СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЛЯМБЛИОЗА И ЕГО ТЕЧЕНИЯ

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЛЯМБЛИОЗА И ЕГО ТЕЧЕНИЯ


RU (11) 2246115 (13) C1

(51) 7 G01N33/53 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 10.08.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(14) Дата публикации: 2005.02.10 
(21) Регистрационный номер заявки: 2003120003/15 
(22) Дата подачи заявки: 2003.07.01 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2003.07.01 
(45) Опубликовано: 2005.02.10 
(56) Аналоги изобретения: Тест-система ЛЯМБЛИЯ - АТ - СТРИП. Инструкция по применению.D-3502 (ЗАО"ВЕКТОР-БЕСТ"), 16.05.2000. ДЕДКОВА Л.М. и др. Выявление антител к антигенам трофозоитов лямблий иммуноферментным методом./Мед.паразитол. и паразитар. болезни, 1999, № 1, с.46-48. RU 2176794 C2, 10.12.2001. RU 2007958 C1, 28.02.1994. Прикладная иммунология/ Под ред. А.А.СОХИНА, Е.Ф.ЧЕРНУШЕНКО. – К.: Здоров’я, 1984, стр.320. RU 2136001 C1, 27.08.1999. SCHUNK M. et al. Detection of Giardia lamblia and Entamoeba histolytica in samples by two enzyme immunoassays. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2001 Jun; 20(6):389-91. 
(72) Имя изобретателя: Слюсарь Н.Н. (RU); Горшкова М.А. (RU); Егорова Е.Н. (RU) 
(73) Имя патентообладателя: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Тверская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения Российской Федерации" (ГОУ ВПО Тверская ГМА Минздрава России) (RU) 
(98) Адрес для переписки: 170642, г.Тверь, ул. Советская, 4, ГОУ ВПО Тверская ГМА Минздрава России, патентный отдел 

(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЛЯМБЛИОЗА И ЕГО ТЕЧЕНИЯ
Изобретение относится к области медицины, а именно к паразитологии, и предназначено для диагностики лямблиоза и его течения. Проводят иммуноферментный анализ. Определяют диагностическую оптическую плотность и оптическую плотность меченого иммунного комплекса в лунке планшета с исследуемой сывороткой, измеряемых в условных единицах при длине волны 492 нанометра. Рассчитывают коэффициент концентрации антител, измеряемый в условных единицах, по формуле: ККА = (ОПиссл - ОПд) х 100, где ККА - коэффициент концентрации антител, ОПиссл - оптическая плотность лунки с исследуемой сывороткой, ОПд - диагностическое значение оптической плотности, 100 – коэффициент разведения сыворотки. По значению ККА определяют титр антител к антигенам Lamblia intestinalis и интерпретируют результаты исследования. Способ позволяет повысить точность диагностики лямблиоза и проследить динамику течения заболевания. 1 табл.




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Изобретение относится к медицине, а именно к инфекционным болезням, в частности к паразитологии.

Лямблиоз является повсеместно распространенной инвазией. В Российской Федерации ежегодно регистрируется около 110000 случаев лямблиоза, из которых 80% составляют дети до 14 лет. В этиологической структуре диарей на долю лямблиоза приходится от 3% до 8% случаев. Доказана роль Lamblia intestinalis в аллергизации организма, развитии дуоденоеюнитов, кроме этого лямблиоз является инвазией, сопутствующей широкому спектру заболеваний желудочно-кишечного тракта: хроническому гастродуодениту в 76,5%, панкреатиту - 15,7%, энтероколиту - 4,0%, рефлюкс-эзофагиту - 3,8% случаев.

В качестве аналога авторы предлагают микроскопический способ диагностики лямблиоза (Клиническая лабораторная аналитика. Том II. Частные аналитические технологии в клинической лаборатории / Под ред. В.В.Меньшикова. - М.: Лабинформ-РАМЛД, 1999. - 352 с.). Из исследуемого материала (фекалии) готовят два нативных препарата под покровными стеклами. Один из препаратов окрашивают раствором Люголя. Микроскопию препаратов проводят с сухой системой большого увеличения. В неокрашенном препарате выявляют подвижные вегетативные стадии лямблий, в окрашенном препарате - цисты простейших.

К недостаткам микроскопического способа диагностики лямблиоза можно отнести недооценку периодичности выделения лямблий с фекалиями, зависимость наличия различных форм возбудителя от консистенции стула. В связи с этим эффективность микроскопического способа является недостаточно высокой, а сроки диагностики - продолжительными, так как для подтверждения отрицательных результатов необходимо микроскопическое исследование фекалий с интервалом в 1 неделю в течение 4-5 недель.

Прототипом заявляемого способа, по мнению авторов, является способ определения антител к антигенам лямблий методом ИФА с использованием тест-системы “Лямблия-АТ-стрип” (ЗАО “Вектор-Бест”, Новосибирская обл., п.Кольцово). Способ заключается в обнаружении в сыворотке крови антител к антигенам Lamblia intestinalis. В ходе исследования при взаимодействии исследуемых образцов сывороток крови (разведение 1:100) в лунках планшеты с иммобилизованными антигенами лямблий происходит связывание специфических антител и образование комплекса “антиген-антитело” на поверхности лунок. После удаления не связавшихся компонентов сыворотки и добавления в лунки планшета конъюгата антител против иммуноглобулинов человека с пероксидазой хрена происходит включение ферментной метки в иммунный комплекс. В результате ферментативной реакции, проведенной в лунках, отмытых от избытка конъюгата, с субстратным раствором для пероксидазы, содержащим перекись водорода и ортофенилендиамин, образуется окрашенный продукт, оптическая плотность которого пропорциональна концентрации антител в анализируемом образце сыворотки к антигенам лямблий. Оптическую плотность (ОП) меченого иммунного комплекса в лунках планшеты регистрируют с помощью анализатора колориметрического иммуноферментного при длине волны 492 нм. В планшете кроме рабочих лунок, в которые вносят исследуемые сыворотки, ставят контроли: в 2 лунки вносят положительный контрольный образец, в 2 лунки - отрицательный контрольный образец, в 2 лунки (контроль конъюгата) - раствор для разведения сывороток. Последующее проведение реакции в контрольных лунках не отличается от такового в рабочих лунках. Оценку результатов проводят только в том случае, если средние показатели ОП контроля конъюгата не превышает значения 0,2; ОП в лунках с контрольным отрицательным образцом (ОП К-) не более значения 0,3; а ОП в лунках с контрольным положительным образцом имеет значение не ниже 0,8. Диагностическая ОП (ОПд) вычисляется по формуле: ОПд=1,48×ОП К-+0,04. Результат ИФА расценивается как положительный, если ОП меченого иммунного комплекса в лунке, в которой использовалась исследуемая сыворотка (ОПиссл.) в разведении 1:100, равна или больше диагностической ОП (ОПд). Поскольку ошибка метода ИФА составляет 10-15% при значении ОПиссл. меньше на 15%, чем ОПд , результат считают сомнительным и проводят повторное исследование. 

К недостаткам прототипного способа диагностики лямблиоза относится определение только факта наличия антител к антигенам лямблий (в одном разведении 1:100) - то есть лишь качественный способ учета результатов ИФА, но не исследуется количество специфических антител (их титр). Очевидный в данной ситуации подход - исследование исследуемой сыворотки не в одном, а в нескольких разведениях, например от 1:100 до 1:3200 с двукратными разведениями, увеличивает стоимость анализа кратно количеству разведений. В связи с отсутствием количественных данных при прототипном способе отсутствует возможность оценки выраженности иммунного ответа на возбудитель, динамики течения заболевания. Кроме этого невозможно оценить эффективность выбранного химиопрепарата и терапии заболевания в целом.

Авторы предлагают следующий способ диагностики и течения лямблиоза. Постановка ИФА на наличие антител в сыворотке крови к антигенам лямблий с применением тест-системы “Лямблия-АТ-стрип” проводится аналогично прототипу. ОП измеряется при той же длине волны. Расчет ОПд проводится по вышеуказанной формуле. Однако для учета результата исследования вычисляется разница между ОП иссл. и ОПд, которая умножается на 100, с целью получения значения показателя концентрации антител к антигенам лямблий, который авторы предлагают назвать коэффициентом концентрации антител (ККА). Значение ККА является пропорциональным концентрации специфических антител в сыворотке крови. ККА рассчитывается по формуле ККА=(ОПиссл.-ОПд)×100, где 100 - коэффициент разведения сыворотки.

Наряду с определением коэффициента концентрации антител (качественная реакция в одном разведении - 1:100) при исследовании сывороток крови на наличие антител к антигенам лямблий с применением тест-системы “Лямблия-АТ-стрип” авторы проводили и определение титра данных антител (количественное исследование). Указанные параллельные исследования проведены на 150 образцах сывороток крови больных с жалобами со стороны желудочно-кишечного тракта, аллергическими заболеваниями и косвенными признаками лямблиоза. Контрольную группу составили образцы крови 30 практически здоровых людей. Образцы крови у обследуемых лиц в количестве не менее 0,5 мл забирали из пальца натощак. Сыворотку крови тщательно отделяли от сгустка и примеси эритроцитов. Сыворотки хранили при температуре 6±2°С не более 48 часов до исследования. Обработка результатов исследования проводилась с использованием компьютерной программы статистического анализа Biostat 3.03 (S.A.Glantz, 1997), применялся критерий линейная регрессия и корреляция.

В 94 образцах опытных сывороток крови значение ККА - от 101 до 205 условных единиц и титры антител 1:800-1:3200, результат исследования расценен как положительный; в 24 образцах опытных сывороток крови - значение ККА от 11 до 100 условных единиц и титр антител 1:200-1:400, результат исследования расценен как положительный, так как у пациентов имелись симптомы со стороны желудочно-кишечного тракта, эозинофилия; у 14 человек при ККА от 11 до 100 условных единиц и титре антител 1:200-1:400 результаты исследования расценены как носительство, так как отсутствовали симптомы со стороны желудочно-кишечного тракта и эозинофилия; в 18 образцах опытных сывороток крови получено значение ККА от 6 до 10 условных единиц и титр 1:100, что интерпретировали как сомнительный результат. В контрольной группе во всех образцах сывороток крови значение ККА составляло от 0 до 5 условных единиц, титр антител менее 1:100.

Полученная статистически достоверная зависимость между ККА и титром антител имеет значение для интерпретации результата исследования: отрицательный результат - сомнительный - носительство - положительный результат, что необходимо для лечащего врача.



Предлагаемый способ диагностики и течения лямблиоза экономически выгоден, поскольку при тех же затратах на проведение ИФА в одном разведении сыворотки крови дает количественный результат (титр специфических антител), а не только факт наличия данных антител, что позволяет контролировать эффективность лечения, использовать для диагностики феномен нарастания титра антител в парных сыворотках. 

Клинический пример.

К-ов Павел, 1995 года рождения (история болезни №2512) поступил в терапевтическое отделение областной детской клинической больницы с жалобами на боли в животе, в околопупочной области, вздутие живота, запах изо рта. В анамнезе частые ОРВИ (до двух раз в месяц) с затяжным течением, длительный субфебрилитетом (до 37°С в вечерние часы в течение трех месяцев). При обследовании обнаружено - дефицит массы тела, кожные покровы бледные, с желтушно-цианотичным оттенком, ярко выраженные периорбитальные тени, цианоз носогубного треугольника. Задние шейные лимфоузлы увеличены до 1 см в диаметре, безболезненные, неспаянные с окружающими тканями. Язык густо обложен белым налетом. Живот болезненный в околопупочной области, в правом подреберье и в точке проекции желчного пузыря. Печень выступает из под края реберной дуги на 1 см. Селезенка не пальпируется. При исследовании крови на наличие антител к антигенам лямблий с помощью ИФА с использованием предлагаемого способа получен коэффициент концентрации антител 202 условные единицы, что соответствует титру антител 1:3200 и расценивается как положительный результат. Поставлен диагноз лямблиоз, назначен курс лечения тибералом, желчегонными, ферментными препаратами, фитотерапия. При контрольном исследовании через месяц определен коэффициент концентрации антител 48 условных единиц, что соответствует титру антител 1:200 и было расценено как положительный результат, так как признаки заболевания все еще присутствовали, хотя выражены были слабее - цианоз носогубного треугольника отсутствовал, периорбитальные тени были выражены слабо, задние шейные лимфатические узлы увеличены до 0,3 см в диаметре, температура нормальная, по органам без особенностей, появился аппетит, прибавка в весе 1 килограмм, дефицит массы тела сохраняется. Продолжена терапия желчегонными, ферментными препаратами, фитотерапия. Через два месяца при контрольном исследовании определен коэффициент концентрации антител 5 условных единиц, что соответствует титру антител менее 1:100 и было расценено как отрицательный результат. Ребенок жалоб не предъявлял, кожные покровы нормальной окраски, лимфатические узлы не пальпировались, по органам без особенностей, прибавка в весе 3 килограмма. Таким образом, при предлагаемом способе диагностики и течения лямблиоза несмотря на положительный лабораторный результат исследования на наличие антител к антигенам лямблий после курса лечения тибералом была продолжена патогенетическая терапия без применения антипаразитарных химиопрепаратов, так как титр антител уменьшился в 16 раз, что говорит об эффективности антимикробной терапии. Контрольное исследование, проведенное через два месяца, подтвердило правильность выбранной врачебной тактики - продолжения патогенетической терапии без дополнительного назначения химиопрепаратов, обладающих известными побочными эффектами.




ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


Способ диагностики лямблиоза и его течения, включающий проведение иммуноферментного анализа и определение диагностической оптической плотности и оптической плотности меченного иммунного комплекса в лунке планшета с исследуемой сывороткой, измеряемых в условных единицах при длине волны 492 нм, отличающийся тем, что рассчитывают коэффициент концентрации антител, измеряемый в условных единицах, по формуле: ККА = (ОПиссл - ОПд)×100, где ККА - коэффициент концентрации антител, ОПиссл - оптическая плотность лунки с исследуемой сывороткой, ОПд - диагностическое значение оптической плотности, 100 – коэффициент разведения сыворотки; и по значению ККА определяют титр антител к антигенам Lamblia intestinalis и интерпретируют результаты исследования: значению ККА от 0 до 5 условных единиц соответствует титр антител менее 1:100 и результат исследования расценивают как отрицательный, значению ККА от 6 до 10 условных единиц соответствует титр антител 1:100 и результат исследования считают сомнительным, значениям ККА от 11 до 50 условных единиц и от 51 до 100 условных единиц соответствуют титры антител 1:200 и 1:400 соответственно, и результат исследования расценивают как положительный с диагнозом лямблиоз при наличии симптомов со стороны желудочно-кишечного тракта и эозинофилии или как носительство лямблий при их отсутствии, значениям ККА от 101 до 135 условных единиц, от 136 до 170 условных единиц и от 171 до 205 условных единиц соответствуют титры антител 1:800, 1:1600 и 1:3200 соответственно, и результат исследования считают положительным.