СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ЛЕГОЧНОГО МЕЛИОИДОЗА

СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ЛЕГОЧНОГО МЕЛИОИДОЗА


RU (11) 2157538 (13) C1

(51) 7 G01N33/569 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 18.07.2007 - прекратил действие 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2000.10.10 
(21) Регистрационный номер заявки: 99105823/14 
(22) Дата подачи заявки: 1999.03.16 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 1999.03.16 
(45) Опубликовано: 2000.10.10 
(56) Аналоги изобретения: ALEKSEEV V.V. et al. Experimental bacterial aerosols: some phisical and biological (pathogenic) propeties. J. Aerosol. Sci. - 1994, vol.25 N 8, p.1413. US 5210019 A, 11.05.1993. US 5389521 A, 14.02.1995. WO 90/135563 A1, 25.11.1990. DE 4301087 A1, 21.07.1994. JP 61013157, 21.01.1986. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология /Под ред. Л.Б.Борисова и др. - М.: Медицина, 1994, с.293-297. Воспаление. Руководство для врачей /Под ред.В.В.Серова и др. - М.: Медицина, 1995, с.377-379. 
(71) Имя заявителя: Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт 
(72) Имя изобретателя: Алексеев В.В.; Вязьмина Т.Н.; Плеханова Н.Г.; Демедюк Е.А.; Попов С.Ф.; Каплиев В.И.; Пивень Н.Н. 
(73) Имя патентообладателя: Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт 
(98) Адрес для переписки: 400131, г.Волгоград, ул. Голубинская 7, ВолгНИПЧИ, Тихонову Н.Г. 

(54) СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ЛЕГОЧНОГО МЕЛИОИДОЗА 

Изобретение относится к микробиологии, в частности к способам моделирования инфекционных болезней с аэрогенным механизмом заражения. Способ основан на создании экспериментальной модели легочного мелиоидоза, позволяющей воспроизвести острую форму заболевания с механизмом развития инфекции. В качестве экспериментальных животных используют белых крыс. Инфицируют животных аспирационными дозами, равными 1,3-20,0 ЛД50 (ЛД50 = 3133 ж.м.кл.) штамма P. pseudomallei 100-16-1, лишенного одного из факторов вирулентности - антигена 8. Инфицирование проводят в динамической аэрозольной установке диаметром 0,29 м при скорости воздушного потока 0,15-0,5 м/с, производительности генератора аэрозолей по воздуху 30 л/мин, по жидкости 1,5-3,0 мл/мин, времени заражения 5 мин. Способ позволяет воспроизвести у белых крыс острую форму легочного мелиоидоза с атипичным течением, переходящую у 50% животных в доброкачественное течение. Биологическая модель может быть использована для экспериментального изучения широкого круга научно-практических вопросов. 4 ил., 1 табл. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к микробиологии, в частности к способам моделирования инфекционных болезней с аэрогенным механизмом заражения.

Мелиоидоз, особо опасное инфекционное заболевание, широко распространен в эндемичных районах, а также зарегистрирован в ряде географически отдаленных странах, в том числе и европейских. Аэрогенный путь заражения в естественных условиях оценивает как равнозначный или второй по значению после чрескожного, что наряду с высокой чувствительностью легочной ткани к мелиоидозному микробу, объясняет большую частоту первичных пневмоний у человека и животных.

Разработка методов и средств диагностики, лечения и профилактики легочного мелиоидоза основывается на знании механизма развития заболевания, который изучают на экспериментальных биологических моделях, адекватных поставленным задачам и наиболее приближенных к человеку.

Известны способы моделирования острой формы легочного мелиоидоза на золотистых хомячках (Dannenberg A.M., Scott E.M. Melioidosis pathogenesis and immunity in mice and hamsters. I. Studies with virulent strains of Malleomyces pseudomallei// J. Exp. Med. - 1958. -Vol. 107, n.1. -P. 153-166), острого, подострого и хронического течения на морских свинках и белых мышах (Studies on certain biological characteristics of Malleomyces mallei and Malleomyces pseudomallei. II, Virulense and infectivity for animals/ Miller W.R., Pannel L., Cravitz L. et al.// J. Bacteriol. -1948. - Vol. 55, n. 1. -P. 127-135). Однако указанные способы не позволяют воспроизвести весь спектр клинических проявлений легочного мелиоидоза, в частности, доброкачественное течение заболевания, а также смоделировать вариации патогенеза инфекции.

Наиболее близким является способ воспроизведения легочного мелиоидоза на белых крысах (Experimental bacterial aerosoles some physical and biological (pathogenic) properties/ Alekseev V.V., Tikhonov N.G., Savchenko S.T. et al. // J. Aerosol. Sci. -1994 Vol. 25, n. 8. -P.1413). В зависимости от вирулентности использованного для заражения штамма мелиоидозного микроба у животных наблюдали молниеносное, острое, подострое и хроническое течение легочного мелиоидоза с характерными для каждой клинической формы особенностями патогенеза инфекционного процесса. В целом, модель легочного мелиоидоза на белых крысах можно считать наиболее оптимальной, учитывая диапазон воспроизводимых клинических вариантов заболевания и близкую степень резистентности к мелиоидозной инфекции белых крыс и человека. Однако указанная модель имеет те же недостатки, что и модели-аналоги.

При аэрогенном заражении в естественных условиях нередки случаи перехода заболевания из острой стадии в доброкачественное течение. Попытки моделирования такой формы инфекции при использовании типичных штаммов Pseudomonas pseudomallei различной степени патогенности оказались безуспешным, то есть тезис "все-или-ничего" для мелиоидоза оставался верным и для аэрогенного способа инфицирования (Dannenberg A.M., Scott E.M. Melioidosis pathogenesis and immunity in mice and hamsters III. Effect of vaccination with avirulent strains of Pseudomonas pseudomallei on the progress of respiratory melioidosis caused by virulent strains: all-or- none aspects of this disease// J. Immunol. -1960<-Vol. 84, n.3. P. 233-246).

Целью настоящего изобретения является создание экспериментальной модели легочного мелиоидоза, позволяющей воспроизвести острую форму заболевания с механизмом развития инфекции, отличающегося от известных ранее, переходящую в доброкачественное течение, что наиболее полно отражает клинику и патогенез реальной инфекции у человека.

Поставленная цель достигается тем, что для аэрогенного заражения 1 белых крыс используют штамм возбудителя мелиоидоза, утративший способность синтезировать биологический комплекс, условно обозначенный как антиген 8 (Аг8), с которым связывают антифагоцитарную активность микроба. Штамм P. pseudomallei 100-16-1 с измененным фенотипом получен методом селекции на питательных средах с антисывороткой к Аг8 и находится в рабочей коллекции культур патогенных микроорганизмов лаборатории иммунохимии Волгоградского НИПЧИ; регистрационный N16 журнала учета ПБА, форма N 518/V. Утрата микробом одного из признаков, детерминирующих патогенность, привела к авирулентности возбудителя для относительно резистентных к мелиоидозу белых крыс при парентеральных способах заражения, но при аэрогенном инфицировании эти животные оказались чувствительными к мелиоидозу. Экспериментально установлено, что величина ЛД50 при заражении белых крыс атипичным штаммом P. pseudomallei 100-16-1 составила 3133 (2961 - 3902) ж.м.кл., что более чем в 20 раз превышало тот же показатель для исходного, полноценного штамма P. pseudomallei 100 (ЛД50=135 (84,4-216,0) ж.м.кл.

Проведено сравнительное изучение патогенеза легочного мелиоидоза у белых крыс, зараженных одинаковыми дозами типичного и атипичного по Аг8 штаммами мелиоидозного микроба. Животных заражали в горизонтальной динамической аэрозольной камере при скорости воздушного потока 0,15-0,5 м/с. Производительность пневматического генератора аэрозолей по воздуху составляла 30 л/мин, по жидкости - 1,5-3,0 мл/мин, фракционно-дисперсный состав (ФДС) аэрозоля - 70-80% частиц, диаметром до 3,0 мкм, время экспозиции крыс в аэрозоле 5 мин. При указанных технических параметрах эксперимента для распыления использованы бактериальные суспензии штаммов с концентрациями, позволяющими получать животным равные аспирационные дозы в пределах 4,1-4,8 103 ж.м.кл.

У белых крыс, аэрогенно зараженных типичным шаммом P. pseudomallei 100, возникала острая форма легочного мелиоидоза, основные этапы развития которого характеризовались сдедующими особенностями:

- формированием через 24-48 ч в легких первичного патологического комплекса и в последующем - развитием гнойной бронхопневмонии;

выраженной инвазивностью инфекта, быстрой диссеминацией возбудителя в макроорганизме, интенсивным размножением микробов во внутренних органах;

- развитием токсемии в первые часы после заражения, повышением уровня токсинов в органах и тканях по мере нарастания патологических явлений;

- образованием в печени и селезенке гранулем, преимущественно экссудативного характера с выраженными дегенеративными изменениями в составляющих их клетках;

- гипоплазией и аплазией лимфоидной ткани;

- селекцией в макроорганизме капсульных вариантов микроба и фагоцитозом по "незавершонному" типу;

- течением инфекционного процесса по типу септицемии;

- гибелью через 5-7 дней всех взятых в опыт животных.

При респираторном заражении белых крыс атипичным штаммом P. pseudomallei 100-16-1 у животных также развивалась острая форма легочного мелиоидоза, которая в 50% случаев заканчивалась летальным исходом, а у остальных крыс переходила в доброкачественное течение, заканчивающееся выздоровлением. Острый инфекционный процесс, вызванный атипичным штаммом возбудителя, имел как сходство, так и существенные отличия в патогенезе заболевания по сравнению с инфекцией, обусловленной исходным штаммом P. ppseudomallei 100:

- развитие в легких в первые дни после заражения первичного патологического комплекса, а затем - гнойной бронхопневмонии, но в отличие от типичного процесса, охватывающей только сегменты или доли легких, а также большая частота гнойных плевритов и воспалительных явлений в печени;

- низкая инвазивность возбудителя, присутствие микробов в ранние сроки заболевания в отдаленных лимфоузлах, преимущественная локализация возбудителя в месте внедрения инфекта и регионарных лимфоузлах, слабовыраженная бактериемия;

- менее интенсивный, по количественным и качественным показателям, процесс интоксикации;

- отсутствие в печени и селезенке специфических для мелиоидоза патоморфологических элементов - гранулем;

- течение инфекционного процесса у некоторых животных по типу септикопиемии;

- отсутствие у микробов капсулы, "завершенный" тип фагоцитоза;

- гибель животных (50%) через 5-7 дней после заражения.

Переход на 6-7 день заболевания острой формы легочного мелиоидоза в доброкачественную характеризовался следующими особенностями:

- нарастанием в легких продуктивных процессов, направленных на отграничение и рассасывание очагов воспаления и наличием тех же явлений в печени и селезенке;

- элиминацией возбудителя и его токсинов из макроорганизма;

- наличием иммуноморфологических явлений;

- полным выздоровлением 50% взятых в опыт животных.

Таким образом, использование для аэрогенного инфицирования белых крыс штамма мелиоидозного микроба с нарушенным синтезом одного из факторов вирулентности антигена 8 и многократные опыты по отработке технических и биологических условий заражения позволили создать новую экспериментальную модель легочного мелиоидоза. Патогенез острой формы заболевания имел значительные отличия от механизма развития инфекции, вызванной типичным микробом, что позволило классифицировать смоделированный процесс как атипичный легочный мелиоидоз. Получено и охарактеризовано доброкачественное течение экспериментального легочного мелиоидоза, ранее в литературе не описанного. Разработанная модель по своим патогенетическим особенностям в значительной мере соответствует развитию легочного мелиоидоза у человека, дополняет известный спектр клинических проявлений заболевания и может с высокой эффективностью использоваться для экспериментального решения научных и практических задач. В их числе могут быть детальное изучение патогенеза и иммунных реакций при атипичном легочном мелиоидозе, определение факторов, способствующих переходу острой фазы заболевания в доброкачественное течение, изучение особенностей взаимодействия микро- и макроорганизма на субклеточном уровне, механизма адаптации атипичных штаммов мелиоидозного микроба при аэрогенном заражении животных, разработка методов и средств лабораторной диагностики, лечения и профилактики и т.д.

Одним из примеров использования модели для решения конкретных научных вопросов может служить изучение механизма адаптации штаммов мелиоидозного микроба с неполным набором антигенных детерминант при экспериментальном легочном мелиоидозе. Белых крыс заражали аэрозолем дефектного по Аг8 штамма возбудителя мелиоидоза 100-16-1 дозой, равной 4,2 103 ж.м.кл. при условиях, описанных выше.

В различные сроки после заражения животных забивали и делали посев внутренних органов на питательные среды. У выделенных культур, после контроля в иммунохимических реакциях отсутствия реверсии штаммов к исходному фенотипу, определяли уровень активности протеолитических ферментов полуколичественным методом на питательных средах с 0,25% "Skin-Milk" (Пивень Н.Н. Протеазы патогенных псевдомонад, выделение и детекция // Тезисы докл. VII Всесовзн. съезда микроб., эпидемиолог., паразитолог. -Нижн. Новгор., 1991. -т. II. С. 122). Таким же методом исследовали культуры, выделенные от крыс, зараженных исходным, полноценным штаммом P.pseudomallei 100. Результаты изучения показали, что при острой форме легочного мелиоидоза протеолитическая активность бактерий атипичного штамма в 5 раз превышала тот же показатель исходной культуры (фиг. 1,2). Аналогичные результаты получены при определении активности гемолизинов, коллагеназы и эластазы. На стадии разрешения инфекционного процесса, вызванного атипичным возбудителем, активность бактериальных ферментов снижалась до исходного уровня. Полученные результаты позволяют сделать заключение о том, что механизм адаптации атипичных клеток микроба при аэрогенной мелиоидозной инфекции, направленный на сохранение патогенных свойств возбудителя, определяется системой ферментов микроба.

Предлагаемая модель атипичного легочного мелиоидоза может быть использована для изучения особенностей взаимодействия микробных клеток атипичного штамма и альвеолярных макрофагов (AM) макроорганизма на различных стадиях инфекционного процесса. Группу белых крыс заражали аэрогенным методом штаммом возбудителя мелиоидоза 100-16-1 (Аг8-) аспирационной дозой, равной 2,6 107 ж.м.кл. При развитии острой формы заболевания, на различных его стадиях, животных умерщвляли, из пораженных участков легких вырезали образцы ткани и обрабатывали общепринятыми приемами для исследования методом электронной микроскопии. Для проведения сравнительного анализа такой же эксперимент проведен с исходным штаммом P. pseudomallei 100, результаты которого показали, что клетки типичного штамма выявлялись, как правило, внутри фагосом AM и были устойчивы к внутриклеточному перевариванию (фиг. 3). Во всех случаях внутриклеточного паразитирования вокруг каждого интактного микроба выявлялась капсула, шириной 200-300 нм.

Основная масса микробных клеток атипичного штамма в начале развития инфекции, как и в случае заражения полноценным возбудителем, находилась внутри альвеолярных макрофагов, преимущественно в фаголизосомах, не имела капсулы или только ее остатки, шириной 20-40 нм и быстро подвергалась деструкции. Отдельные микробные клетки разрушали мембрану фагосомы и выходили в цитоплазму макрофага, что являлось признаком повышенной протеолитической активности таких микроорганизмов и обеспечивало условия их дальнейшего паразитирования (фиг. 4). Полученные результаты в значительной мере объясняют и дополняют механизм сохранения патогенных свойств возбудителя мелиоидоза, не синтезирующего Аг8.

На разработанной экспериментальной модели изучена возможность проведения бактериологической диагностики атипичного легочного мелиоидоза. Белых крыс заражали аэрозолем атипичного штамма мелиоидозного микроба 100-16-1 дозой 4,1 103 ж.м.кл. при тех же условиях. Клинический материал - смыв с носоглотки, кровь и мочу в различные сроки после заражения высевали на чашки с агаром, приготовленным на основе гидролизата казеина (pH 6,9). При развитии острой формы легочного мелиоидоза (первые пять суток) культуры возбудителя были изолированы из смыва с носоглотки, а на стадии генерализации инфекции - из других видов материала (табл.). По мере разрешения инфекционного процесса, то есть перехода в доброкачественное течение, процент выделенных культур постепенно снижался и на 24 сутки макроорганизм полностью освобождался от инфекта. Полученные результаты составили основу схемы лабораторной диагностики атипичного легочного мелиоидоза бактериологическим методом, учитывающей особенности патогенеза инфекции.

Пример 1. Группу из 20 белых крыс заражали полноценным по антигенному составу штаммом P. pseudomallei 100 в горизонтальной динамической камере при скорости воздушного потока 0,15-0,5 м/с, производительности пневматического распылителя по воздуху - 30 л/мин, по жидкости - 1,5-3,0 мл/мин, ФДС аэрозоля - 70-80% частиц диаметром до 3,0 мкм, экспозицией животных в аэрозоле в течение 5 мин. Аспирационная доза - 4,1-4,8 103 ж.м.кл. У белых крыс возникала острая форма легочного мелиоидоза с развитием в легких тотальной гнойной бронхопневмонии, интенсивной диссеминацией инфекта, выраженной интоксикацией, образованием в печени и селезенке специфических образований - гранулем экссудативного характера, течением инфекционного процесса по типу септицемии и гибелью всех животных на 5-7 сутки.

Пример 2. Группу из 20 белых крыс заражали аэрогенным методом дефектным по Аг8 штаммом P. pseudomallei 100-16-1 при условиях, описанных в примере 1. У животных возникала острая форма легочного мелиоидоза с атипичным течением, характеризующаяся следующими особенностями: развитием в легких сегментарной или долевой гнойной бронхопневмонии, гнойных плевритов и воспаления в печени; низкой инвазивностью и, как следствие, слабовыраженной диссеминацией возбудителя и бактериемии, менее интенсивным процессом интоксикации; отсутствием в печени и селезенке специфических гранулем; течением у отдельных животных инфекционного процесса по типу септикопиемии; гибелью через 5-7 дней в среднем 50% животных. У выживших белых крыс заболевание приобретало доброкачественное течение с нарастанием в легких продуктивных процессов, элиминацией возбудителя и его токсинов, активизацией иммунных процессов и выздоровлением животных.

Пример 3. Две группы по 20 белых крыс заражали аэрогенно при условиях, указанных в примере 1, типичным (P. pseudomallei 100) и атипичным (P. pseudomallei 100-16-1) штаммами мелиоидозного микроба аспирационными дозами 4,2 103 ж. м.кл. В различные сроки после заражения животных забивали, делали посев внутренних органов на питательные среды, после идентификации и контроля на отсутствие реверсии к исходному фенотипу, у выделенных культур изучали активность протеолитических ферментов полуколичественным методом на средах, содержащих 0,25% "Skin-Milk". Установлено, что активность протеаз штамма мелиоидозного микроба, не продуцирующего Аг8 в 5 раз превышала тот же показатель типичного по антигенному составу возбудителя мелиоидоза. Аналогичные результаты получены при изучении активности гемолизинов, эластазы и коллагеназы. При переходе острой формы легочного мелиоидоза, вызванного атипичным возбудителем, в доброкачественное течение, активность изученных энзимов снижалась до исходного уровня. Полученные результаты позволили сделать заключение о том, что система ферментов является определяющей в механизме адаптации атипичных микробных клеток при аэрогенной мелиоидозной инфекции.

Пример 4. Две группы по 20 белых крыс заражали аэрогенным методом типичным - P. pseudomallei 100 и атипичным - P. pseudomallei 100-16-1 (Аг8-) штаммами, аспирационной дозой 2,6 107 ж.м.кл. при условиях, описанных в примере 1. В различные сроки после инфицирования образцы легочной ткани зараженных животных исследовали методом электронной микроскопии. Микробные клетки типичного штамма возбудителя мелиоидоза были устойчивы к внутриклеточному перевариванию, находились преимущественно в фаголизосомах альвеолярных макрофагов и имели выраженную капсулу, шириной 200- 300 нм, что определяло жизнеспособность микробов и их дальнейшее участие в развитии инфекции. Терминальная стадия легочного мелиоидоза, вызванного атипичным штаммом возбудителя, характеризовалась селекцией микробных клеток, обладающих повышенной протеолитической активностью, что являлось условием, обеспечивающим их дальнейшее паразитирование и патогенетическое действие на макроорганизм. Полученные результаты подтвердили данные экспериментов, приведенные в примере 3.

Пример 5. Группу из 50 белых крыс заражали атипичным по Аг8 штаммом мелиоидозного микроба (P. pseudomallei 100-16-1) аэрогенным методом, дозой 4,1 103 ж.м.кл. Клинический материал - смыв с носоглотки, кровь и мочу исследовали бактериологическим методом, посевом на твердые питательные среды, приготовленные на основе гидролизата казеина (pH 6,9). В острой фазе заболевания культур атипичного мелиоидозного микроба выделяли преимущественно из смывов с носоглотки, на стадии генерализации инфекции - из крови и мочи. При переходе заболевания в доброкачественное течение инфект изолировали из всех видов материала. Далее наблюдали освобождение макроорганизма от возбудителя мелиоидоза. На основе полученных результатов разработана схема лабораторной диагностики атипичного легочного мелиоидоза бактериологическим методом. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



Способ моделирования легочного мелиоидоза, включающий аэрогенное заражение белых крыс возбудителем мелиоидоза, отличающийся тем, что животных заражают 1,3 - 20,0 LD50 (LD50 = 3133 ж.м.кл.) штамма P.Pseudomallei 100-16-1, не продуцирующего антиген 8 - один из факторов вирулентности, заражение осуществляют в динамической аэрозольной камере диаметром 0,29 м при скорости воздушного потока 0,15 - 0,5 м/с, производительности генератора аэрозолей по воздуху 30 л/мин, по жидкости 1,5 - 3,0 мл/мин, времени заражения 5 мин, в результате чего у белых крыс наблюдают атипичную форму острого легочного мелиоидоза, переходящую у 50% животных в доброкачественное течение.