СПОСОБ ВЫБОРА ТИПА ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ ТЕРАПИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОГНОЗА ИСХОДА ЗАБОЛЕВАНИЯ НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ИНТЕРФЕРОНОВОГО СТАТУСА БОЛЬНОГО

СПОСОБ ВЫБОРА ТИПА ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ ТЕРАПИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОГНОЗА ИСХОДА ЗАБОЛЕВАНИЯ НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ИНТЕРФЕРОНОВОГО СТАТУСА БОЛЬНОГО


RU (11) 2159936 (13) C2

(51) 7 G01N33/68 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 10.08.2007 - прекратил действие 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2000.11.27 
(21) Регистрационный номер заявки: 98105888/14 
(22) Дата подачи заявки: 1998.03.30 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 1998.03.30 
(45) Опубликовано: 2000.11.27 
(56) Аналоги изобретения: ГРИГОРЯН С.С. Оценка интерферонового статуса людей по пробам крови. Вопросы вирусологии, 1988, т. 3, N 4, с. 433 - 436. EP 0710839 A2, 08.05.1996. WO 87/05400 A1, 11.09.1987. WO 94/04922 A1, 03.03.1994. WO 96/41195 A1, 19.12.1996. US 5145773 A, 08.09.1992. JP 03179262 A, 05.08.1991. JP 60017361 A, 29.01.1985. НОВИКОВ Д.К. и др. Оценка иммунного статуса. - Москва-Витебск: Медицина, 1996, с. 49 - 62. САЧЕК М.Г. и др. Иммунологические аспекты хирургической инфекции. - Витебск, 1994, с. 99 - 103. 
(71) Имя заявителя: Ариненко Руслан Юрьевич 
(72) Имя изобретателя: Ариненко Р.Ю.; Аникин В.Б.; Иовлев В.И.; Малиновская В.В. 
(73) Имя патентообладателя: Ариненко Руслан Юрьевич 
(98) Адрес для переписки: 197374, Санкт-Петербург, ул. Савушкина 131, кв.102, Ариненко Р.Ю. 

(54) СПОСОБ ВЫБОРА ТИПА ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ ТЕРАПИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОГНОЗА ИСХОДА ЗАБОЛЕВАНИЯ НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ИНТЕРФЕРОНОВОГО СТАТУСА БОЛЬНОГО 

Изобретение относится к медицине, а именно к вирусологии и микробиологии, и касается способа выбора иммуномодулирующей терапии и определения прогноза заболевания на основе интерферонового статуса больного. Способ включает определение активности общих сывороточных интерферонов (S-ИФН), продукции лейкоцитами in vitro интерферона / и интерферона . Определение проводят в образцах цельной крови, инкубированных в среде RPMI-1640, в присутствии стандартных индукторов синтеза ИФН, посредством титрования исследуемых образцов на культуре клеток с последующей инкубацией с вирусом везикулярного стоматита. При этом используют перевиваемые культуры, чувствительные к действию ИФН. После инкубации клеток с вирусом их окрашивают раствором кристаллического фиолетового. Связавшийся краситель растворяют и его количество, пропорциональное активности ИФН, фотометрически измеряют при длине волны 570 - 590 нм. При активности S-ИФН 0 - 10 МЕ/мл, ИФН / 250 - 520 МЕ, ИФН 110 - 250 МЕ считают обследуемого здоровым. При S-ИФН 25 - 35 МЕ/мл, ИФН / 60 - 110 МЕ/мл, ИФН 30 - 55 МЕ/мл прогнозируют благоприятный исход заболевания и назначают химиопрепараты, препараты ИФН. При активности S-ИФН более 35 МЕ/мл, ИФН / - менее 60 МЕ, ИФН менее 30 МЕ прогнозируют тяжелое протекание заболевания, требующее срочного терапевтического вмешательства. При активности S-ИФН 12 - 25 МЕ/мл, ИФН / - 85 - 250 МЕ, ИФН 45 - 110 МЕ прогнозируют эронизацию патологического процесса и назначают препараты ИФН. При активности S-ИФН 0 - 10 МЕ/мл, ИФН / менее 40 МЕ, ИФН менее 20 МЕ прогнозируют неблагоприятный исход заболевания. При активности S-ИФН 12 - 40 МЕ/мл, ИФН / 60 - 400 МЕ, ИФН более 250 МЕ прогнозируют развитие нейроиммунной патологии. Способ информативен и достоверен. 2 з.п. ф-лы, 1 табл., 1 ил. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к медицине, а именно к вирусологии и иммунологии, и касается способа выбора иммуномодулирующей терапии и определения прогноза исхода заболевания на основе анализа интерферонового статуса больного.

Система интерферона (ИФН) обеспечивает противовирусную резистентность организма и влияет на весь комплекс его специфических и неспецифических защитных реакций.

Отражением функционального состояния системы ИФН является ИФН статус (1, 4), оценка которого проводится по нескольким показателям, основные из которых:

1. Количество (активность) циркулирующего в крови ИФН (общий сывороточный ИФН).

2. Уровень продукции ИФН -/ лейкоцитами (или лимфоцитами) in vitro при его индукции вирусными индукторами (интерфероновая реакция лейкоцитов - ИРЛ).

3. Уровень продукции ИФН - при его индукции митогенами в лейкоцитах (лимфоцитах) in vitro (2).

Исследование ИФН статуса позволяет определить количественные параметры физиологического интерферонового ответа у здоровых людей (1, 3, 5) и выявить интерферонодефицитные синдромы при острых, хронических, рецидивирующих инфекционных и аутоиммунных заболеваниях, первичных и вторичных иммунодефицитах (9, 11). Определение ИФН статуса достаточно информативно и может служить надежным клиническим ориентиром при диагностике, лечении и прогнозе исхода заболевания, как вирусной, так и невирусной этиологии.

Известен способ определения активности ИФН в сыворотке и плазме крови на основе торможения роста микроорганизмов в культуре. Однако данный метод не обладает достаточной чувствительностью и воспроизводимостью, не дает возможности выражения результатов в общепринятых международных единицах (ME), а также, выбора иммуномодулирующей терапии и прогноза исхода заболевания (МКИ 5 A 61 K 37/66, AC N 1082422, 1984 г.). Известен способ определения интерферонового статуса и прогноза исхода заболевания, включающий следующие стадии: кровь доноров или больных в объеме 1-1,5 мл берут из вены, добавляют гепарин, далее в 2 центрифужные пробирки вносят по 800 мкл Среды RPMI-1640, 100 мкл цельной крови, 100 мкл вируса болезни Ньюкасла (NDV) и фитогемагглютинин (ФГА) для индукции ИФН -/ и ИФН - соответственно. Конечное разведение цельной крови в объеме 1 мл - 1/10. Оставшееся количество крови использовали для получения проб сывороточного ИФН. Индукцию ИФН -/ и ИФН - проводили в течение 24 часов при 37oC в атмосфере 5% CO2. После инкубации пробы центрифугировали, надосадочную жидкость отсасывали. В пробах с индукцией синтеза ИФН -/ лейкоцитами in vitro проводили инактивацию NDV инкубацией при pH до 2.0 в течение 2-3 суток при 4oC с последующим восстановлением до рН 7.4. Пробы хранили при 4oC до титрования. При постановке титрования микрометодом использовали 96-луночные микропланшеты. Для титрования использовали клетки линии М-19 (фибробласты человека). Каждую реакцию ставили в объеме 200 мкл с двумя повторами, общий расход цельной крови при этом составлял 200 мкл. В качестве тест-вируса использовали вирус везикулярного стоматита (ВВС), штамм Индиана. За единицу активности ИФН принимали величину, обратную его разведению, задерживающую деструкцию монослоя на 50%. У здоровых доноров уровень общего сывороточного ИФН соответствовал 2-8 ед/мл, индукция ИФН-/ в культуре лейкоцитов равняется 1280 ед, ИФН- - 256 ед, при острой вирусной инфекции сывороточный ИФН равнялся 128 ед/мл, продукция ИФН-/ - 10 ед, ИФН- - 64 ед. При хронической вирусной инфекции эти показатели составляли: сывороточный ИФН 32-64 ед/мл, продукция ИФН -/ - 80 ед, ИФН - <2 ед. (Григорян С. С. Оценка интерферонового статуса людей по пробам цельной крови. Вопросы вирусологии, 1988, т. 3, N 4, с. 433-436).

Сущность изобретения состоит в том, что для анализа ИФН статуса в стерильные пробирки отбирают венозную кровь объемом от 0.5 до 5 мл. В часть пробирок предварительно вносится необходимое количество стерильного гепарина в виде концентрированного (для исключения разбавления исходного образца) раствора на среде RPMI- 1640 или на физиологическом растворе, так, чтобы конечная концентрация гепарина составила 10-15 ед/мл. Отобранная таким образом кровь может храниться 5-6 часов при 4oC без потери всех необходимых свойств.

Цельную негепаринизированную кровь центрифугируют 10-15 мин при 1000 g, после чего в стерильный эппендорф отбирают 50-200 мкл сыворотки для анализа содержания общего сывороточного ИФН. Для типирования ИФН в сыворотке крови (ИФН -, ИФН -, ИФН -) образцы инкубируются с моноклональными антителами (MAT) к различным типам ИФН в течение 1 часа при 37oC. Содержание ИФН каждого типа определяют, исходя из активности общего сывороточного ИФН и величины падения активности ИФН в каждом образце после инкубации с МАТ. Образцы хранят при -25oC.

Для определения содержания кислотолабильного ИФН - в сыворотке крови в исследуемые образцы добавляют раствор 0.1 н. HCl до pH 2.0, образцы инкубируют в течение 1 часа при 37oC, после чего pH доводят до 7.4 добавлением 0.1 н. NaOH. Параллельно с этим, другую аликвоту исследуемого образца инкубируют с МАТ к ИФН - 1 час при 37oC для осаждения сывороточного ИФН -. Содержание кислотолабильного ИФН - определяют как разность активностей образца, инкубированного с МАТ к ИФН -, и образца, инкубированного при pH 2.0. Образцы хранят до анализа при -25oC.

Для определения уровня продукции различных типов ИФН лейкоцитами крови in vitro в стерильные эппендорфы вносят среду RPMI-1640 с добавлением глутамина, антибиотиков (пенициллин, стрептомицин до 100 ед/мл), 2% сыворотки КРС, растворы индукторов ИФН (5-7 lg ЭИД50 NDV для ИФН -/) и энтеротоксин St. aureus (СЭА, 10 мг/мл) для ИФН - и цельную гепаринизированную кровь в соотношении 8/1/1 (например, 100 мкл PRMI-1640, 12.5 мкл раствора индуктора ИФН и 12.5 мкл цельной крови). Для определения уровня спонтанной продукции ИФН вместо раствора индуктора вносят эквивалентный объем питательной среды. Полученную индукционную смесь инкубируют 24 часа при 37oC, затем в эппендорфы, в которых производится индукция ИФН -/, добавляют 0.1 н. раствор HCl до pH 2.0, пробы инкубируют 1 час при 37oC, после чего в них вносят 0.1 н. раствор NaOH до pH 7.4. Таким же образом обрабатывают пробы спонтанно продуцированного ИФН, в которых определяют содержание ИФН - по падению активности ИФН в закисленной/восстановленной пробе (ее активность соответствует активности спонтанно-продуцируемого ИФН -/) по сравнению с обычной. Обработанные таким образом пробы с индуцированным и спонтанно продуцированным ИФН хранятся до анализа при -25oC. Непосредственно перед анализом пробы, подвергшиеся закислению/восстановлению (индуцированный и спонтанный ИФН -/), центрифугируют 10-20 мин при 3000-4000 g для осаждения коагулированных макромолекул.

При определении индуцированной продукции кислотолабильного ИФН-, индукцию его синтеза проводят в тех же условиях и параллельно индукции общего ИФН -/ с той разницей, что вместо закисления/восстановления после инкубации и NDV образцы инкубируют с поликлональной сывороткой к NDV 1 час при 37oC. Обработанные таким образом пробы центрифугируют при 4000-7000 g для осаждения NDV и хранят до анализа при -25oC.

Определение активности ингибиторов/активаторов действия ИФН в физиологических жидкостях производят совместным титрованием исследуемого образца на фоне постоянной концентрации референс- препарата ИФН при прочих условиях, соответствующих обычному титрованию (см. ниже). Активность ингибиторов/активаторов действия ИФН определяют по отношению активности стандартного препарата ИФН к активности стандартного препарата той же концентрации в присутствии исследуемой сыворотки крови и выражают как коэффициент стимуляции. Образцы физиологических жидкостей (сыворотка крови, цереброспинальная, синовиальная и пр. жидкости) аликвотируют и хранят до анализа при -25oC.

Активность ингибиторов/активаторов синтеза ИФН в физиологических жидкостях определяют следующим образом: в индукционную систему контрольных проб, аналогичную таковой для оценки индуцированной продукции ИФН, вносят стандартные индукторы ИФН -/ и ИФН - (NDV и СЭА соответственно) и, вместо цельной крови, клетки линии Namalva (до концентрации 106 кл/мл) в эквивалентном объеме. Опытные пробы, кроме этого, содержат раститрованные образцы исследуемых физиологических жидкостей. Индукцию синтеза ИФН проводят при тех же условиях и количественных соотношениях компонентов, как при определении индукции ИФН -/ и ИФН - лейкоцитами in vitro. По соотношению активностей ИФН в опытных и контрольных пробах определяют активность ингибиторов/активаторов синтеза ИФН в исследуемых образцах как коэффициент стимуляции/ингибирования синтеза ИФН in vitro. После индукции пробы замораживаются и хранятся до анализа при -25oC.

Определение чувствительности естественных потенциальных продуцентов ИФН (лейкоциты крови) к применяемым в медицинской практике и экспериментальным лекарственным препаратам проводится при тех же условиях, как и определение индуцированной продукции ИФН лейкоцитами in vitro. При этом, вместо стандартных индукторов ИФН (NDV и СЭА) используют препараты, чувствительность к которым определяют. Оценивают влияние интересующего препарата на процессы продукции ИФН клетками донора in vitro. Чувствительность к препарату считают положительной, если активность ИФН в пробе на чувствительность в 1.5 и более раза выше общей активности спонтанно-продуцируемого лейкоцитами ИФН. Методически данный тест повторяет тест на индуцированную продукцию ИФН -/ и ИФН - лейкоцитами in vitro с соблюдением всех соответствующих условий. Подготовленные таким образом пробы хранят до анализа при -25oC.

Анализ активности ИФН в подготовленных вышеописанными методами пробах проводят с помощью титрования исследуемых проб в 96- луночных микропланшетах над монослоем клеток перевиваемых культур (L-41, Нер-2, A-549, MG-63, L-929), инкубации 24 часа при 37oC в атмосфере 5% CO2, последующей инкубации в тех же условиях в присутствии 100 ЦПД50 вируса везикулярного стоматита (ВВС), штамм Индиана. После этого, для стандартизации и автоматизации учета результатов анализа микропланшеты окрашивают 5-10 мин 0.1% раствором кристаллического фиолетового на 30% этаноле, отмывают и высушивают на воздухе. Дальнейший учет результатов проводят либо визуально, либо автоматически с помощью ридера для иммуноферментного анализа, растворением окрашенного монослоя клеток 2% раствором додецилсульфата натрия на 5% глицерине (или экстракцией 30% этанолом 1 час при 37oC) и измерением оптической плотности полученных растворов при длине волны 570-590 нм.

Активность ИФН в анализируемом образце определяется с помощью калибровочной кривой зависимости (% сохранившихся клеток)/(активность стандартного препарата ИФН) для визуального учета или (оптическая плотность)/(активность стандартного препарата ИФН). Это дает возможность выражать результаты анализа в стандартных (международных) единицах (ME), а также значительно повысить точность получаемых результатов до 0.5 ME. Учет проводится по той титровочной точке, в которой сохранилось 30-50% клеток от исходного числа (при визуальном учете) или по точке, оптическая плотность которой лежит в интервале 0.2-0.7 ед оптич. плотности (при автоматическом учете).

Приведенный комплекс показателей представляет собой полный вариант анализа ИФН статуса. На практике бывает достаточно использовать три основных показателя: задержание общего ИФН сыворотки крови (sИФН), продукция ИФН -/ и ИФН - лейкоцитами крови при индукции in vitro.

В норме, содержание в крови sИФН соответствует диапазону 0-10 МЕ/мл, продукция ИФН -/ 250-520 ME, ИФН - 110-250 ME. Низкое содержание ИФН в сыворотке крови сочетается с высокой потенциальной способностью к продукции различных типов ИФН.

При содержании sИФН 25 МЕ/мл, продукции ИФН -/ 110, ИФН - 55 прогнозируют благоприятный исход при остром течении заболевания, поскольку система ИФН адекватно реагирует на патологию выбросом достаточного количества ИФН. Действию естественных механизмов защиты не препятствует этиотропная терапия (антибиотики, химиопрепараты), с которой целесообразно сочетать препараты ИФН (виферон и др.) для предотвращения развития ИФН- и иммунодефицитов и усиления эффективности лечения. Применение индукторов ИФН малоэффективно (система ИФН не в состоянии ответить на дополнительную стимуляцию синтеза ИФН). Назначение препаратов ИНФ позволит компенсировать возможный дефицит активности систем защиты, что приведет к повышению способности к продукции ИФН -/ и ИФН -, и, в дальнейшем, позволит эффективно применять индукторы ИФН и иммуномодуляторы микробного происхождения.

При содержании sИФН >35, продукции ИФН -/ <60, ИФН -<30 прогнозируют тяжелое острое протекание заболевания, требующего срочного терапевтического вмешательства. От применения иммуномодулирующей терапии лучше воздержаться до стабилизации состояния пациента.

При содержании sИФН 12-25 МЕ/мл, продукции ИФН -/ 85-250 ME, ИФН - 45-110 ME прогнозируют подострый характер протекания заболевания и высокую вероятность хронизации, поскольку реакция системы ИФН недостаточна для обеспечения защиты организма. Назначают иммуностимулирующие препараты (индукторы ИФН, препараты микробного происхождения, полимерные препараты: циклоферон, неовир, пирогенал, ликопид, полирем и др.). Для усиления их эффекта их комбинируют с препаратами ИФН (виферон) по схемам: 1-й день виферон (2 приема по одной свече 150000 - 1000000 ME), 2-й день индуктор ИФН (циклоферон, неовир - 1 инъекция, 2 мл 12.5% р- р) и т.д. в течение 20-30 дней; 1-2 10-дневных курса виферона (2 раза в день через 10-12 часов по 1 свече 150000 - 1000000 ME, перерыв между курсами 5-7 дней) и через 5-7 дней 1-2 курса индукторов ИФН (циклоферон, неовир, по 1 инъекции 2 мл 12.5% р-ра на 1, 2, 4, 6, 8 дни, перерыв между курсами 5-7 дней). Чем выше sИФН и ниже продукция ИФН -/ и ИФН - (острее протекание заболевания), тем более показаны препараты интерферона (виферон). Наибольшая эффективность достигается при 1-2 курсах виферона и, затем, сочетании виферона и индукторов ИФН по вышеприведенной схеме.

При содержании sИФН 0-10 ME, продукции ИФН -/ <40 ME, ИФН- <20 ME делают неблагоприятный прогноз исхода заболевания. Для компенсации ИФН- и иммунодефицита назначают иммунозаместительную терапию: препараты ИФН (виферон), гамма-глобулина, интерлейкинов (ронколейкин) и других препаратов, содержащих экзогенные защитные факторы. Использование препаратов этой группы может предварять назначение антибиотиков и химиопрепаратов или они могут применяться совместно. При повышении резервов системы (повышение способности к продукции ИФН -/ и ИФН -) продолжают этиотропное лечение в сочетании с иммуномодулирующим (при этом в лечебные схемы уже можно включать и препараты иммуностимулирующего ряда - индукторы ИФН, полимеры микробного происхождения и др.). Также возможно и комбинирование различных видов иммунокорригирующих воздействий. При дальнейшей стабилизации состояния продолжают этиотропное и патогенетическое лечение.

При содержании sИФН 12-40 МЕ/мл, продукции ИФН -/ 60-400 МЕ и значительно повышенной продукции лейкоцитами ИФН (свыше 250 ME) прогнозируют развитие нейроиммунной патологии (рассеянный склероз и др.), назначают препараты ИФН - (бетаферон) в комплексе с традиционными методами лечения.

Изобретение поясняется следующими примерами:

Пример 1.

У больного А определяли интерфероновый статус в полном объеме по вышеописанной методике. Для этого у него отбирали по 3 мл венозной крови в две стерильные пробирки: сухую и с добавлением 30 ед. гепарина в 15 мкл физиологического раствора. Из негепаринизированной крови выделяли сыворотку центрифугированием 10 мин при 1000 g. Отдельные аликвоты (по 50 мкл) сыворотки инкубировали в присутствии МАТ к ИФН -, ИФН-, ИФН- 1 час при 37oC для типирования ИФН (коэффициент дополнительного разведения - 2). К одной из аликвот нативной сыворотки добавляли 0.1 н. HCl до pH 2.0, инкубировали 1 час при 37oC, доводили pH до 7.4 0.1 н. NaOH для определения активности кислотолабильного ИФН- (коэффициент дополнительного разведения - 2). Оставшуюся нативную сыворотку аликвотировали на 3 аликвоты. Все образцы сыворотки хранили при -25oC до титрования.

Для определения индуцированной продукции различных типов ИФН лейкоцитами в 100 мкл питательной среды RPMI- 1640 (с добавлением глутамина, 2% сыворотки КРС, пенициллина и стрептомицина по 100 ед./мл) вносили по 12.5 мкл гепаринизированной цельной крови и по 12.5 мкл стандартных индукторов ИФН: NDV (5 lgЭИД50) для ИФН -/ (2 образца), СЭА (10 мг/мл) для ИФН -. Для определения спонтанной продукции различных типов ИФН (2 образца) вместо 12.5 мкл раствора индуктора вносили такой же объем питательной среды. В другую часть образцов, вместо стандартного индуктора, вносили 12.5 мкл (2 мг/мл) раствора циклоферона на питательной среде для определения чувствительности к данному препарату. Для определения активности сывороточных ингибиторов/активаторов продукции ИФН в 100 мкл суспензии клеток Namalva (106 кл/мл) в питательной среде вносили по 12.5 мкл стандартных индукторов ИФН -/ (NDV) и ИФН - (СЭА) и по 12.5 мкл нативной сыворотки крови (параллельно ставились контрольные образцы, содержащие вместо сыворотки крови эквивалентное количество питательной среды). Все образцы инкубировали 24 часа при 37oC. Затем, к одному из образцов спонтанной продукции ИФН, к одному из образов с индуцированным ИФН -/ и к образцам, содержащим NDV и клетки Namalva, добавляли 0.1 н. HCl до pH 2.0, инкубировали 1 час при 37oC, добавляли 0.1 н. NaOH до pH 7.4 (коэффициент дополнительного разведения - 2). Ко второму образцу с индуцированным ИФН -/ (кровь + NDV) добавляли поликлональную антисыворотку к NDV, инкубировали 1 час при 37oC (коэффициент дополнительного разведения - 2). Все образцы хранили при -25oC до титрования.

Непосредственно перед титрованием все образцы, ранее инкубированные с антисыворотками или при pH 2.0, центрифугировали 10 мин при 5000 g.

Титрование проводили в 96-луночных микропланшетах над монослоем клеток линии L-41. Параллельно с изучаемыми образцами титровали стандартный референс-препарат ИФН - с известной активностью для построения калибровочной зависимости. Кроме того, один из образцов нативной сыворотки крови титровали на фоне постоянной концентрации референс-препарата ИФН, для чего в лунки микропланшета, содержащие раститрованную сыворотку, дополнительно вносили раствор стандартного препарата ИФН до конечной концентрации 2 МЕ/мл. Микропланшеты с раститрованными образцами инкубировали 24 часа при 37oC в атмосфере 5% CO2. Затем, питательная среда с раститрованными пробами заменялась на раствор ВВС (100 ЦПД50) в питательной среде и микропланшеты инкубировались 24 часа при 37oC в атмосфере 5% CO2. После этого, микропланшеты окрашивали 10 мин при комнатной температуре 0.1% раствором кристаллического фиолетового на 30% этаноле, промывали проточной водой и высушивали. Связавшийся краситель растворяли 2% раствором додецилсульфата натрия на 5% глицерине в тех же микропланшетах и оптическую плотность полученных растворов измеряли на ридере для иммуноферментного анализа при 570 нм. С помощью калибровочной кривой для стандартного референс-препарата (см. чертеж) в образцах определяли активность ИФН (табл. 1) с учетом коэффициентов разведения при титровании для точки учета (учетный титр) и дополнительных коэффициентов разведения.

Были получены следующие результаты (см. табл. 1).

Содержание ИФН различных типов в сыворотке крови высчитывали как разность общей активности сывороточных ИФН (образец N1) и активности образцов сыворотки, инкубированных с соотв. МАТ (N 2- 4). Содержание кислотолабильного ИФН - определяли как суммарную активность ИФН - и ИФН - в сыворотке крови (N4) за вычетом активности ИФН в пробе сыворотки, инкубированной при pH 2.0 (N 5). Активность индуцированной продукции лейкоцитами кислотолабильного ИФН - определяли по разности активностей ИФН в пробах N7 и 6. Уровень спонтанной продукции ИФН -/ считали как активность пробы N10, ИФН - - разность активностей проб N9 и 10. За активность ингибиторов/активаторов действия ИФН принимали отношение активностей проб N11 и 12. За активность ингибиторов/активаторов продукции ИФН -/ принимали отношение активностей проб N13 и 14, а ИФН - - N15 и 16. Чувствительность к циклоферону - отношение активностей проб N17 и 9.

Окончательные результаты полного исследования ИФН статуса:

1) ИФН сыворотки крови. Общий - 22 МЕ/мл, ИФН - - 16 МЕ/мл, ИФН - - 4 МЕ/мл, ИФН - - 2 МЕ/мл, кислотолабильный ИФН - - 2 МЕ/мл.

2) Продукция ИФН лейкоцитами крови in vitro. ИФН -/ - 231 ME; кислотолабильный ИФН - - 7 ME; ИФН - - 88 МЕ; спонтанная продукция ИФН -/ - 12 ME, ИФН - - 2 ME.

3) Активность ингибиторов/активаторов действия ИФН (коэффицент стимуляции) - 1.

4) Активность ингибиторов/активаторов синтеза ИФН -/ (коэффициент стимуляции) - 1, ИФН- - 1.

5) Чувствительность к препарату циклоферон - 2 (положительная).

Больному А на основании клинических и микроскопических обследований был поставлен диагноз: обострение хронической урогенитальной хламидийной инфекции.

На основании результатов исследования интерферонового статуса было сделано следующее заключение: из-за слабой реакции систем защиты организма (незначительно повышенное содержание ИФН - в сыворотке крови и недостаток сывороточного ИФН -, невысокие значения спонтанной продукции ИФН лейкоцитами) прогнозируется дальнейшее развитие заболевания, частые обострения; так как резервы системы ИФН истощены не полностью (продукция ИФН in vitro не достигает критических значений), и организм в состоянии вырабатывать нормальные ИФН (низкие значение содержания и продукции кислотолабильного ИФН -); не выявлена активность факторов, препятствующих действию и синтезу ИФН в организме (активность ингибиторов/активаторов). Было рекомендовано лечение иммуностимулирующими препаратами (индуктор ИФН циклоферон) в сочетании в этиотропной терапией (антибиотики).

После проведенного курса лечения было сделано повторное исследование ИФН статуса (сокращенный вариант: определение активности общего сывороточного ИФН, продукция ИФН -/ и ИФН - лейкоцитами in vitro) вышеописанным методом:

1) sИФН - 9 МЕ/мл.

2) Продукция ИФН -/ - 306 ME.

3) Продукция ИФН - - 164 ME.

Нормализация показателей ИФН статуса, отсутствие маркеров инфекции в мазках и сыворотке крови, улучшение клинических показателей свидетельствовало о правильности сделанного прогноза и рекомендаций по выбору терапии.

Пример 2.

Пациент Б поступил с диагнозом хронический вирусный гепатит В. При анализе интерферонового статуса (сокращенный вариант, описанный в примере 1) были получены следующие результаты:

1) sИФН - 8 МЕ/мл.

2) Продукция ИФН -/ - 34 ME.

3) Продукция ИФН - - 12 ME.

Заключение: тяжелая ИФН- и иммунодепрессия, неблагоприятный прогноз течения и исхода заболевания. Кроме симптоматической была рекомендована ИФН-терапия (препарат виферон или аналоги) совместно с методами экстракорпоральной гемокоррекции (плазмаферез). Результаты анализа ИФН статуса после проведенного курса лечения:

1) sИФН - 22 МЕ/мл.

2) Продукция ИФН -/ - 94 ME.

3) Продукция ИФН - - 52 ME.

Тенденция к нормализации показателей ИФН статуса коррелировала с клиническим улучшением, что подтвердило правильность сделанного прогноза и выбранной схемы лечения.

Пример 3.

Пациент В поступил с диагнозом обострение рассеянного склероза (в анамнезе более 5 лет). Результаты сокращенного анализа ИФН статуса (как это описано в примере 1):

1) sИФН - 36 МЕ/мл.

2) Продукция ИФН -/ - 76 ME.

3) Продукция ИФН - - 315 ME.

Заключение: высокие значения sИФН и продукции ИФН - показывают ИФН -- зависимое обострение нейроиммунной патологии; неблагоприятный прогноз исхода заболевания; рекомендовано лечение препаратами ИФН - (бетаферон) в сочетании с традиционной терапией.

Результаты сокращенного анализа ИФН статуса после проведенного лечения:

1) sИФН - 10 МЕ/мл.

2) Продукция ИФН -/ - 274 ME.

3) Продукция ИФН - - 204 ME.

Выраженная стабилизация показателей ИФН статуса (что соответствовало нормализации клинических показателей и переходу пациента в состояние устойчивой ремиссии) подтвердила правильность прогноза и выбора методов лечения.

Пример 4.

Пациент Г. При первичном клиническом обследовании наличия заболеваний не было выявлено. Был сделан сокращенный анализ ИФН статуса (как описано в примере 1):

1) sИФН - 14 МЕ/мл.

2) Продукция ИФН -/ - 116 ME.

3) Продукция ИФН - - 68 ME.

На основании результатов ИФН статуса было сделано заключение о предрасположенности пациента к частым инфекционным заболеваниям и возможности наличия вялотекущей хронической инфекции. Данная информация подтвердилась анамнестическими данными о многочисленных респираторных и бронхолегочных инфекциях в прошлом, а на основании лабораторного обследования у пациента был выявлен хронический хламидиоз.

Список литературы

1. Ершов Ф.И., Готовцева Е.П. Иммунология, 1986 г., N 3, с. 52-54.

2. Соловьев В.Д. и другие. Интерферон в теории и практике медицины, 2-е издание, М., 1981 г.

3. Bocci V., Biol. Rew., 1981, vol. 56, p. 49-51.

4. Bocci V., Advances of Immodulation, New York, 1984, p. 131-154.

5. Bocci V., Immunol. Today, 1985, vol. 6, p 7-9.

6. Lewin S., Clin. Exp.lmmunol, 1981, vol. 46, p. 475-483, МКИ 5 A 61 K 37/66, AC N 1082422, 1984 г.

7. Григорян С.С. Оценка интерферонового статуса людей по пробам цельной крови. Вопросы вирусологии, 1988 г., том 3, N 4, стр. 433-436. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



1. Способ оценки характера течения заболевания, прогнозирования его исхода и выбора типа иммуномодулирующей терапии, основанный на определении интерферонового статуса больного, включающий определение активности общих сывороточных интерферонов (S-ИФН), и определение продукции лейкоцитами in vitro интерферона / (ИФН/) и интерферона (ИФН) в образцах цельной крови, инкубированных в среде RPMI - 1640 в присутствии стандартных индукторов синтеза ИФН, посредством титрования исследуемых образцов на культуре клеток с последующей инкубацией с вирусом везикулярного стоматита (ВВС), отличающийся тем, что используют перевиваемые культуры клеток, чувствительные к действию ИФН, а именно, L-41, Hep-2, A-549, MG-63, L-929, после инкубации клеток с ВВС их окрашивают раствором кристаллического фиолетового, связавшийся краситель растворяют и его количество, пропорциональное активности ИФН исследуемого образца, измеряют фотометрически при длине волны 570 - 590 нм, активность ИФН в образце определяют по калибровочной кривой зависимости для стандартного препарата ИФН и выражают результат в международных единицах (МЕ), при этом при активности S-ИФН 0 - 10 МЕ/мл, ИФН/ 250 - 520 МЕ, а ИФН 110 - 250 МЕ считают обследуемого здоровым, при активности S-ИФН 25 - 32 МЕ/мл, ИФН/ - 60 - 110 МЕ, ИФН - 30 - 55 МЕ прогнозируют благоприятный исход заболевания и назначают этиотропную терапию, антибиотики, химиопрепараты, препараты ИФН, а именно виферон, интерлейкинов, а именно ронколейкин, гаммаглобулин, при активности S-ИНФ более 35 МЕ/мл, ИФН/ - менее 60 МЕ, ИФН - менее 30 МЕ прогнозируют тяжелое протекание заболевания, требующее срочного терапевтического вмешательства, при активности S-ИНФ 12 - 25 МЕ/мл, ИФН/ - 85 - 250 МЕ, ИФН - 45 - 110 МЕ прогнозируют хронизацию патологического процесса и назначают препараты ИФН, а именно виферон, индукторы ИФН, а именно циклоферон, неовир, и полимерные иммуномодуляторы, а именно полирем, пирогенал, ликопид, при активности S-ИФН 0 - 10 МЕ/мл, ИФН/ - менее 40 МЕ, ИФН - менее 20 МЕ прогнозируют неблагоприятный исход заболевания и назначают препараты ИФН, а именно виферон, гаммаглобулина, интерлейкинов, а именно ронколейкин и другие иммунозаместительные препараты, при активности S-ИФН 12 - 40 МЕ/мл, ИФН/ - 60 - 400 МЕ, ИФН - более 250 МЕ прогнозируют развитие нейроиммунной патологии, а именно рассеянного склероза, и назначают препараты ИФН-, а именно бетаферон.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при определении уровня продукции различных типов ИФН лейкоцитами крови in vitro используют среду RPMI-1640 с добавлением глутамина и антибиотиков, в частности, пенициллина и стрептомицина до 100 ед/мл, и 2% сыворотки КРС, дополнительно вносят растворы индукторов ИФН, в частности для ИФН/ вносят вирус болезни Ньюкасла 5 - 7 lg ЭИД50, для ИФН-энтеротоксин St. aureus 10 мг/мл, и цельную гепаринизированную кровь, при этом среду RPMI-1640, индуктор ИФН и кровь берут при объемном соотношении 8 : 1 : 1, соответственно, инкубируют полученную смесь 24 ч при 37oC, в образцы с ИФН/ добавляют раствор 0,1 н HCl до pH 2,0, инкубируют 1 ч при 37oC и 0,1 н раствором NaOH доводят pH до 7,4, при этом все полученные образцы хранят до начала проведения дальнейшего анализа при -25oC.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что при прогнозировании хронизации патологического процесса для усиления эффекта назначаемые препараты комбинируют по схемам: 1 день назначают виферон в 2 приема по одной свече 150000 - 1000000 МЕ через 10 - 12 ч, на 2 день - индуктор ИФН, а именно циклоферон, неовир по 1 инъекции 2 мл 12,5% раствора в течение 20 - 30 дней, либо назначают 1 - 2 10-дневных курса по 2 раза в день по одной свече 150000 - 1000000 МЕ через 10 - 12 ч с перерывом между курсами 5 - 7 дней, и через 5 - 7 дней назначают 1 - 2 курса индуктора ИФН, а именно циклоферон, неовир, по 1 инъекции 2 мл 12,5% раствора в 1,2,4,6,8 дни с перерывом между курсами 5 - 7 дней.