СПОСОБ РАННЕГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТЯЖЕСТИ ЗАБОЛЕВАНИЯ И ОЦЕНКА ПРОЦЕССА ЛЕЧЕНИЯ СЕПСИСА, А ТАКЖЕ СРЕДСТВА ДЛЯ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ УКАЗАННОГО СПОСОБА

СПОСОБ РАННЕГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТЯЖЕСТИ ЗАБОЛЕВАНИЯ И ОЦЕНКА ПРОЦЕССА ЛЕЧЕНИЯ СЕПСИСА, А ТАКЖЕ СРЕДСТВА ДЛЯ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ УКАЗАННОГО СПОСОБА


RU (11) 2137130 (13) C1

(51) 6 G01N33/53, G01N33/577, C12N15/16, C12P21/08 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
к патенту Российской Федерации 
Статус: по данным на 28.03.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 1999.09.10 
(21) Регистрационный номер заявки: 95108591/14 
(22) Дата подачи заявки: 1993.08.19 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 1993.08.19 
(31) Номер конвенционной заявки: P 4227454.0 
(32) Дата подачи конвенционной заявки: 1992.08.19 
(33) Страна приоритета: DE 
(45) Опубликовано: 1999.09.10 
(56) Аналоги изобретения: 1. P.P. Ghillani et al Identification and Measurement of Calci-tonin Precursors in Serum of Patients with Malignant Diseases. Cancer Research, 1989, vol. 49, pp. 6845-6851. 2. G.Pilz, S.Fateh-Moghadem et al Krankenplege-Journal, 1991, 29, pp. 483-492. 3. Оперативная гинекология./Под ред. Кулакова В.И. -М.: Медицина, 1990, с. 356-360. 
(71) Имя заявителя: Б.Р.А.Х.М.С. Диагностика ГмбХ (DE) 
(72) Имя изобретателя: Клод Бохуон (FR) 
(73) Имя патентообладателя: Б.Р.А.Х.М.С. Диагностика ГмбХ (DE) 
(85) Дата соответствия ст.22/39 PCT: 17.03.95 
(86) Номер и дата международной или региональной заявки: EP 93/02245 (19.08.93) 
(87) Номер и дата международной или региональной публикации: WO 94/04927 (03.03.94) 
(98) Адрес для переписки: 101000, Москва, Малый Златоустинский пер., д.10, кв.15, Патентному поверенному Веселицкой И.А. 

(54) СПОСОБ РАННЕГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТЯЖЕСТИ ЗАБОЛЕВАНИЯ И ОЦЕНКА ПРОЦЕССА ЛЕЧЕНИЯ СЕПСИСА, А ТАКЖЕ СРЕДСТВА ДЛЯ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ УКАЗАННОГО СПОСОБА 

Способ может быть использован в области медицины, в частности для раннего выявления сепсиса. Определяют содержание пептидного прокальцитонина и/или образующегося из него неполного пептида, который не является созревшим кальцитонином, причем определяемое присутствие и количество определенного пептида является показателем наличия сепсиса, его тяжести и/или успеха терапевтического лечения. Определение проводят посредством иммунометрического анализа, в котором используется по меньшей мере два моноклональных антитела или комбинации первого моноклонального или поликлонального антитела со вторым моноклональным антителом, которые обладают специфичностью прокальцитонина или образующихся из него пептидов. Данные антитела входят в комплект средств для обнаружения прокальцитонина в количествах от 0,1 до 500 нг/мл образца сыворотки или плазмы. Способ обеспечивает повышение точности постановки диагноза сепсис и на более раннем этапе его развития. 2 с. и 12 з.п. ф-лы, 2 табл. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Настоящее изобретение относится к способу диагноза сепсиса, в частности к раннему выявлению и выявлению тяжести сепсиса, а также к осуществляемому в ходе лечения и обследования терапевтическому эффекту лечения сепсиса, которое основывается на том, что определенный уже известный пептид и возможно некоторые его фрагменты являются надежными биологическими маркерами заболеваний данного типа, обнаруживаемыми в высоких концентрациях, и они могут быть относительно просто определены классическими методами обнаружения.

Согласно последним представлениям о данном заболевании, понятие "сепсис", используемое в данном описании, заключает в себе клинические картины, при которых, как правило, наблюдаются лихорадочное состояние, лейкоцитоз, изменения сознания, гипердинамическая циркуляция ("тепловой удар") и гиперметаболическое состояние, главным образом вследствие инвазии должным образом стерилизованной ткани микроорганизмами, и в то же время положительное обнаружение патогенных микроорганизмов в крови, которое ранее рассматривалось как характерное для сепсиса, становится менее важным для диагноза "сепсис". Показано, что при проведении клинических исследований прогноз болезни у пациентов, имеющих сепсис, не зависит от силы инфекции, в частности, бактериальной инфекции, а зависит от силы септической реакции организма (см. G.Pilz, S.Fateh-Moghadem и K.Werdan в Krankenpflege-Journal 29 (1991), стр. 483-492 и приведенные в статье публикации). Соответственно наряду с анализом положительных кровяных культур или вместо них для определения сепсиса определяются различные лабораторные параметры и гемодинамические параметры, и эти параметры принимаются в расчет для постановки диагноза и определения течения болезни, если необходимо, с использованием оснащенных компьютером так называемых систем балльной оценки, таких как APACHE (Acute Physiology end Chronic Health Evalution) II Score, описанных в указанной выше публикации. Однако пока еще не известно ни одного индивидуального параметра, пригодного в качестве надежного биологического маркера, определение которого высоко экспрессивно для диагноза сепсиса. Все параметры, используемые до настоящего времени, либо имеют недостаточную специфичность, либо не позволяют надежно оценить тяжесть сепсиса, либо не позволяют проводить терапевтическое обследование, и, кроме этого, определение, например, фактора опухолевого некроза (TNF) или интерлейкинов, таких как интерлейкин 6 (IL-6), слишком сложно, дорогостояще и/или требует больших затрат времени при анализе лежачих больных.

Ввиду этого все еще существует необходимость в надежном биологическом маркере, который может быть относительно легко определен и качественное и, в частности, количественное определение которого высоко показательно для постановки диагноза и оценки прогрессирования сепсиса.

Предметом настоящего изобретения является способ раннего выявления и выявления тяжести сепсиса, в котором определяется биологический маркер таким путем, который практически осуществим в клинических условиях, определение которого дает в высокой степени надежные результаты для постановки диагноза и оценки прогрессирования сепсиса.

Для решения этой задачи служит способ и средства в соответствии с формулой изобретения. Данное изобретение основано на открытии того факта, что пептидный прокальцитонин как таковой и при необходимости некоторые высокомолекулярные продукты его разложения представляют собой в высшей степени пригодные биологические маркеры сепсиса, и основано на том, что их концентрации в образцах биологических жидкостей пациентов позволяют сделать довольно точные заключения о тяжести септического заболевания и, таким образом, они являются важными параметрами для оценки прогрессирования заболевания и терапевтического обследования сепсиса.

Таким образом, возможность диагноза сепсиса путем определения пептидного прокальцитонина представляет собой огромный практический интерес, поскольку другие известные возможные биологические маркеры, обнаруживаемые при сепсисе, например, некоторые цитокины (интерлейкины, TNF), представляют собой нестабильные молекулы, которые обычно присутствуют в очень небольших концентрациях, так что их определение слишком сложно, требует больших затрат времени и ввиду этого слишком дорого для диагноза у лежачих больных. Согласно настоящему изобретению может быть определено, что является неожиданным по отношению к известным ранее медицинским знаниям, содержание прокальцитонина является чрезвычайно высоким при сепсисе, так что обнаруживают концентрации в диапазоне нг (более 1 нг, в частности, более 10 нг до 500 нг и более на мл образца сыворотки или плазмы), в то время как у здоровых людей, у которых прокальцитонин определяют лучшими известными способами, содержание прокальцитонина не обнаруживается (концентрации менее 0,1 нг/мл образца). В то же время при сепсисе при осуществлении способа по настоящему изобретению повышенных концентраций кальцитонина не обнаруживается, что составляет отличие от того, что до настоящего времени, как правило, прокальцитонин рассматривался как предшественник кальцитонина, наличие которого также приводит в образованию кальцитонина.

Пептидный прокальцитонин, который должен быть определен способом по изобретению, и, возможно, наличие продуктов его протеолитического расщепления, уже известны, и способы определения, пригодные для количественного и качественного иммунодиагностического анализа, также известны.

Прокальцитонин является пептидом, состоящим из 116 аминокислот, и до настоящего времени о нем было известно, что он появляется как промежуточный продукт трансляции/экспрессии определенного гена (CALC-1), приводящего к образованию пептидного гормонального кальцитонина в большинстве тканей, в частности в C-клетках щитовидной железы и в опухолевых тканях, как предшественника кальцитонина с этим исходным геном (CALC- 1), не считая образования прокальцитонина, также регулирующего образование связанного с прокальцитонином-геном пептида, и значительно отличного от него по длине и последовательности аминокислот 51-116 прокальцитонина (см. J.Biol.Chem., 261, 31(1986), стр. 14386-14391).

Согласно общеизвестным сведениям, прокальцитонин является продуктом протеолитического разложения основного протеинового прокальцитонина, образованного определенным типом генной экспрессии гена CALC-1, и в известных случаях его появления, как правило, он претерпевает дальнейшее поэтапное разложение в процессе высвобождения созревшего кальцитонина, который соответствует последовательности 32 аминокислот (аминокислоты 60-81 прокальцитонина). В ходе данного процесса сначала наряду с другими образуются два более крупных пептида, которые могут быть названы N-прокальцитонин-(1-57)-пептидом и C-прокальцитонин-(60- 116)-пептидом, причем последний дополнительно расщепляется до образования гормонального кальцитонина и до пептида, известного как катакальцин (Biochem J. , 256, (1988), 245-250; и Cancer Research 49 (1989), 6845-6851). Из публикации, помещенной в J. Biol. Chem., 226, 36, стр. 24627-24631, известно, что кроме прокальцитонина, описанного в указанных выше публикациях, в человеческих C-клетках щитовидной железы образуется также разновидность прокальцитонина, отличающаяся от первого прокальцитонина последними восемью аминокислотами C-окончания. Кроме того, данный пептид следует рассматривать как "прокальцитонин" в соответствии с настоящим изобретением, поскольку в данное время способы иммунодиагностического анализа, используемые при разработке настоящего изобретения, не позволяют выявить различие между этими двумя прокальцитонинами и возможными другими близко связанными с ними пептидами. Следовательно, "прокальцитонин" в соответствии с настоящим изобретением означает один или множество пептидов, включая известный молекулярный прокальцитонин, его описанную выше разновидность, имеющую отличный от него аминокислотный состав в C-окончании, и, возможно, другие существующие разновидности с сопоставимой реакционной способностью в методах избирательного иммунодиагностического анализа, используемых для их определения, в частности, в моноклональном иммунорадиометрическом анализе, описанном ниже со ссылкой на публикацию в Cancer Res. 49 (1989), 6845-6851.

Все эти пептиды заключают в себе пептидные последовательности из 57 аминокислот или более, в частности 116 аминокислот типа полного прокальцитонина, и соответствуют известной последовательности или представляют собой его неполную последовательность с отклонениями в области аминокислот, которые соответствуют аминокислотам 108-116 возможного прокальцитонина.

Что касается сделанных ранее попыток использовать метод обнаружения кальцитонина и родственных ему пептидов для диагностических целей, то известно, что кальцитонин является ценным биологическим маркером (опухолевым маркером) для многочисленных злокачественных заболеваний, и уже разработано множество методов иммунодиагностического анализа для специфического определения кальцитонина, и эти методы осуществляются с использованием специфических моноклональных антител (см., например, Clinica Chimica Acta, (1988), 174, стр. 35-54; Immunolo, т. 141, стр. 3156-3163; J.Endocr. (1988), 119. стр. 351-357).

Кроме того, для определения кальцитониновых предшественников, таких как прокальцитонин и C-прокальцитонин-(60-119)-пептид, уже разработан способ иммунодиагностического определения, который осуществляется в соответствии с принципом иммунорадиометрического анализа (IRMA) и который позволяет кроме кальцитонина избирательно определять прокальцитонин, в котором используется пара моноклональных антител, одно из которых является специфическим для внешних зон кальцитониновой последовательности (аминокислоты 1-11 катакальцина или аминокислоты 96-107 прокальцитонина), и который используется, например, в иммобилизированной форме для экстракции пептидов из анализируемого образца, содержащего данную последовательность, в то время как второе маркированное моноклональное антитело, используемое для формирования структуры "сэндвич" IRMA, является специфическим для участка, соответствующего аминокислотам 11-17 кальцитонина (аминокислотам 70- 76 прокальцитонина). Таким образом, в данном иммунологическом анализе обнаруживаются лишь те пептиды, которые заключают в себе кальцитониновые участки, а также аминокислоты 1-11 катакальцинового участка, и, таким образом, представляют собой либо полный прокальцитонин, либо пептид с указанными образованными от него участками, такой как C-прокальцитонин-(60-116)-пептид (см. Cancer Res., 49 (1989), стр. 6845-6851). Из множества доступных моноклональных антител известным способом отбираются те, которые имеют константы ассоциации в пределах К =0,9-3,01010 М-1. Этот известный способ может использоваться для непосредственного осуществления способа по настоящему изобретению или с использованием аналогичных моноклональных антител, которые могут быть получены согласно описанию в J. lmmunol., т. 141, N 9 (1988), стр. 3156-3163, в котором для определения увеличения прокальцитонина в качестве наиболее ясного и легкого пути оценки для клинических целей должны использоваться пары антител, имеющих аналогичное высокое сродство, как описано выше.

Так, например, пары моноклональных антител, используемых для осуществления способа по настоящему изобретению, могут быть получены путем использования CT-TT (Кальцитонин-Тетанустоксоида) в качестве иммуногена согласно описанным ранее процедурам иммунизации (Motte и др., J.lmmunol., 138 (1987), 3332) для получения антител, имеющих характеристики связывания, аналогичные характеристикам связывания CT21. Антитела, имеющие характеристики, аналогичные характеристикам КC01, могут быть получены путем иммунизации мышей Биоззи с линиями клеток с выраженными антителпродуцирующими свойствами (Biozzi и др., J.Exp. Med., 132 (1970), 152) с КС-ТТ (Катакальцин-Тетанустоксоидом), в результате чего согласно описанной процедуре используются четыре инъекции, состоящие каждая из 15 мкг пептидов, вводимых различными путями: подкожно в полном адьюванте Фрейнда (FCA); подкожно в неполном адьюванте Фрейнда (FIA); внутрибрюшинно в FIA и внутривенно в 0,15 моль/л хлорида натрия. Интервал иммунизации составляет от 13 до 30 недель. Через три дня после последней внутривенной инъекции коньюгата мышей умерщвляют, удаляют селезенку и спленоциты сливают с клеточной линией мышиной миеломы NSI с использованием 40%-ного полиэтиленгликоля (Bellet и др., J.Clin. Endocrinol. 10 Metab., 56 (1983), 530). Всплывшие гибридомы могут отбираться для продуцирования специфического антитела путем ферментного иммуносорбционного анализа (ELISA). После клонирования путем лимитирующего разбавления гибридомные клетки внутрибрюшинно имплантируют бесшерстным мышам BALB/c (nu/nu), и образующиеся асцитные жидкости собирают по прошествии 10-14 дней. Моноклональные антитела могут быть очищены от асцитных жидкостей путем осаждения с использованием 50%-ного сульфата аммония при температуре 4oC и хроматографии протеина A, как описано в публикации Manil и др. (J.lmmunol. Methods 90 (1986), 25). Коньюгаты гаптен-носителя CT-TT или KC-TT могут быть получены путем раздельного связывания CT или KC с TT путем использования глутарового альдегида в качестве связывающего реагента (Audibert и др., Proc. Natl. Acad Sci., США, 79 (1982), 5042).

Для определений, описанных в нижеследующих примерах, использовалась пара моноклональных антител, которая включала указанное выше антитело mAbKC01 и антитело mAbCT21, с антителом mAbCT21 в отношении его связывания с молекулой прокальцитонина, а также в отношении его сродства, очень близкого в антителу mAbCT08, описанному в указанной выше публикации (константа ассоциации Кasn = 3,01010 М-1). Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела KC01 и CT21, были депонированы в "DSM - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH", Nascheroderweg IB, 38124 Брауншвейг, Германия) согласно постановлению Будапештского договора, под официальными номерами DSMACC2124 и DSMACC2125, соответственно; дата депонирования 20 апреля 1993 года.

Описанный способ в соответствии с публикацией в Canser Res., 49 (1989), стр. 6845-6851, позволяет получить концентрации прокальцитонина или C-прокальцитонин-(60-119)-пептида или их обоих в образцах, или если стабилизации обоих пептидов сопоставимы, показатель общей начальной концентрации прокальцитонина в образце. Что касается способов, которые могут использоваться для определения прокальцитонина по изобретению, то подробности изложены в указанной выше публикации и в приведенных в ней публикациях, которые включены в настоящее описание в качестве ссылочных материалов для дополнения.

Как описано в указанной выше публикации, была сделана попытка определения прокальцитонина для того, чтобы проверить пригодность маркера опухоли. Было установлено, что у пациентов с опухолью наблюдается картина параллельного изменения концентраций прокальцитонина и кальцитонина, на основании чего было сделано заключение, что оба они образуются от неопластических C-клеток в щитовидной железе. В указанной выше публикации говорится также, что концентрации прокальцитонина увеличиваются также у пациентов, не страдающих злокачественными заболеваниями, но страдающих серьезными вирусными инфекциями. В этих случаях не наблюдалось одновременного увеличения концентраций кальцитонина. Эти пациенты не имели сепсиса и их заболевания не имели никакого отношения к сепсису.

После того, как согласно настоящему изобретению было впервые установлено, что существует непосредственная связь между концентрациями прокальцитонина и наличием и тяжестью сепсиса, были сделаны дополнительные попытки выявить причину увеличения концентрации прокальцитонина без одновременного увеличения концентрации кальцитонина при сепсисе, а также увеличения этой концентрации в явно меньшей степени, что позволяет большей частью непосредственно отличить эти случаи от сепсиса у пациентов, страдающих от серьезных вирусных заболеваний. Поскольку у одного пациента, с сепсисом, который подвергался тироидектомии, можно было обнаружить тем не менее увеличение концентрации прокальцитонина до концентрации, являющейся значительной при сепсисе, то очевидно, что при сепсисе прокальцитонин не образуется в щитовидной железе, и что за это отвечает другой орган. Если в связи с увеличенной концентрацией прокальцитонина при вирусном гепатите предположить, что указанным другим органом является печень, то указанное увеличение концентрации прокальцитонина можно объяснить в первом случае прямым воздействием вирусного заболевания на гепатоциты и в другом случае непрямым, но более эффективным воздействием эндотоксинов, продуцированных бактериями, ответственными за сепсис, на те же гепатоциты. Однако следует иметь в виду, что это объяснение является рабочей гипотезой, но не теорией, доказанной экспериментально.

Появление повышенных концентраций прокальцитонина при серьезных вирусных заболеваниях является эффектом, играющим большую роль в способе диагноза сепсиса по изобретению, так, что если концентрации прокальцитонина увеличены лишь до относительно небольшой степени, вплоть до таких значений, которые могут обнаруживаться также в случае серьезных вирусных заболеваний, то такие вирусные заболевания должны быть исключены до постановки диагноза сепсиса.

Кроме того, у пациентов с хронической почечной недостаточностью и, следовательно, с нарушенной экскрецией пептида должны быть повышены концентрации пептидов типа прокальцитонина, но это повышение клинически не является тем же самым, что и в случае повышения у пациентов, не имеющих этого заболевания. Однако врач, ставящий клинический диагноз, может легко принять в расчет эти обстоятельства.

Настоящее изобретение не ограничивается использованием указанного выше специфического способа анализа для обнаружения прокальцитонина, но заключает в себе и другие способы обнаружения, которые уже известны, к которым относятся способы, где используются другие моноклональные или поликлональные антитела, например способы, осуществляемые с использованием специфичности на N-прокальцитонин-(1-57)-пептид и, в частности, аминокислоты 51-57. Таким образом, для общего использования поликлональных антител к зонам N-прокальцитонин-(1-57)-пептида вместо mAbKC01 30 наряду с маркированным моноклональным антителом, связанным с зоной кальцитонина прокальцитонина, используемого в описанном способе, можно показать, что в обоих случаях достигаются аналогичные концентрации прокальцитонина, и, исходя из факта, что если используются указанные поликлональные антитела, то обнаруженные зоны присутствуют в пределах одной молекулы только в случае не подвергнутого воздействию прокальцитонинового пептида, это подтверждает то заключение, что при сепсисе концентрации не подвергнутого воздействию прокальцитонина действительно повышены и образующиеся его неполные пептиды в большинстве случаев играют вторичную роль.

Способ по изобретению в принципе может осуществляться также путем определения прокальцитонина иным путем, чем иммунодиагностический, например путем жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД), если эти способы обеспечивают достаточную чувствительность и если обеспечивается или может быть достигнута специфичность этих способов.

Более того, хотя определение прокальцитонина согласно изобретению осуществляется в настоящее время главным образом в образцах сыворотки или плазмы, способ по изобретению в принципе заключает в себя также определение прокальцитонина в других биологических жидкостях, таких как цельная кровь и моча, если оказывается, что и в этих жидкостях концентрации прокальцитонина могут быть измерены воспроизводимым образом.

Что касается известного уровня техники, дополнительно следует указать, что в Surgery, том 108, 6 (1990), стр. 1097-1101, сообщается о том, что у пациентов, страдающих сепсисом, концентрация в плазме пептида CGRP, которая связана с кальцитонином, слегка повышена в диапазоне пикограммов (пг) (14,9+3,2 пг/мл по сравнению с 2,0+0,3 пг/мл у контрольных пациентов). Эти открытия не позволяют сделать заключение о концентрациях других родственных пептидов, и значительно более низкие абсолютные концентрации и значительно более низкие относительные увеличения при сепсисе по сравнению с нормальной концентрацией относительно увеличения концентрации в способе по изобретению подтверждают, что определение CGRP как маркера сепсиса не может быть использовано.

Кроме того, в публикации Lancet, 1, (1983), стр. 294, сообщается, что в случае серьезной менингококкиемии у детей наблюдаемые концентрации кальцитонина повышены в два-три раза, однако в следующей публикации в Rediatr. Res. , 18. (1984), стр. 811 было исправлено, что определяемое вещество, по всей вероятности, не является не подвергнутым воздействию кальцитонином, но не было никаких указаний на то, что это вещество фактически определено. Наблюдаемое увеличение вплоть до примерно трехкратного значения от нормального показателя в описанных случаях сравнивали с увеличением прокальцитонина при осуществлении способа по изобретению в диапазоне 1000-кратного увеличения, что говорит о том, что указанные публикации не имеют отношения к настоящему изобретению.

Способ по изобретению далее описывается более подробно со ссылкой на клинические данные, являющиеся доказательством уместности изложенной информации.

Все определения прокальцитонина осуществлялись согласно способу определения прокальцитонина, описанному в Cancer Res., 49, (1989), стр. 6845-6851, с использованием моноклональных антител KC01 (DSM ACC2124) и CT21 (DSM ACC2125) (см. выше).

Данные примеры иллюстрируют настоящее изобретение, но их не следует рассматривать как ограничение изобретения.

Пример 1. Определение концентраций прокальцитонина у госпитализированных детей с различными заболеваниями.

Определяли концентрации прокальцитонина у различных групп госпитализированных детей с различными заболеваниями.

Результаты приведены в табл. 1 (см. табл. 1 и 2 в конце описания).

Из полученных данных видно, что у пациентов с сепсисом обнаруживается вплоть до 180 нг/мл pCT (концентрация прокальцитонина), в то время как у пациентов с "обычными" вирусными заболеваниями концентрация pCT увеличивается лишь до 2 мг/мл, для случаев чрезвычайно тяжелых вирусных заболеваний кишечника и печени эти показатели повышаются до 16 нг/мл и в одном случае до 35 нг/мл.

Пример 2. Связь концентраций pCT у пациентов с сепсисом, у которых одновременно наблюдали за ходом протекания болезни согласно оценке APACHE II Score, с тяжестью заболевания.

У 20 пациентов, которых подвергали лечению путем внутривенного вливания Pseudomonas-IgG для лечения сепсиса после сердечных операций, наблюдали концентрацию pCT в течение пяти дней и одновременно наблюдали за состоянием больного согласно методу APACHE II Score. Результаты приведены в табл. 2.

Из данных табл. 2 видно, что в случае реакции на успешно осуществляемое лечение сепсиса (чувствительность к воздействию) концентрации pCT снижаются с улучшением клинического состояния, в то время как эти концентрации pCT остаются практически неизменно высокими в случае отсутствия ответной реакции (не чувствительность к воздействию) на лечение. Из этой таблицы видно также, что в случае нечувствительности к лечению исходные концентрации pCT значительно выше, чем в случае чувствительности к лечению, и, таким образом, тяжесть заболевания в первом случае больше. В сравнении с данными, полученными при оценке методом APACHE II Score данные значения pCT показывают существенные различия сепсиса по тяжести заболевания, что также подтверждается показателями летальности.

Кроме того, эти результаты показывают, что проводимые в ходе лечения сепсиса определения концентрации pCT на ранней стадии дают надежную информацию об успешном ходе лечения, так что если необходимо, то возможно раннее заключение относительно изменения хода выбранного лечения, например выбор другого антибиотического препарата.

Аналогичные результаты могут быть получены у пациентов с ожогом, у которых развивается сепсис вследствие кожных трансплантаций, которые подвергались лечению различными антибиотическими препаратами. Успешное лечение всегда сопровождается значительным снижением концентрации pCT, и в одном случае можно на ранней стадии откорректировать нечувствительность к первому лечению первым антибиотическим препаратом, который может быть определен, поскольку концентрации pCT остаются постоянными, путем замены антибиотического препарата с ответной реакцией на второй антибиотический препарат, пригодность которого основана на том, что концентрация pCT мгновенно снижается. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



1. Способ определения состояния сепсисного заболевания, отличающийся тем, что в образце биологической жидкости пациента определяют содержание пептидного прокальцитонина и/или образующегося из него неполного пептида, который не является созревшим кальцитонином, причем определяемое присутствие и количество определенного пептида является показателем наличия сепсиса, его тяжести и/или успеха терапевтического лечения.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что определяют прокальцитонин и/или N-прокальцитонин-(1-57)-пептид и/или С-прокальцитонин-(60-116)-пептиды.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что при осуществлении иммунодиагностического способа обнаруживают соответствующий пептид или пептиды путем использования моноклонального антитела или комбинации первого моноклонального или поликлонального антитела со вторым моноклональным антителом, которые как таковые или в комбинации друг с другом обладают специфичностью прокальцитонина или образующихся из него пептидов, и которые позволяют сделать дифференциацию между ними и зрелым кальцитонином и пептидом CGRP.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что прокальцитонин определяют посредством иммунометрического анализа, в котором используется по меньшей мере два моноклональных антитела, первое моноклональное антитело для экстракции прокальцитонина из анализируемого образца, а второе для индикации, причем указанные антитела обладают специфичностью по отношению к разным участкам аминокислотной последовательности прокальцитонина, так что возможна дифференциация между прокальцитонином и продуктами его протеолитического расщепления.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что для экстракции прокальцитонина из анализируемого образца используют дополнительное антитело, которое обладает специфичностью по отношению к другому соседнему участку аминокислотной последовательности прокальцитонина по сравнению с первым моноклональным антителом.

6. Способ по любому из пп. 3-5, отличающийся тем что прокальцитонин обнаруживают путем иммунометрического анализа, который избирательно обнаруживает полный прокальцитонин и/или С-прокальцитонин-(60-116)-пептид.

7. Способ по любому из пп. 3-5, отличающийся тем, что прокальцитонин обнаруживают путем иммунометрического анализа, который избирательно обнаруживает полный прокальцитонин и/или N-прокальцитонин-(1-57)-пептид.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что содержания прокальцитонина более чем 1 нг/мл образца являются показательными для возможного наличия сепсиса, и тем, что содержания прокальцитонина в пределах от 10 нг/мл до 500 нг/мл и более связаны с увеличивающейся тяжестью сепсиса и ухудшенным прогнозом.

9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что одновременно в параллельном анализе обнаруживают содержание кальцитонина и тем, что отсутствие доказательства повышенных содержаний кальцитонина позволяет поставить диагноз сепсиса.

10. Способ по п. 8 или 9, отличающийся тем, что содержания прокальцитонина в пределах примерно до 20 нг/мл позволяют поставить диагноз сепсиса, если может быть исключено наличие серьезных вирусных заболеваний, как причины повышенной концентрации прокальцитонина.

11. Способ по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что образец сыворотки или плазмы используют как образец биологической жидкости.

12. Способ по любому из пп. 1-11, отличающийся тем, что моноклональное антитело представляет собой моноклональное антитело КС01 (DSM АСС2124) или антитело СТ21 (DSM АСС 2125).

13. Комплект средств для осуществления способа по любому из пп. 1-12, отличающийся тем, что для обнаружения прокальцитонина в количестве от 0,1 до 500 нг/мл образца сыворотки или плазмы данные средства включают: одно (или множество) иммобилизованное (иммобилизованных) первое моноклональное или поликлональное антитело (или моноклональных или поликлональных антител) на носителе для связывания прокальцитонина в образце; дополнительное моноклональное антитело, несущее маркер и связывающее прокальцитонин в области, которая отлична от связывающей области первого антитела (или первых антител); и общие вспомогательные средства.

14. Комплект средств по п.13, в котором первое или дополнительное моноклональное антитело представляет собой антитело КС01 (DSM АСС2124) или антитело СТ21 (DSM АСС2125) соответственно.