 30 минут при 56°С. После этого готовят двукратные разведения проб сыворотки крови от 1:2 до 1:1024 на питательной среде Игла MEM и необходимый объем вируса, содержащего 100 ТЦД50/0,1 мл .

После этого равные объемы двукратных разведений испытуемых проб сыворотки крови животных и 100 ТЦД50/0,1 мл по 0,05 мл смешивают в лунках микропланшета и инкубируют в течение 1 часа при 37°С в условиях СО2-инкубатора. 

Пример 3. Подготовка суспензии культуры клеток.

Культуру клеток КСТ, выращенную в пластиковых матрасах емкостью 25 см3 снимают со стекла при помощи смеси трипсина и версена в соотношении 1:9. Клетки ресуспендируют в питательной среде Игла MEM, содержащей 20 мг/мл канамицина, до концентрации 3,5×105 клеток в 1 мл и добавляют сыворотку крови лошади в объеме 5% к объему суспензии клеток (конечная концентрация 2,5%).

Пример 4. Добавление суспензии культуры клеток в микропланшеты.

По окончании времени инкубации разведений испытуемых сывороток и вируса в каждую лунку микропланшета вносят по 0,1 мл суспензии клеток. Микропланшеты закрывают крышкой и инкубируют в условиях СO2-инкубатора в течение 3 дней. 

Пример 5. Учет реакции.

Реакцию учитывают через три дня после внесения суспензии культуры клеток по мере развития цитопатического действия вируса в контрольных лунках, не содержащих исследуемые сыворотки. Титром сыворотки считают предельное ее разведение, тормозящее развитие цитопатического действия вируса в 50% зараженных лунок с культурой клеток. Положительной считается сыворотка, нейтрализующая 100 ТЦД50/0,1 мл в разведении 1:2.

Ретроспективный диагноз на ВД КРС ставят при четырехкратном и более приросте титров вируснейтрализующих антител в парных пробах сыворотки крови животных, взятых с интервалом в 3-4 недели. 

Пример 6. Сравнительное изучение эффективности стандартной методики постановки РН в пробирочной культуре клеток и заявляемой. 

Таблица 1

Сравнительная эффективность двух вариантов реакции нейтрализации 
Исследовано проб выявлено положительных /% Соотношение стандартный/ модифицированный метод, % Достоверность (Р) 
стандартный метод модифицированный метод 
400 241/60,3 289/72,3 83,0 <0,05 


Из данных таблицы 1 видно, что заявляемый тест выявляет на 12% больше положительных проб, что говорит о его более высокой чувствительности.

Пример 7. Сравнительное изучение величин и разброса титров вируснейтрализующих антител, выявляемых в пробах сыворотки крови крупного рогатого скота при помощи двух методик постановки реакции.

Таблица 2.

Величина и разброс титров вируснейтрализующих антител в пробах сыворотки крови КРС, исследованных двумя вариантами реакции нейтрализации

N=400 

Тест стандартный метод (кол-во/%) заявляемый метод (кол-во/%) 
1 2 3 
1 2 3 
Отриц(<1:2) 159/39,8 111/27,3 
1:2-1:16 200/50,0 223/55,8 
1:32-1:256 41/10,3 63/15,8 
>1:512 0/0 3/0,75 


Из данных таблицы 2 видно, что заявляемый метод постановки РН выявил на 12,5% меньше отрицательно реагирующих животных, чем стандартный.

Частота встречаемости величин титров 1:2-1:16 была у заявляемого теста на 5,8% выше, чем у стандартного, а 1:32-1:256 выше на 5,5%. Титры антител 1:512 и выше в стандартном тесте не выявлялись, а заявляемый выявил трех животных, что составило 0,75%.

Таким образом, заявляемый способ позволяет выявлять большее количество положительных проб сыворотки крови исследуемых животных в более короткие сроки в сравнении со стандартным методом постановки реакции нейтрализации.

Заявляемый метод выявляет вируснейтрализующие антитела в более высоких титрах в сравнении со стандартным методом, а количество отрицательно реагирующих животных меньше.

Время исследования 100 проб сыворотки составляет 3 дня.

По срокам постановки диагноза модифицированный метод превосходит стандартный в 2 раза. Стоимость исследования одной пробы при помощи заявляемого метода составляет 86 рублей, при помощи стандартного - 165 рублей, что в 1,9 раза снижает затраты на проведение диагностических исследований.

Способ обеспечивает достижение цели изобретения: за счет повышения эффективности выявления вируснейтрализующих антител к вирусу ВД КРС выявляется большее количество положительно реагирующих животных.




ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


1. Способ выявления вируснейтрализующих антител при вирусной диарее слизистых оболочек крупного рогатого скота, включающий реакцию нейтрализации антителами сыворотки крови животного цитотоксического действия вируса в культуре клеток, отличающийся тем, что реакцию проводят микрометодом с использованием перевиваемой линии культуры клеток коронарных сосудов эмбриона коровы (КСТ)), предварительно выращенной в питательной среде Игла MEM с 20 мг/мл канамицина и 10% сыворотки крови лошади, при этом инкубируют исследуемую сыворотку животных и 100 ТЦЦ 50/0,1 мл вируса при 37°С СО 2-инкубаторе, добавляют 0,1 мл суспензии культуры клеток КСТ в концентрации 3,5×10 в питательной среде Игла, содержащей 20 мг/мл канамицина и 5% (2,5% конечная концентрация) сыворотки крови лошади соответственно, а учет реакции проводят через 3 дня.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что реакцию проводят в микропланшетах для культур клеток.