СПОСОБ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ ПЕЧЕНИ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ОПИСТОРХОЗА

СПОСОБ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ ПЕЧЕНИ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ОПИСТОРХОЗА


RU (11) 2283493 (13) C2

(51) МПК
G01N 33/48 (2006.01)
G01N 1/28 (2006.01) 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 10.08.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

На основании пункта 3 статьи 13 Патентного закона Российской Федерации от 23 сентября 1992 г. № 3517-I патентообладатель обязуется передать исключительное право на изобретение (уступить патент) на условиях, соответствующих установившейся практике, лицу, первому изъявившему такое желание и уведомившему об этом патентообладателя и федеральный орган исполнительной власти по интеллектуальной собственности, - гражданину РФ или российскому юридическому лицу. 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(14) Дата публикации: 2006.09.10 
(21) Регистрационный номер заявки: 2003131578/15 
(22) Дата подачи заявки: 2003.10.27 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2003.10.27 
(43) Дата публикации заявки: 2005.04.20 
(45) Опубликовано: 2006.09.10 
(56) Аналоги изобретения: МИГУСЬКИНА Е.И. и ДР. Патоморфология и клинические особенности хронического вирусного гепатита в сочетании с описторхозом: Автореферат на соиск. учен. степ. канд. мед. наук, Новосибирск, 2000, с.28. RU 2136216 C1, 10.09.1999. SU 1837195 A1, 30.08.1993. SU 1187791 A, 30.10.1985. СЕРОВ В.В, и др. Морфологические критерии оценки этнологии, степени активности и стадии хронизации при вирусных гепатитах В и С. Арх. Патологии, 1996, №4, с.61-64. 
(72) Имя изобретателя: Поддубная Ольга Александровна (RU); Белобородова Эльвира Ивановна (RU); Пурлик Игорь Леонидович (RU) 
(73) Имя патентообладателя: Поддубная Ольга Александровна (RU); Белобородова Эльвира Ивановна (RU); Пурлик Игорь Леонидович (RU) 
(98) Адрес для переписки: 634050, г.Томск, Московский тракт, 2, СибГМУ, отдел ИС, пат. пов. Н.Г. Зубаревой, рег. №409 

(54) СПОСОБ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ ПЕЧЕНИ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ОПИСТОРХОЗА
Изобретение относится к медицине, паразитологии, и касается способов оценки состояния печени при лечении описторхоза в эксперименте. Способ оценки состояния печени при лечении описторхоза заключается в микроскопическом исследовании гистологических препаратов печени и определении показателей некрозовоспалительных изменений, при этом препараты печени исследуют до и после проведения дегельминтизации, дополнительно определяют плотность воспалительного инфильтрата портальных трактов в 1 мм2 и удельный вес каждой клеточной формы и при снижении числа ступенчатых, мостовидных, интралобулярных некрозов, кратном уменьшении удельного веса нейтрофильных и эозинофильных лейкоцитов, увеличении числа моноцитов и уменьшении выраженности склероза относительно нормы и снижении плотности воспалительного инфильтрата в 2-3 раза на единицу площади судят о положительном влиянии дегельминтизации на состояние печени. 3 табл., 6 ил. 




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Изобретение относится к медицине, паразитологии и касается способов оценки состояния печени при лечении описторхоза в эксперименте.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ оценки, заключающийся в проведении исследования гистологического препарата, полученного методом чрескожной пункционной биопсии и определением показателей некрозовоспалительной активности, при этом степень некрозовоспалительной активности оценивается в баллах и предусматривает раздельный учет перипортальных и мостовидных некрозов, фокальных и лобулярных, воспалительную инфильтрацию портальных трактов лимфомакрофагальными элементами [1]. Однако несмотря на учет всех составляющих воспалительного инфильтрата патологического процесса известный способ никак не учитывает качественный (удельный вес каждой клеточной формы) и количественный (число клеток на единицу площади) состав инфильтрата портальных трактов, что снижает информативность и точность способа.

В клинической практике с целью дегельминтизации сегодня широко используются как антигельминтные препараты растительного происхождения (экорсол) [2], так и безмедикаментозные средства (применение вторичных препаратов-аппликаторов, способных формировать частотно-волновой аналог исходного препарата с включением частот КВЧ-диапазона) [3]. И в экспериментах с моделями токсического гепатита доказано положительное влияние электромагнитного излучения КВЧ-диапазона на морфофункциональное состояние печени [4].

Однако в изученной авторами литературе отсутствуют сведения о детальной качественной и количественной характеристике воспалительного инфильтрата и о состоянии печени при проведении антигельминтной терапии при описторхозе.

Задачей изобретения является повышение информативности и точности способа оценки состояния печени при лечении описторхоза.

Поставленную задачу решают применением нового способа оценки состояния печени при лечении описторхоза, заключающегося в микроскопическом исследовании гистологических препаратов печени и определении показателей некрозовоспалительных изменений, причем препараты исследуют до и после проведения дегельминтизации, дополнительно определяют плотность воспалительного инфильтрата портальных трактов в 1 мм2 и удельный вес каждой клеточной формы и при достоверном снижении числа ступенчатых, мостовидных, интралобулярных некрозов, кратном уменьшении удельного веса нейтрофильных и эозинофильных лейкоцитов, достоверно резком увеличении числа моноцитов, достоверном уменьшении выраженности склероза относительно нормы и снижении плотности воспалительного инфильтрата в 2-3 раза на единицу площади судят о положительном влиянии дегельминтизации на состояние печени у больных описторхозом.

Новым в предлагаемом способе является то, что препараты печени исследуют до и после проведения дегельминтизации, дополнительно определяют плотность воспалительного инфильтрата портальных трактов в 1 мм2 и удельный вес каждой клеточной формы, проводят дегельминтизацию и при достоверном снижении числа ступенчатых, мостовидных, интралобулярных некрозов, кратном уменьшении удельного веса нейтрофильных и эозинофильных лейкоцитов, достоверно резком увеличении числа моноцитов, достоверном уменьшении выраженности склероза относительно нормы и снижении плотности воспалительного инфильтрата в 2-3 раза на единицу площади судят о положительном влиянии дегельминтизации на состояние печени у больных описторхозом.

Способ осуществляют следующим образом.

Проводят комплексный сравнительный анализ препаратов печени хомячков, зараженных описторхозом, до и после лечения антигельминтными средствами. Фрагменты печени после забора материала тотчас фиксируют в 12% нейтральном формалине. Препараты готовят по стандартной методике [5], заливают в парафин. Срезы толщиной 5-6 мкм окрашивают эозин-гематоксилином, пикофуксином по Ван Гизону.

При микроскопическом исследовании оценивают некрозовоспалительные изменения и характер фиброза. К некрозовоспалительным относят некрозы и воспалительный инфильтрат. Учитывают следующие варианты некроза - ступенчатый, мостовидный, интралобулярный. Производят качественный (эозинофилы, нейтрофилы, лимфоциты, моноциты, фибробласты) и количественный подсчет клеточного инфильтрата портальных трактов, а также плотность инфильтрата в 1 мм2. Выделяют и учитывают следующие варианты фиброза - портальный, септальный (порто-портальный, порто-центральный). С использованием функции «лассо» в PhotoShop подсчитывают площадь портальных трактов, число клеток инфильтрата на единицу площади с последующим подсчетом удельного веса каждой клеточной формы. Для унификации исследования в пределах каждого микропрепарата оценку проводят в десяти полях каждого третьего поля зрения. Все группы фрагментов печени, включая контрольную, проходят «слепое»исследование. Морфологическую оценку осуществляют на установке, включающей световой микроскоп «Zeiss Jena», цифровую фотокамеру Epson-200 с использованием программы PhotoShop 6.0. Изображение поля зрения вводят в компьютер с помощью видеокамеры. Конечное линейное и оптическое увеличение после переноса изображения с помощью видеокамеры в компьютер составляет - ×800, 1600. И при достоверном снижении числа ступенчатых, мостовидных, интралобулярных некрозов, кратном уменьшении удельного веса нейтрофильных и эозинофильных лейкоцитов, достоверно резком увеличении числа моноцитов, достоверном уменьшении выраженности склероза относительно нормы и снижении плотности воспалительного инфильтрата в 2-3 раза на единицу площади судят о положительном влиянии дегельминтизации на состояние печени у больных описторхозом.

Предлагаемые критерии для оценки состояния печени были получены на основании интерпретации данных экспериментальных исследований, для которых был проведен комплексный сравнительный морфологический анализ ткани печени золотистых хомячков (Crecetus padus), зараженных описторхозом. Заражение проводилось путем кормления хомячков в течение 7 дней рыбой - ельцами (Leuciscus idus), выловленной в реке Томь и исследованной микроскопически на наличие метациркариев.

Все зараженные хомячки в зависимости от получаемого лечения, были разделены на 4 группы. В эксперименте использовано по 20 фрагментов печени из каждой группы. Контрольная - 1 группа - была представлена фрагментами печени зараженных хомячков, не получавших лечение, 2 группа - ткань печени после лечения экорсолом (1,0 мл 1% водного раствора, вводимого через металлический зонд 3 раза в день в течение 7 дней), 3 группа - ткань печени после лечения безлекарственным средством, содержащим субстанцию, воспроизводящую спектр КВЧ-излучения гельминта - описторхиса («О») и группа 4 - ткань печени после лечения средством, содержащим субстанцию, воспроизводящую спектр КВЧ-излучения антигельминтного препарата растительного происхождения - экорсола («Э»). Безмедикаментозные средства для дегельминтизации готовят по определенной методике [3] и используют для лечения зараженных хомячков. Для оценки эффективности антигельминтой терапии через сутки после лечения было произведено вскрытие хомячков и подсчитано фактическое количество выделенных описторхисов, на основании полученных данных по формуле определяли интесэффективность (ИЭ) [3], которая была достаточно высокой и достигала 78,3%.

Для сравнительной оценки состояния печени зараженных хомячков было проведено морфологическое исследование 20 фрагментов печени здоровых животных (незараженных), при этом элементы некрозовоспалительного процесса (некрозы и воспалительный инфильтрат), а также фиброзные изменения в исследованных фрагментах не выявлялись.

Результаты:

При сравнении результатов оценки некротических изменений в ткани печени было выявлено следующее. Терапия с использованием экорсола сопровождалась положительной динамикой. Так, если в контрольной группе число ступенчатых, мостовидных, интралобулярных некрозов в 10 полях зрения было соответственно - 16, 6, 10, то во 2 группе пролеченных - 4, 2, 6, в 3 группе - 9, 3, 5, в 4 группе - 9, 3, 6 (р<0,05) (см. табл. 1).

При сравнении показателей клеточного воспалительного инфильтрата портальных трактов среди сравниваемых групп также были обнаружены следующие отличия. В контрольных препаратах число клеток на 1 мм2 портального тракта составляло 14500±1800, тогда как во 2 группе пролеченных - 6140±810, в 3 группе - 8200±980, в 4 группе - 8500±1050, что статистически различно (см. табл. 2). На фигурах наглядно представлена выраженность воспалительной инфильтрации портального тракта во всех опытных группах: 2 группа - А1 (фиг.1) - до лечения, А2 (фиг.2) - после лечения, 3 группа - В1 (фиг.3) - до лечения, В2 (фиг.4) - после лечения, 4 группа - С1 (фиг.5) - до лечения, С2 (фиг.6) - после лечения. При сравнительной оценке процентного содержания каждой клеточной формы воспалительного инфильтрата было обнаружено следующее. Если в контрольной группе удельный вес эозинофильных лейкоцитов составлял 48%±6, то в второй группе - 12%±2, в 3 группе - 13%±2, в 4 группе - 23%±3 (р<0,05). Так, если в контроле содержание лимфоцитов было 20%±3, то во второй группе - 34%±4, в 3 группе - 42%±6, в 4 группе - 40%±5. Различия с контрольной группой достоверны. По сравнению с контрольной группой произошло кратное уменьшение удельного веса нейтрофилов после лечения: в 3 раза - во 2 группе и в 2 раза - в 3 и 4 группах, при достоверно резком увеличении числа моноцитов (см. табл. 2).

При сравнительной оценке характера фиброза было выявлено, что после лечения выраженность склероза достоверно уменьшилась в сравнении с контрольной группой. Так, если в контроле число порто-портальных и порто-центральных септ в 10 полях зрения было как 6 к 8, то во 2 группе пролеченных - как 2 к 0, в 3 группе - как 3 к1, в 4 группе - как 2 к 3. Достоверность различий подтверждена статистически (р<0,05) (см. табл.3).

В ходе проведенного исследования нами установлено, что терапия описторхоза с использованием как экорсола, так и информационных аналогов (безмедикаментозных средств) сопровождается достоверной положительной динамикой морфологической картины, что проявляется уменьшением плотности воспалительного инфильтрата в 2 раза, явным снижением некротических изменений и чрезвычайно слабой выраженностью фиброза (по сравнению с контрольной группой - непролеченных животных). Ни один из изучаемых показателей морфологической картины печени после проведенного лечения не ухудшился.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет наиболее точно оценить состояние печени после воздействия антигельминтными средствами. Предлагаемые авторами критерии - достоверное снижение числа клеток воспалительного инфильтрата портального тракта на единицу площади (1 мм2 ), уменьшение числа нейтрофильных и эозинофильных лейкоцитов, повышение числа моноцитов - являются морфологическими маркерами не только успешной дегельминтизации, но и улучшения состояния печени, что может использоваться в качестве абсолютного критерия успешной терапии. Впервые предложено судить о влиянии дегельминтизации при описторхозе на состояние печени путем не только оценки вариантов некроза, но и качественной и количественной характеристики воспалительного инфильтрата портальных трактов. Результаты такого исследования позволят судить не только о положительном влиянии на состояние печени (гепатопротекторное влияние), но дают возможность судить об отсутствии гепатотоксического влияния используемых средств (ни один из изучаемых показателей морфологической картины печени после проведенного лечения не ухудшился).

Таблица 1

Встречаемость различных вариантов некроза в печени в исследуемых группах (n в 10 полях зрения под увеличением 80) 
группа Ступенчатый некроз Мостовидный некроз Интралобулярный некроз 
1 группа 16 6 10 
2 группа 4* 2* 6* 
3 группа 9* З* 5* 
4 группа 9* З* 6* 
Примечание: * при р<0,05; при отсутствии р результат не достоверен. 
Таблица 2

Состав воспалительного инфильтрата портальных трактов печени в исследуемых группах (ср.в % ± М) 
группа Клеточные элементы Плотность на 1 мм2 
эозинофилы нейтрофилы фибробласты лимфоциты моноциты 
1 группа 48±6 12±1,8 3±0,4 20±3 17±2,5 14500±1800 
2 группа 12±2* 4±0,5* 2±0,2 34±4* 48±7* 6140±810* 
3 группа 13±2* 6±0,8* 6±0,7 42±6* 33±4,2* 8200±980* 
4 группа 23±3* 6±0,9* 3±0,5 40±5*0 28±3,8* 8500±1050* 
Примечание: * при р<0,05; при отсутствии р - результат не достоверен. 
Таблица 3

Частота встречаемости различных вариантов фиброза в исследуемых группах (n в 10 полях зрения под увеличением 80). 
группа Варианты фиброза 
портальный Портопортальный Портоцентральный 
1 группа 20 6 8 
2 группа 6* 2* 0* 
3 группа 8* 3* 1* 
4 группа 8* 2* 3* 
Примечание: * при р<0,05; при отсутствии р - результат не достоверен 


Источники информации

1. Серов В.В., Севергина Л.О. Морфологические критерии оценки этиологии, степени активности и стадии хронизации при вирусных гепатитах В и С // Арх. Патологии. - 1996. - №4. - С.61-64 (прототип).

2. Мозжелин М.Е., Кадуков Д.В. Экорсол. Томск: OOO «Гарт», 2001. - 20 с.

3. Использование терапии фоновым резонансным излучением для купирования болевого синдрома при нейровертеброгенных заболеваниях. Методич. рекомендации №99/91, Москва, 1999.

4. Рудин М.В, Рыжов А.И., Белоусов Е.В., Кожемякин А.М. Способ профилактики повреждений печени, вызываемых эфирным наркозом в эксперименте. Патент №2153904, Москва, 2000.

5. Пирс Э. Гистохимия. - М., 1962. - 962 с.




ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


Способ оценки состояния печени при лечении описторхоза, заключающийся в микроскопическом исследовании гистологических препаратов печени в эксперименте, отличающийся тем, что дополнительно определяют плотность воспалительного инфильтрата портальных трактов в 1 мм и удельный вес эозинофильных и нейтрофильных лейкоцитов и моноцитов клеточной формы и при снижении в 10 полях зрения частоты встречаемости фиброзов с 20 до 6 - портального, с 6 до 2 порто-портального, с 8 до 0 порто-центрального, снижении частоты встречаемости некроза ступенчатого с 16 до 4, мостовидного с 6 до 2, интралобулярного с 10 до 5, увеличении числа моноцитов с 17±2,5 до 48±7%, лимфоцитов с 20±3 до 42±6%, снижении числа нейтрофилов с 12±1,8 до 4±0,5% и эозинофилов с 48±6 до 12±2%, снижении плотности воспалительного инфильтрата в 2-3 раза на единицу площади по сравнению с показателями группы зараженных животных, не получавших лечения, судят о положительном влиянии проведенной дегельминтизации.