СПОСОБ ИММУНОДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИЙ

СПОСОБ ИММУНОДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИЙ


RU (11) 2176794 (13) C2

(51) 7 G01N33/53, G01N27/48 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 10.08.2007 - прекратил действие 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2001.12.10 
(21) Регистрационный номер заявки: 2000105746/14 
(22) Дата подачи заявки: 2000.03.07 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2000.03.07 
(45) Опубликовано: 2001.12.10 
(56) Аналоги изобретения: SU 1789927 А1, 23.01.1993. RU 2095814 С1, 10.11.1997. RU 2136000 С1, 27.08.1999. RU 2136001 С1, 27.08.1999. SU 1492280 А1, 07.07.1989. ЕР 0165830 А1. 27.12.1985. WO 86/02733 А1, 09.05.1986. 
(71) Имя заявителя: Пермская государственная медицинская академия 
(72) Имя изобретателя: Самоделкин Е.И.; Горовиц Э.С.; Николаев Д.В. 
(73) Имя патентообладателя: Пермская государственная медицинская академия 
(98) Адрес для переписки: 614600, г. Пермь, ул. Куйбышева, 39, ПГМА, патентный отдел 

(54) СПОСОБ ИММУНОДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИЙ 

Изобретение относится к медицине и предназначено для диагностики острых вирусных и бактериальных инфекций. Сущность изобретения: диагностическое исследование проводят с кровью больного, определяя косвенным образом полярографическим методом количество антигена микробов, связанного эритроцитами крови, в сравнении с контрольными исследованиями по степени уменьшения величины волны ионов меди, связанных этим антигеном. Технический результат: способ позволяет ускорить и упростить диагностику острых вирусных и бактериальных инфекций. 7 ил. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к медицине и может быть использовано для диагностики острых вирусных и бактериальных инфекций.

Известен способ иммунодиагностики инфекций путем определения фагоцитарной активности лейкоцитов двух проб крови больного при инкубации ее со специфическим объектом фагоцитоза с добавлением в одну из проб растворимой специфической микробной субстанции, далее рассчитывают индекс изменения фагоцитоза специфического объекта по уровням фагоцитоза в пробе с дополнительным воздействием специфической микробной субстанции по отношению к показателям пробы без дополнительного микробного воздействия и при значении индекса менее 0,75 диагностируют инфекцию (А.с. СССР N 1789927, МКИ G 01 N 33/53). Способ иммунодиагностики инфекций/ В.Н. Каплин, Е.И. Самоделкин, В. Ф. Коломойцев (СССР). - N 4866935/14; Заявлено 11.09.90; Опубл. 23.01.93. Бюл. N 3 // Открытия. Изобретения. - 1993.- N 3.- C.12.

Однако визуальный подсчет объектов фагоцитоза носит определенный субъективный характер и требует определенных временных затрат. В связи с этим особый интерес представляют аппаратные методы определения степени связывания антигенов.

Изобретение направлено на ускорение, упрощение способа при высокой чувствительности и специфичности.

Сущность изобретения: указанная задача достигается тем, что диагностическое исследование производят с кровью больного, определяя полярографическим методом количество антигена микробов, связанного клетками крови больного до и после дополнительного воздействия на клетки крови тем же самым антигеном по изменению величины волны ионов меди, связанных этим антигеном. Исследование не плазмы, а чувствительности клеток крови к различным антигенам микробов обеспечивает диагностику инфекционных заболеваний даже в самые ранние сроки от момента заражения.

Известно, что полярографически неактивные вещества можно обнаружить, если ввести в испытуемое соединение активную группу либо определять косвенно по уменьшению волны восстанавливающего вещества, дающего с испытуемым соединением осадок или комплекс.

Полярографическое исследование позволяет количественно (после составления калибровочной кривой) определить степень связывания антигена клетками крови по убыли микроколичества количества ионов меди. В свою очередь, сравнение полярограмм здоровых контрольных доноров и больных лиц позволяет поставить диагноз.

В качестве фонового раствора используют 30%-ный CaCl2 в объеме 4,8 мл. В электролизер добавляют 10 гамма двухвалентной меди (0,1 мл стандартного раствора с концентрацией 100 гамма меди в 1 мл) и после перемешивания производят трехкратную запись полярограммы.

После этого непосредственно в электролизер добавляют 0,1 мл исследуемого раствора, перемешивают и производят запись полярограммы, измеряя величину полуволны в мм. На основании заранее произведенной калибровки рассчитывают количество антигена, оставшегося в растворе после взаимодействия с эритроцитами, и диагностируют заболевание.

Способ поясняется чертежами полярограмм, где на фиг. 1 а показана полярограмма фонового раствора 30% CaCl2;

- фиг. 1 б - совмещенная полярограмма фонового раствора и раствора 10 гамма Cu++;

- фиг. 2 - полярограмма фонового раствора и раствора 10 гамма Cu++;

- фиг. 3 - полярограмма после внесения в электролизер 0,1 мл исследуемого антигена;

- фиг. 4 полярограмма после внесения в электролизер 0,1 мл исследуемого антигена, контактировавшего с кровью здоровых лиц без дополнительного воздействия антигена;

- фиг. 5 - полярограмма после внесения в электролизер 0,1 мл исследуемого антигена, контактировавшего с кровью здоровых лиц при дополнительном воздействии антигена;

- фиг. 6 - полярограмма после внесения в электролизер 0,1 мл исследуемого антигена, контактировавшего с кровью больных лиц без дополнительного воздействия антигена;

- фиг. 7 - полярограмма после внесения в электролизер 0,1 мл исследуемого антигена с кровью больных лиц при дополнительном воздействии антигена.

Способ осуществляют следующим образом.

Для исследования берут 0,1 мл крови, смешивают с консервантом (0,1 мл "Глюгицира"), центрифугируют в течение 5-10 мин при 500 об/мин, удаляют плазму с антикоагулянтом, трижды отмывают клетки крови от остатков плазмы 0,9%-ным раствором хлористого натрия, разбавляют клетки крови в 0,9%-ном растворе хлористого натрия до 5-10%, в 2 пробы по 0,1 мл этой взвеси добавляют по 0,1 мл исследуемого антигена (гриппа, энтеровируса Коксаки В, шигелл Флекснер, Зонне, Ньюкестл или др.), перемешивают и инкубируют полученные смеси 3-5 мин в термостате при 37-37,5oC, затем одну пробу центрифугируют, после чего снимают полярограмму 10 гамма CuCl++ в фоновом растворе 30% CaCl2, добавив 0,1 мл надосадочной жидкости, вновь снимают полярограмму, принимая ее как АСАЭ без дополнительного воздействия микробным антигеном. Параллельно во вторую пробу крови больного повторно добавляют 0,1 мл того же антигена, перемешивают и вновь инкубируют при 37-37,5oC, центрифугируют, после чего снимают полярограмму вышеописанным способом и сравнивают величины полярограмм до и после дополнительного воздействия антигена на клетки крови. У здоровых лиц дополнительное воздействие антигена вызывает увеличение АСАЭ, тогда как у больных происходит торможение антигенсвязывающей активности эритроцитов после дополнительного воздействия того же антигена.

Ячейка электролизера полярографа заполнена фоновым раствором 4,8 мл 30%-ного CaCl2. При подаче напряжения на электроды электролизера в фоновом растворе ячейки полярографа появляется электрический ток, который регистрируется самописцем полярографа в виде стандартной кривой (фиг. 1 а), а при внесении в электролизер 10 гамма Cu++ наблюдается отклонение в виде полуволны (фиг. 1 б).

Величина тока зависит от количества электропроводящих ионов в растворе ячейки электролизера полярографа, каковыми в нашем исследовании являются ионы CaCl2 фонового раствора и добавляемое микроколичество двухвалентных ионов меди - 10 гамма Cu++ (фиг. 2).

Самописец полярографа графически отображает величину тока между электродами ячейки полярографа на бумажной ленте. Определяют зависимость между величиной электрического тока и количеством добавленных в ячейку ионов меди по степени отклонения пера самописца на бумаге. На этом основании составляют калибровочную кривую, измеряя величину отклонения пера самописца полярографа после внесения в электролизер 0,1 мл исследуемого антигена, который, связывая ионы меди, уменьшает величину волны (фиг. 3). Величина, на которую уменьшилась длина волны, принимается за 100 % расчетной величины степени связывания антигена.

После составления калибровочной кривой исследуют способность клеток крови здоровых лиц связывать на своей поверхности исследуемый антиген. Для этого клетки крови разводят в 0,9%-ном растворе хлористого натрия, добавляют исследуемый антиген и после инкубации в термостате клеток крови с антигеном эту смесь центрифугируют. Надосадочную жидкость отсасывают микропипеткой и вносят в ячейку электролизера ртутно-капельного полярографа, в которую заранее внесен фоновый раствор 30%-ного CaCl2 с 10 гамма Cu++. При подаче напряжения на электроды электролизера в растворе появляется электрический ток, который вызывает отклонение пера самописца от стандартной кривой фонового раствора. Параметры исследования всегда являются постоянными. В этом случае величина тока зависит от количества электропроводящих ионов в растворе ячейки электролизера полярографа, каковыми в нашем исследовании являются ионы Cu++. Для определения степени связывания исследуемого антигена клетками крови здоровых лиц величину электрического тока по степени отклонения пера самописца на бумаге в миллиметрах делят на величину в мм, полученную при определении эталона, и определяют процент связывания количества антигена в данном исследовании до и после дополнительного воздействия антигеном. У здоровых лиц степень связывания эритроцитами антигена после дополнительного воздействия тем же антигеном возрастает, тогда как у больного после дополнительного воздействия антигена связывание его уменьшается вследствие торможения.

Пример расчета:

фиг. 2) величина волны полярограммы 10 гамма меди в 30%-ном CaCl2 = 160 мм;

фиг. 3) эта величина сократилась после добавления антигена до 100 мм, таким образом при добавлении 0,1 мл исследуемого антигена волна уменьшилась на 60 мм, что принимается за 100% переменной величины при добавлении антигена;

фиг. 4) при записи полярограммы здорового человека после первичного контакта с антигеном величина волны составила 110 мм, соответственно 110 - 100 = 10 мм: 60 мм = связывание антигена 16,6%;

фиг. 5) при записи полярограммы здорового человека после повторного контакта с антигеном величина волны составила 123 мм, соответственно 123-100= 23 мм: 60 мм=38,3% (уровень АСАЭ еще больше возрос - здоровый донор);

фиг. 6) при записи полярограммы больного человека после первичного контакта с антигеном величина волны составила 130 мм, соответственно 130-100=30: 60 (уровень АСАЭ сразу достиг 50% дозы антигена - больной человек);

фиг. 7) при записи полярограммы больного человека после дополнительного воздействия антигеном величина волны составила 110 мм, соответственно 110-100=10 мм:60 мм=16,6 % (уровень АСАЭ снизился - больной человек).

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Б-ной И-нов (43 лет) поступил в инфекционное отделение ОКБ с жалобами на высокую температуру, головную боль, боли в животе. Болен 3-й день. Предварительный диагноз: "Энтеровирусная инфекция". Берут 0,1 мл крови больного, смешивают с консервантом (0,1 мл "Глюгицира"), центрифугируют в течение 5-10 мин при 500 об/мин, удаляют плазму с антикоагулянтом, трижды отмывают клетки крови от остатков плазмы 0,9%-ным раствором хлористого натрия, разбавляют клетки крови в 0,9%-ном растворе хлористого натрия до 5-10%, смешивают 2 пробы по 0,1 мл этой взвеси с 0,1 мл исследуемого антигена (энтеровируса Коксаки В), инкубируют полученные смеси 3-5 мин в термостате при 37-37,5oC, одну пробу центрифугируют, после него снимают полярограмму 10 гамма Cu++ в фоновом растворе 30%-ного CaCl2 (величина волны 160 мм) и, добавив 0,1 мл надосадочной жидкости первой пробы, вновь снимают полярограмму (величина волны 135 мм). Величина волны с 0,1 мл исследуемого антигена (энтеровируса Коксаки В) 105 мм, таким образом эритроцитами больного связано 135-105=30 мм: 55 мм х 100% =54,5%.

Параллельно во вторую пробу крови больного повторно добавляют 0,1 мл того же антигена, перемешивают и вновь инкубируют при 37-37,5oC, центрифугируют, после чего снимают полярограмму вышеописанным способом. Величина волны 105 мм, таким образом эритроцитами больного связано 105-105=0 мм:55 мм х 100%=0,0% (торможение АСАЭ после дополнительного воздействия того же антигена характерно для больного человека.

Заключение: у больного энтеровирусная инфекция (диагноз позднее был подтвержден серологически и клинически).

Пример 2. Донор С-кин (52 года). Берут 0,1 мл крови больного, смешивают с консервантом (0,1 мл "Глюгицира"), центрифугируют в течение 5-10 мин при 500 об/мин, удаляют плазму с антикоагулянтом, трижды отмывают клетки крови от остатков плазмы 0,9%-ным раствором хлористого натрия, разбавляют клетки крови в 0,9%-ном растворе хлористого натрия до 5-10%, смешивают 2 пробы по 0,1 мл этой взвеси с 0,1 мл исследуемого антигена (энтеровируса Коксаки В), инкубируют полученные смеси 3-5 мин в термостате при 37-37,5oC, одну пробу центрифугируют, после чего снимают полярограмму 10 гамма Cu++ в фоновом растворе 30%-ного CaCl2 (величина волны 160 мм) и, добавив 0,1 мл надосадочной жидкости первой пробы, вновь снимают полярограмму (величина волны 115 мм). Величина волны с 0,1 мл исследуемого антигена (энтеровируса Коксаки В) 105 мм, таким образом эритроцитами связано 115-105=10 мм:55 мм х 100% = 18,2% (уровень связывания здорового человека).

Параллельно во вторую пробу крови повторно добавляют 0,1 мл того же антигена, перемешивают и вновь инкубируют при 37-37,5oC, центрифугируют, после чего снимают полярограмму вышеописанным способом. Величина волны 125 мм, таким образом эритроцитами больного связано 123 - 105 = 20 мм: 55 мм х 100% = 36,4% (уровень АСАЭ после дополнительного воздействия антигена возрос - это здоровый человек).

Заключение: у обследуемого энтеровирусной инфекции нет.

Заключение: учитывая, что основными методами диагностики инфекций являются клинические и серологические методы, результаты которых имеет лишь ретроспективное значение (определение степени нарастания титров антител в "парных" сыворотках производится через 10-15 дней от начала заболевания), либо выделение и идентификация возбудителя в материале от больного человека (что весьма трудоемко и занимает большой промежуток времени), а заявляемый способ позволяет поставить диагноз заболевания в течение 25-30 мин от начала обследования больного и может быть использован для дифференциальной диагностики от сходных с ним по клиническим признакам заболеваний.

Предлагаемый способ точен, при повторных полярографических исследованиях результаты были практически одинаковыми.

Предлагаемый способ объективен, т.к. заключение о наличии заболевания делается на основании величины полярографической волны антигена надосадочной жидкости, что осуществляется простым замером с помощью миллиметровой линейки, исключая всякий субъективизм в оценке результатов.

Предлагаемый способ значительно уменьшает трудоемкость и повышает производительность труда по сравнению с аналогами. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



Способ иммунодиагностики инфекций, включающий забор пробы крови, получение эритроцитов с последующим добавлением к ним 0,9%-ного раствора хлорида натрия, а затем раствора исследуемого антигена, инкубирование полученной смеси и определение диагностики значимого показателя, отличающийся тем, что к двум пробам смеси эритроцитов и хлорида натрия добавляют раствор исследуемого антигена при их объемном соотношении 1:1, полученные смеси перемешивают и инкубируют в течение 3-5 мин при 37-37,5oС, затем первую пробу центрифугируют, снимают полярограмму 10 мкг ионов Cu++ в 30%-ном растворе СаС12 после добавления надосадочной жидкости и принимают за эталон, а во вторую пробу дополнительно вносят антиген, смесь повторно перемешивают и инкубируют в течение 3-5 мин при 37-37,5oС, затем центрифугируют, снимают полярограмму 10 мкг ионов Cu++ в 30%-ном растворе СаС12 после добавления надосадочной жидкости и сравнивают с эталонной полярограммой и при уменьшении степени отклонения пера самописца в полярограмме после дополнительного добавления антигена по сравнению с величиной отклонения пера самописца на эталонной полярограмме диагностируют заболевание.