СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ПНЕВМОЦИСТ

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ПНЕВМОЦИСТ


RU (11) 2186390 (13) C1

(51) 7 G01N33/48, C12N5/00 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 10.08.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2002.07.27 
(21) Регистрационный номер заявки: 2001102268/14 
(22) Дата подачи заявки: 2001.01.26 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2001.01.26 
(45) Опубликовано: 2002.07.27 
(56) Аналоги изобретения: KERSFIN E. Laboratory diagnosis and occurrence of Pn. Carinii // Seand: T. Infect. Diseases Suppe, 1994, vol. 94, p.1-34. RU 2124050 C1, 27.12.1998. RU 2122861 C1, 10.12.1998. RU 2040042 C1, 20.07.1995. 
(71) Имя заявителя: Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН 
(72) Имя изобретателя: Каражас Н.В.; Рыбалкина Т.Н. 
(73) Имя патентообладателя: Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН 
(98) Адрес для переписки: 123098, Москва, ул. Гамалеи, 18, НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, патентный отдел 

(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ПНЕВМОЦИСТ 

Изобретение относится к области медицины, а именно к паразитологии, и касается способов выделения пневмоцист (Pneumocystis carinii), которые могут быть использованы для изготовления диагностических тест-систем. Способ характеризуется тем, что для выделения пневмоцист из легких зараженных минисвиней используют трипсин, что позволяет повысить выход целевого продукта, сократить время процедуры до 2 ч и проводить центрифугирование материала при 2000 об/мин. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к медицине, а именно к паразитологии, и касается способов выделения очищенных пневмоцист (Pneumocystis carinii), которые могут быть использованы для приготовления диагностических тест-систем.

Известен способ выделения пневмоцист из легочной ткани зараженных крыс или мышей (1, 2).

Однако при этом способе выделение проводят на дорогостоящем оборудовании при 10000 об/мин с использованием импортных ферментов (коллагеназы, гиалуронидазы, ДНК-азы, РНК-азы) в течение 4-х часов.

Цель изобретения - удешевление способа, сокращение по времени процедуры обработки ферментом, повышение выхода целевого продукта.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что легочную ткань зараженных минисвиней обрабатывают трипсином и центрифугируют при 2000 об/мин.

Пример. Минисвиньям в возрасте от 1 до 1,5 месяцев, весом 1,5-2 кг вводят подкожно в область бедра ацетат кортизона (75-100 мл/кг массы) 2 раза в неделю в течение 2-х месяцев. На второй неделе с начала инъекций проводят интерназальное инфицирование испытуемых животных суспензией пневмоцист при концентрации 106 цист/мл. Для предупреждения бактериальной инфекции в пищу добавляют тетрациклин из расчета 25 мг на 1 кг массы животного. Через 2 месяца минисвиней умерщвляют под эфирной анестезией, иссекают легкие и делают мазки-отпечатки. Окраску препарата осуществляют по методу Романовского-Гимза и оценивают в световом микроскопе при увеличении x 7000 (3).

Ткань легкого измельчают в стерильной чашке Петри, переносят в стерильную колбу с 25% трипсином (t 37oС). Объем трипсина превышает легочную массу в 20 раз. Колбу помещают в термостат при (t 37oС) на магнитную мешалку на 3-4 минуты. Затем отбирают жидкую суспензию, содержащую цисты и клетки легкого, и переносят в стерильный флакон, который ставят в холодильник (t +4oС) для прекращения действия трипсина. Оставшиеся неразрушенные кусочки легких заливают трипсином и повторяют процедуру до полной трипсинизации легкого (5-7 раз). Все полученные пробы жидкой суспензии объединяют и фильтруют через стерильную воронку, покрытую 3-4 слоями стерильной марлевой салфетки, на поверхности которой остаются крупные конгломераты легочной ткани и слизи. Очищенный материал, содержащий цисты, центрифугируют при 2000 об/мин в течение 15-20 минут. Затем надосадочную жидкость удаляют, а к осадку пневмоцист добавляют 1-2 мл раствора Хенкса, ресуспендируют его и доводят до 10 мл раствором Хенкса и вновь центрифугируют при 2000 об/мин. Этот этап отмывки пневмоцист повторяют еще раз. Эта процедура переваривания легочной ткани трипсином занимает 2 часа. После чего полученный осадок ресуспендируют в 1-2 мл раствора Хенкса и готовят контрольный мазок на стекле, который высушивают на воздухе, фиксируют и окрашивают по Романовскому-Гимза или проводят иммунофлюоресцентную реакцию. В препарате должно быть не менее 300 цист в 10 полях зрения. Дальнейшая очистка и концентрация пневмоцист проводятся в градиенте плотности перколла.

Выход целевого продукта в 10 раз превышает выход цист, полученных известным способом.

Таким образом, использование в качестве фермента трипсина позволило удешевить способ выделения пневмоцист, повысить выход целевого продукта, сократить время процедуры до 2 часов и проводить центрифугирование материала при 2000 об/мин.

Литература

1. Kersfin E. Laboratory diagnosis and occurrence of Pn. Carinii//Seand: J. Infect. Diseases Suppe. 1994. Vol. 94. - p.1-34.

2. Walzer P., Powell R., Yoneda K. Experimental Pn. Carinii pneumonia in different stains of cortizonized mice //Infect. Immun., 1979. Vol. 24. - p. 939-947.

3. Васильева В. И. , Каражас Н. В., Плюхин Д.Ю., Савицкий И.Г. А.с. 1685991. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



Способ выделения пневмоцист, включающий заражение животных, обработку ферментами, высокоскоростное центрифугирование, отличающийся тем, что легочную ткань зараженных минисвиней обрабатывают только трипсином и центрифугируют при 2000 об/мин.