—ѕќ—ќЅ Ћ≈„≈Ќ»я √≈Ќ≈–јЋ»«ќ¬јЌЌџ’ »Ќ‘≈ ÷»…, ¬џ«џ¬ј≈ћџ’ Ѕј “≈–»яћ», »Ћ» «јЅќЋ≈¬јЌ»…, ¬џ«џ¬ј≈ћџ’ √–»Ѕјћ» » ѕ–ќ—“≈…Ў»ћ», »Ћ» ј“≈–ќ— Ћ≈–ќ«ј, »Ћ» —ј’ј–Ќќ√ќ ƒ»јЅ≈“ј, »Ћ» «јЅќЋ≈¬јЌ»…, —¬я«јЌЌџ’ — –≈ј ÷»≈… √»ѕ≈–„”¬—“¬»“≈Ћ№Ќќ—“» «јћ≈ƒЋ≈ЌЌќ√ќ “»ѕј, »Ћ» «јЅќЋ≈¬јЌ»…, ќЅ”—Ћќ¬Ћ≈ЌЌџ’ ћ”“ј÷»яћ» √≈Ќќ¬ —ќћј“»„≈— »’  Ћ≈“ќ 

—ѕќ—ќЅ Ћ≈„≈Ќ»я √≈Ќ≈–јЋ»«ќ¬јЌЌџ’ »Ќ‘≈ ÷»…, ¬џ«џ¬ј≈ћџ’ Ѕј “≈–»яћ», »Ћ» «јЅќЋ≈¬јЌ»…, ¬џ«џ¬ј≈ћџ’ √–»Ѕјћ» » ѕ–ќ—“≈…Ў»ћ», »Ћ» ј“≈–ќ— Ћ≈–ќ«ј, »Ћ» —ј’ј–Ќќ√ќ ƒ»јЅ≈“ј, »Ћ» «јЅќЋ≈¬јЌ»…, —¬я«јЌЌџ’ — –≈ј ÷»≈… √»ѕ≈–„”¬—“¬»“≈Ћ№Ќќ—“» «јћ≈ƒЋ≈ЌЌќ√ќ “»ѕј, »Ћ» «јЅќЋ≈¬јЌ»…, ќЅ”—Ћќ¬Ћ≈ЌЌџ’ ћ”“ј÷»яћ» √≈Ќќ¬ —ќћј“»„≈— »’  Ћ≈“ќ 


RU (11) 2269358 (13) C2

(51) ћѕ 
A61K 38/47 (2006.01)
A61K 38/50 (2006.01)
A61P 3/10 (2006.01)
A61P 9/10 (2006.01)
A61P 31/00 (2006.01) 

(12) ќѕ»—јЌ»≈ »«ќЅ–≈“≈Ќ»я   ѕј“≈Ќ“” –ќ——»…— ќ… ‘≈ƒ≈–ј÷»» 
—татус: по данным на 10.08.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

ƒокумент: ¬ формате PDF 
(14) ƒата публикации: 2006.02.10 
(21) –егистрационный номер за€вки: 2004108057/14 
(22) ƒата подачи за€вки: 2004.03.12 
(24) ƒата начала отсчета срока действи€ патента: 2004.03.12 
(43) ƒата публикации за€вки: 2005.09.27 
(45) ќпубликовано: 2006.02.10 
(56) јналоги изобретени€: US 5484589, 16.01.1996. MERKUS P.J. et al. DNase treatment for atelectasis in infants with severe respiratiry syncytial virus bronchiolitis. Eur. Respir. J., 2001 Oct; 18(4): 734-7. SIMPSON G. et al Successful treatment of empyema thoracis with human recombinant deoxyribonuclease. Thorax. 2003 Apr; 58(4): 365-6. MUTIRANGURA A. Serum / plasma viral
DNA: mechanisms and diagnostic applications to nasopharyngeal and cervical carcinoma. Ann. N Y Acad. Sci. 2001. Sep; 945: 59-67. LACHMANN P.J. Lupus and Desoxyribonuclease. Lupus, 2003; 12(3): 202-6.  јѕ–»Ќ ј.ƒ. и др. ѕрогноз и лечение больных поверхностным раком мочевого пузыр€ высокой степени риска. ¬ысокие технологии в онкологии. –остов-на-ƒону, 2000, т.3, с.149-150. 

(72) »м€ изобретател€: √енкин ƒмитрий ƒмитриевич (RU); “ец ¬иктор ¬ениаминович (RU); “ец √еоргий ¬икторович (RU) 
(73) »м€ патентообладател€: √енкин ƒмитрий ƒмитриевич (RU); “ец ¬иктор ¬ениаминович (RU) 
(98) јдрес дл€ переписки: 191040, —анкт-ѕетербург, а/€ 40, пат.пов. ќ.Ћ.—андигурскому 

(54) —ѕќ—ќЅ Ћ≈„≈Ќ»я √≈Ќ≈–јЋ»«ќ¬јЌЌџ’ »Ќ‘≈ ÷»…, ¬џ«џ¬ј≈ћџ’ Ѕј “≈–»яћ», »Ћ» «јЅќЋ≈¬јЌ»…, ¬џ«џ¬ј≈ћџ’ √–»Ѕјћ» » ѕ–ќ—“≈…Ў»ћ», »Ћ» ј“≈–ќ— Ћ≈–ќ«ј, »Ћ» —ј’ј–Ќќ√ќ ƒ»јЅ≈“ј, »Ћ» «јЅќЋ≈¬јЌ»…, —¬я«јЌЌџ’ — –≈ј ÷»≈… √»ѕ≈–„”¬—“¬»“≈Ћ№Ќќ—“» «јћ≈ƒЋ≈ЌЌќ√ќ “»ѕј, »Ћ» «јЅќЋ≈¬јЌ»…, ќЅ”—Ћќ¬Ћ≈ЌЌџ’ ћ”“ј÷»яћ» √≈Ќќ¬ —ќћј“»„≈— »’  Ћ≈“ќ 
»зобретение относитс€ к медицине и ветеринарии и может быть использовано дл€ лечени€ заболеваний, сопровождающихс€ изменени€ми внеклеточной ƒЌ  крови, а именно: генерализованных инфекционных заболеваний, вызываемых бактери€ми, или заболеваний, вызываемых грибами и простейшими, или атеросклероза, или сахарного диабета, или заболеваний, св€занных с реакцией гиперчувствительности замедленного типа, а также заболеваний, обусловленных мутаци€ми генов соматических клеток. ƒл€ этого в кровь ввод€т агент, разрушающий внеклеточную ƒЌ  крови. ¬ качестве такого агента используют ƒЌ азу, в частности, в дозах, обеспечивающих изменение электрофоретического профил€ внеклеточной ƒЌ  крови, вы€вл€емое пульс-гельэлектрофорезом. ƒЌ азу можно вводить в дозах и режимах, обеспечивающих превышение уровн€ ƒЌ -гидролитической активности плазмы крови, 150 единиц  унца на литр плазмы, на прот€жении суммарно более 12 часов в сутки. —пособ обеспечивает эффективное лечение указанных заболеваний при отсутствии побочных эффектов. 3 з.п. ф-лы, 14 табл., 5 ил. 




ќѕ»—јЌ»≈ »«ќЅ–≈“≈Ќ»я


»зобретение относитс€ к медицине и ветеринарии и может быть использовано дл€ лечени€ заболеваний, сопровождающихс€ качественными или количественными изменени€ми внеклеточной ƒЌ  крови, а именно: генерализованных инфекционных заболеваний, вызываемых бактери€ми, или заболеваний, вызываемых грибами и простейшими, или атеросклероза, или сахарного диабета, или заболеваний, св€занных с реакцией гиперчувствительности замедленного типа, а также заболеваний, обусловленных мутаци€ми генов соматических клеток.

ѕеречисленные заболевани€ согласно современным знани€м представл€ют собой крайне неоднородные и различающиес€ между собой по этиологии и патогенезу болезненные процессы. ¬ соответствии с этими представлени€ми и лечение этих заболеваний осуществл€лось совершенно различными методами. “ак, основным способом лечени€ заболеваний, вызываемых бактери€ми, грибами и простейшими, €вл€етс€ антибиотико- и химиотерапи€, см. Merck Manual of Diagnosis and Therapy; 16th Edition. 

ќсновным способом лекарственного лечени€ атеросклероза €вл€етс€ терапи€ препаратами группы статинов, подавл€ющих синтез холестерина в организме, см. New Concepts and Paradigms in Cardiovascular Medicine: The Noninvasive Management of Coronary Artery Disease, K. Lance Gould, THE AMERICAN JOURNAL OF MEDICINE, Volume 104, June 22, 1998, 2s-17s.

¬ основе лекарственного лечени€ сахарного диабета лежат три основных подхода - заместительна€ терапи€ препаратами инсулина, лекарственна€ терапи€, направленна€ на улучшение секреции инсулина поджелудочной железой, лекарственна€ терапи€, направленна€ на повышение чувствительности тканей к инсулину или ускорение утилизации ткан€ми глюкозы, см. Pharmacological Management of Diabetes: Recent Progress and Future Perspective in Daily Drug Treatment, Gerard Emilien et. al., Pharmacol. Ther. Vol.81, No.1, pp. 37-51, 1999.

¬ основе терапии аллергических заболеваний, св€занных с реакци€ми гиперчувствительности IV типа лежит иммуносупрессивна€ или иммуномодулирующа€ терапи€, см. Therapeutic Immunosupression, ed. A.W.Thomson, Ser. Immunology and Medicine, vol.29, Kluwer Acad. Publishers, Dordrecht, 2001. 

«аболевани€, развивающиес€ вследствие мутаций генов соматических клеток и сопровождающиес€ развитием соматического мозаицизма, вовсе не имеют средств этиологической терапии, осуществл€етс€ лишь симптоматическое лечение, см. Youssoufian H., Pyeritz RE. Mechanisms and Consequences of Somatic Mosaicism in Humans, Nature Reviews Genetics, 2002; 3: 748-758.

ќсновной проблемой антибиотикотерапии бактериальных инфекций считаетс€ проблема лекарственной резистентности. ÷иркул€ци€ резистентных к антибиотическим средствам штаммов бактерий и их новообразование в процессе лечени€ (например, вследствие формировани€ в организме больного биопленок) €вл€ютс€ основной причиной неэффективной терапии (The use and resistance to antibiotics in the community. Cizman M., Int J. Antimicrob Agents, 2003, Apr 21: pp.297-307. ќбщепризнано, что проблема антибиотикорезистентности микроорганизмов в насто€щее врем€ носит характер глобальной угрозы (Mechanisms of antimicrobial resistance: their clinical relevance in the new millennium. Sefton A.M., Drugs, 2002, vol.62: 557-66) и требует разработки новых антибиотических препаратов с оригинальными механизмами антибактериального воздействи€ и новых неантибиотических способов воздействи€ на инфекционный процесс. ¬ частности, при лечении инфекции, вызванной резистентными к пенициллиновым и цефалоспориновым антибиотикам граммположительными кокками, используетс€ антибиотик ¬анкомицин.   основным его недостаткам относ€тс€: рост количества ванкомицин-резистентных штаммов в циркул€ции; высока€ токсичность; относительно узкий спектр активности препарата (The threat of vancomycin resistance. PerlTM, Am J. Med. 1999, May, 106: 26S-37S).

¬ св€зи с перечисленным €вл€етс€ актуальной задача поиска метода антибактериальной терапии, эффективного, малотоксичного, активного в отношении широкого спектра бактерий, в том числе резистентных к антибиотическим препаратам.

ѕроблемы антибиотико- и химиотерапии инфекций, вызываемых грибами и простейшими, нос€т, в основном, тот же характер, что и проблемы антибиотикотерапии бактериальных инфекций; например, при лечении широко распространенным антигрибковым агентом амфотерицином (Antifungal drug resistance to azoles and polyenes. Mar Masia Canuto et. al., The Lancet Infectious Diseases, Volume 2, Issue 9, 1 September 2002, pages 550-563; A systematic review of the antifungal effectiveness and tolerability of amphotericin ¬ formulations, Jane P. Barrett et. al., Clinical Therapeutics, Volume 25, Issue 5, May 2003, pages 1295-1320).

јтеросклероз представл€ет собой системное заболевание, сопровождающеес€ формированием специфических атеросклеротических бл€шек в стенках крупных и средних артерий. ¬ зависимости от места по€влени€, стадии развити€ и величины атеросклеротических бл€шек заболевание имеет различные клинические про€влени€ (ишемическа€ болезнь сердца, инсульт и др.). Ћекарственному и хирургическому лечению подвергаютс€ именно про€влени€ системного атеросклероза на уровне того или иного органа. јтеросклероз как системное заболевание не имеет способов лекарственного лечени€. Ќаиболее распространенным способом профилактики, замедл€ющим прогрессирование заболевани€, €вл€етс€ терапи€ ингибиторами «-гидрокси-3-метилглютарил коэнзим A(HMGCoA) редуктазы (Ћовастатин, ѕарвастатин и др.), привод€ща€ к подавлению синтеза эндогенного холестерина и ускорению клиренса липопротеинов низкой плотности из плазмы крови, что замедл€ет развитие атеросклероза (New Concepts and Paradigms in Cardiovascular Medicine: The Noninvasive Management of Coronary Artery Disease, K. Lance Gould, THE AMERICAN JOURNAL OF MEDICINE, Volume 104, June 22, 1998, 2s-17s). Ќедостатками подобного лечени€ €вл€ютс€ серьезные побочные эффекты (A safety look at currently available statins., Moghadasian MH, Expert Opin Drug Saf 2002 Sep 1: pp.269-74) и ограниченна€ эффективность (Statins: balancing benefits, efficacy and safety, Clearfleld MB, Expert Opin Pharmacother, 2002, May 3: pp.469-77).

ќсновной причиной инвалидизации и смерти больных при сахарном диабете 1 и 2 типа €вл€ютс€ осложнени€, св€занные с развитием микро- и макроангиопатий. —читаетс€, что достижение эффективного метаболического контрол€ (поддержание нормального уровн€ глюкозы и гликозилированного гемоглобина в физиологических границах в течение длительного времени) преп€тствует развитию осложнений. »нсулинотерапи€, в том числе интенсивна€, €вл€етс€ методом выбора в ситуаци€х, когда не удаетс€ достичь метаболического контрол€ с помощью других лекарственных средств (Outpatient insulin therapy in type 1 and type 2 diabetes mellitus: scientific review., DeWitt DE, Hirsch IB, JAMA, 2003, May 289: pp.2254-64). ќднако даже при интенсивных режимах терапии риск развити€ осложнений, в том числе фатальных, остаетс€ высоким (Cause-specific mortality in a population with diabetes: South Tees Diabetes Mortality Study., Roper NA, et. al., Diabetes Care, 2002, Jan 25: pp.43-8). ¬ св€зи с перечисленным €вл€етс€ актуальной и общепризнанной задача поиска новых средств дл€ терапии сахарного диабета 1 и 2 типа, в том числе способных предупреждать развитие осложнений.

ќдним из наиболее широко примен€емых в клинической практике способов, примен€емых дл€ лечени€ состо€ний, св€занных с реакци€ми гиперчувствительности замедленного типа, €вл€етс€ введение пептида ÷иклоспорина A (Therapeutic Immunosupression, ed. A.W.Thomson, Ser. Immunology and Medicine vol.29, Kluwer Acad. Publishers, Dordrecht, 2001).   широко известным недостаткам этого способа относ€тс€ серьезные побочные эффекты - нефротоксичность, гипертензи€ и высокий риск развити€ инфекций (Cyclosporine: mechanisms of action and toxicity., Graham RM, Cleve Clin J. Med, 1994, Jul-Aug 61: pp.308-13). ƒругой проблемой €вл€етс€ потер€ эффективности при длительном применении препарата, что про€вл€етс€, например, в увеличении веро€тности отторжени€ трансплантанта (Renal transplantation, past, present and future, Ponticelli C, et. al., J. Nephrol, 1999, Jul-Aug 12 Suppi 2: S105-10).

“аким образом, дл€ лечени€ заболеваний, сопровождающихс€ изменени€ми качественного и/или количественного состава внеклеточной ƒЌ  крови, примен€етс€ широкий спектр различных способов, имеющих схожие недостатки: 

1. токсичность;

2. развитие побочных эффектов;

3. низка€ эффективность терапии.

ћежду тем, в реальной клинической практике рассматриваемые заболевани€ часто сопутствуют одно другому. “ак, например, терапи€ иммуносупрессивными препаратами при заболевани€х, св€занных с реакцией гиперчувствительности замедленного типа многократно повышает риск развити€ инфекционных заболеваний (Recent advances in the diagnosis and management of infection in the organ transplant recipient. Tolkoff-Rubin NE, Rubin RH; Semin Nephrol 2000 Mar 20: 148-63); атеросклероз €вл€етс€ частым осложнением диабета (Diabetes and atherosclerosis: epidemiology, pathophysiology, and management. Beckman JA, Creager MA, Libby P; JAMA 2002 May 287:2570-81), и при этом часто его развитию сопутствует системный инфекционный процесс (Infection and atherosclerosis: potential roles of pathogen burden and molecular mimicry., Epstein SE, Zhu J, Bumett MS, Zhou YF, Vercellotti G, Hajjar D, Arterioscler Thromb Vase Biol, 2000, Jun 20: 1417-20); р€д форм диабета развиваетс€ вследствие развити€ реакции гиперчувствительности замедленного типа (Evidence of islet cell autoimmunity in elderly patients with type 2 diabetes, Pietropaolo M, Barinas-Mitchell E, Pietropaolo SL, Kuller LH, Trucco M, Diabetes 2000 Jan 49:32-8), или на фоне инфекционного процесса (Systemic diseases caused by oral infection. Li X, Kolltveit KM, Tronstad L, Olsen I, Clin Microbiol Rev 2000 Oct 13: 547-58), и приводит к высокому риску развити€ инфекций (Diabetes and the risk of infection-related mortality in the U.S., Bertoni AG, Saydah S, Brancati FL, Diabetes Care, 2001, Jun 24:6 1044-9).

¬ насто€щее врем€ отсутствуют какие-либо способы, которые позвол€ли бы лечить указанные выше заболевани€ в комплексе. ¬ св€зи с этим отсутствует возможность прин€ть какое-либо известное техническое решение за прототип насто€щего изобретени€.

¬ основу насто€щего изобретени€ положено решение задачи создани€ высокоэффективного и малотоксичного способа лечени€ генерализованных инфекций, вызываемых бактери€ми, или заболеваний, вызываемых грибами и простейшими, или атеросклероза, или сахарного диабета, или заболеваний, св€занных с реакцией гиперчувствительности замедленного типа, или заболеваний, обусловленных мутаци€ми генов соматических клеток.

—огласно изобретению эта задача решаетс€ за счет того, что дл€ лечени€ указанных заболеваний в кровь ввод€т агент, разрушающий внеклеточную ƒЌ  крови; в качестве агента, разрушающего внеклеточную ƒЌ  крови, в системную циркул€цию крови может вводитьс€ фермент ƒЌ аза; фермент ƒЌ азу могут вводить в дозах, обеспечивающих изменение электрофоретического профил€ внеклеточной ƒЌ  крови, вы€вл€емое пульс-гельэлектрофорезом; фермент ƒЌ азу могут вводить в дозах и режимах, обеспечивающих уровень ƒЌ -гидролитической активности плазмы крови, измер€емый в плазме крови и превышающий 150 единиц  унца на литр плазмы, на прот€жении суммарно более 12 часов в сутки.

–азвитие указанных заболеваний сопровождаетс€ качественными и количественными изменени€ми внеклеточной ƒЌ  крови, однако в известных за€вителю источниках отсутствуют знани€ о генетическом репертуаре внеклеточной ƒЌ  крови больных при рассматриваемых заболевани€х, биологической роли внеклеточной ƒЌ  крови при рассматриваемых заболевани€х и возможном терапевтическом эффекте ее уничтожени€ дл€ лечени€ этих заболеваний.

 ак установили за€вители, внеклеточна€ ƒЌ  крови больных при рассматриваемых заболевани€х содержит уникальный по своему качественному и количественному составу репертуар генов и регул€торных генетических элементов, резко отличающийс€ от репертуара ƒЌ , описанного в геноме человека. ¬ отличие от внутриклеточной ƒЌ , внеклеточна€ ƒЌ  крови больных рассматриваемыми заболевани€ми содержит, в основном, уникальные гены человека. ”становлено наличие бактериальной внеклеточной ƒЌ  и внеклеточной ƒЌ  грибов в составе матрикса биопленок и в плазме крови инфицированного человека. 

”становлено, что внеклеточна€ ƒЌ  крови, включа€ внеклеточную ƒЌ  бактерий, грибов и паразитов при рассматриваемых заболевани€х способствует их развитию.

”становлено, что разрушение внеклеточной ƒЌ  крови при рассматриваемых заболевани€х приводит к лечебному эффекту.

”казанные выше новые свойства за€вленного изобретени€, базирующиес€ на принципиально новых представлени€х о роли внеклеточной ƒЌ  плазмы крови в развитии рассматриваемых заболеваний, позвол€ют сделать вывод о соответствии за€вленного способа критерию Ђизобретательский уровеньї.

«а€вленный способ реализуетс€ следующим образом. 

ћатериалы и методы.

»спользовали следующие агенты, разрушающие внеклеточную ƒЌ  крови: фермент бычью панкреатическую ƒЌ азу (производство Sigma и —амсон-ћед), фермент рекомбинантную человеческую ƒЌ азу I (производство Genetech), ƒЌ -гидролизующие антитела, выделенные из крови больных системной красной волчанкой по методике Shuster A.M (Shuster A.M. et. al., Science, v.256, 1992, рр.665-667).

ƒЌ  плазмы крови выдел€ли следующим образом: свежую (не более 3-4 часов после забора) плазму крови с добавленным антикоагул€нтом (цитрат натри€) откручивали на подушке из Ficoll-Plaque Plus (Amersham-Pharmacia) при 1500 g 20 минут при комнатной температуре. ѕлазму (1/2 от всего количества) аккуратно отбирали, не задева€ остаток клеток на подушке фиколла, и откручивали при 10000 g 30 минут, чтобы избавитьс€ от обломков клеток и дебриса. —упернатант отбирали, не затрагива€ осадок, добавл€ли до 1% саркозила, до 50 мћ трис-HCl, рЌ 7,6, до 20 мћ Ёƒ“ј, до 400 мћ NaCl, и равный объем смеси фенол-хлороформ 1:1. 

ѕолученную эмульсию инкубировали при 65∞— 2 часа, затем отдел€ли фенол-хлороформ центрифугированием при 5000 g в течение 20 минут при комнатной температуре. ѕроцедуру депротеинизации фенол-хлороформом повтор€ли идентичным способом трижды, после чего водную фазу обрабатывали хлороформом, затем диэтиловым эфиром. ќтделение от органических растворителей производили центрифугированием при 5000g в течение 15 минут.   полученной водной фазе добавл€ли равный объем изопропанола и инкубировали в течение ночи при 0∞—. ѕосле осаждени€ нуклеиновые кислоты отдел€ли центрифугированием при 0∞—, 10000 g в течение 30 минут. ќсадок нуклеиновых кислот раствор€ли в буфере, содержащем 10 мћ трис-HCl, рЌ 7,6, 5 мћ Ёƒ“ј, и наносили на подушку из ступенчатого хлористого цези€ (1 ћ, 2.5 ћ, 5.7 ћ) в центрифужной пробирке дл€ ротора SW60Ti. ќбъем ƒЌ  составл€л 2 мл, объем каждой ступеньки CsCl - по 1 мл. ”льтрацентрифугирование проводили в приборе L80-80 (Beckman) 3 часа при 250000 g. ƒЌ  отбирали с поверхности ступеньки 5.7ћ по фракци€м. ‘ракции диализировали 12 часов при 4∞—. Ќаличие ƒЌ  во фракци€х определ€ли агарозным электрофорезом с визуализацией ƒЌ  бромистым этидием.  оличество ƒЌ  определ€ли спектрофотометрически (Beckman DU70) в кювете объемом 100 мкл, снима€ спектр от 220 до 320 нм.

ѕример 1. Ћечение экспериментального сепсиса, вызванного Candida Albicans и St. Aureus.

¬ эксперименте использовали белых беспородных мышей весом 23-25 грамм.

√руппа 1 (30 мышей) - мышам вводили в ретроорбитальный синус бактерии патогенного штамма Staphylococcus aureus VT-2003R в дозе 1×1010 бактериальных клеток на мышь. –екомбинантна€ дорназа-альфа (Geneyech) вводилась в дозе 500 мкг/кг внутрибрюшинно через 2, 6, 10 и 14 часов после инфицировани€.

√руппа 2 (10 мышей) - мышам вводили в ретроорбитальный синус бактерии патогенного штамма Staphylococcus aureus VT-2003R в дозе 1×10 10 бактериальных клеток на мышь. ‘осфатный буфер вводилс€ внутрибрюшинно через 2, 6, 10 и 14 часов после инфицировани€. 

ѕосле последнего введени€ дорназы из 24 мышей 1 группы были выделены подгруппы 1а и 1в.

ѕодгруппа 1а (8 мышей) - через 2 часа после последнего введени€ дорназы мышам вводили внутривенно внеклеточную ƒЌ  крови (0,1 мкг на мышь), полученную от мышей, инфицированных Staphylococcus aureus VT-2003R, в дозе 1×1010 бактериальных клеток на мышь через 15 часов после введени€ бактерий в ретроорбитальный синус.

ѕодгруппа 1в (8 мышей) - через 2 часа после последнего введени€ дорназы мышам ввели внутривенно внеклеточную ƒЌ  крови (0,1 мкг на мышь), полученную от мышей инфицированных Candida Albicans, в дозе LD50 на мышь через 3 дн€ после внутривенного введени€ грибов.

ќценивали выживаемость животных через 32 часа после инфицировани€.

–езультаты приведены в таблице 1.

¬ыживаемость мышей в различные сроки после инфицировани€.

“аблица 1 
0 час. 2 час. 4 час. 6 час. 8 час. 12 час. 24 час. 28 час. 32 час. 
√руппа 1 100% 100% 100% 90% 90% 80% 50% 40% 30% 
√руппа 2 100% 100% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 20% 
1a 20% 10% 10% 
1в 50% 50% 40% 


√руппа 3 (10 мышей) - мышам вводили внутривенно грибы, субкультивированные, полученные из патогенного коинического изол€та Candida Albicans, в дозе LD50. –екомбинантна€ дорназа-альфа (Geneyech) вводилась в дозе 1 мг/кг внутрибрюшинно дважды в день на 2, 3 и 4 день после инфицировани€.

√руппа 4 (10 мышей) - мышам вводили внутривенно грибы, субкультивированные, полученные из патогенного коинического изол€та Candida Albicans, в дозе LD50. јмфотерицин ¬ вводилс€ в дозе 20 мкг/кг внутрибрюшинно дважды в день на 2, 3 и 4 день после инфицировани€.

√руппа 5 (10 мышей) - мышам вводили внутривенно грибы, субкультивированные, полученные из патогенного коинического изол€та Candida Albicans, в дозе LD50. ¬ качестве негативного контрол€ вводилс€ фосфатный буфер внутрибрюшинно дважды в день на 2, 3 и 4 день после инфицировани€. 

ќценивали выживаемость и массу мышей на 7 день после инфицировани€. 

–езультаты приведены в таблице 2.

¬ыживаемость мышей в различные сроки после инфицировани€.

“аблица 2 
1 день 3 день 5 день 7 день 
√руппа 3 100% 100% 100% 100% 
√руппа 4 100% 100% 100% 100% 
√руппа 5 100% 80% 50% 50% 


¬ группе 4 на 7 день вес животных составл€л в среднем на 20% меньше, чем в группе 3. Ёто свидетельствует о том, что при равной защитной эффективности дорназы-альфа и амфотерицина ¬, последний про€вл€л большую токсичность.

“аким образом, внеклеточна€ ƒЌ  крови инфицированных животных оказывает негативное вли€ние на течение инфекционного процесса, а ее разрушение согласно за€вл€емому методу оказывает лечебный эффект при бактериальной и грибковой инфекции.

ѕример 2. Ћечение генерализованной бактериальной инфекции (сепсиса).

38-летний мужчина был доставлен в терапевтическое отделение в т€желом состо€нии. «а 12 дней до госпитализации у больного амбулаторно было диагностировано острое респираторное заболевание. «а 5 дней до госпитализации в св€зи с субфебрильной температурой, наличием выраженной астении и болей в правой половине грудной клетки больному был установлен диагноз пневмонии. Ѕольному были прописаны инъекции цефазолина и пероральный прием рокситромицина, однако улучшени€ не наступило, и за 2 дн€ до госпитализации у него развилась лихорадка (39,5-40∞—), тошнота, рвота, головна€ боль. ¬ последний перед госпитализацией день присоединились множественные геморрагические высыпани€ на коже, болезненность в мышцах, желтуха и диаре€. ѕри поступлении - температура 38,3∞C, давление 100 на 60, тахикарди€ до 120 в минуту, менингиальные симптомы отрицательные, конечности холодные и цианотичные.  ожа желтушна€. √еморрагические высыпани€ на внутренних поверхност€х рук и ног. Ћабораторно - умеренный лейкоцитоз со сдвигом формулы (18% юных форм), токсическа€ зернистость нейтрофилов, повышение пр€мого билирубина, ACT и јЋ“. ѕри ультразвуковом исследовании печени - множественные мелкие гипоэхогенные очаги. Ѕольному был поставлен диагноз сепсиса. Ѕыл осуществлен посев крови. Ѕольной получал парентерально комбинацию √ентамицин/јмпициллин/ћетронидазол, гепарин, вазодил€таторы. Ќесмотр€ на проводимую антимикробную полихимиотерапию, сеансы гемосорбции и трансфузии донорской плазмы состо€ние больного продолжало ухудшатьс€. –азвилс€ острый респираторный дистресс-синдром. „ерез 2 суток после поступлени€ больной был переведен в реанимационное отделение и подключен к аппарату искусственной вентил€ции легких. »з крови больного был высе€н S.pneumoniae, в св€зи с чем больному были назначены инфузии ¬анкомицина. ¬ течение последующих 48 часов, несмотр€ на введение ванкомицина состо€ние больного ухудшилось, наросли €влени€ полиорганной недостаточности. — согласи€ родственников больного были начаты внутривенные инфузии бычьей панкреатической ƒЌ азы в дозе 800 мг/сутки (1600000 ≈ƒ  унца) в виде посто€нной продолжающейс€ инфузии. „ерез 12 часов после начала инфузии по€вились признаки стабилизации состо€ни€ больного. ѕо€вились признаки улучшени€ периферической циркул€ции крови, улучшились показатели системной гемодинамики, началось мочеобразование. ¬ течение последующих 5 дней на фоне продолжающихс€ инфузий ƒЌ азы лабораторные показатели больного приблизились к норме, полностью восстановились гемодинамика, функци€ почек и больной был переведен на самосто€тельное дыхание.

‘люоресценци€ этиди€ бромида в плазме крови и ƒЌ -гидролититическа€ активность в плазме крови до начала лечени€ (0), через 12 и 48 часов после начала лечени€ по за€вл€емому способу, приведена в таблице 3. 

“аблица 3 
0 12 48 
‘люоресценци€ Ётиди€ бромида 100% 85% 70% 
ƒЌ -√идролитическа€ активность в плазме крови (≈д. унца/литр) 7 172 200 


ѕульс-гельэлектрофорез внеклеточной ƒЌ  плазмы крови до начала лечени€ по за€вл€емому способу (полоса 1) и через 12 часов после начала лечени€ (полоса 2) представлен на фиг.1.

»спользование флюоресценции этиди€ бромида дл€ количественного определени€ ƒЌ .

Ётидий бромид €вл€етс€ искусственно синтезированным флуоресцентным нуклеотид-специфичным красителем.   преимуществам данного красител€ относитс€ простота метода окраски и чувствительность к малым количествам ƒЌ  в пробе. Ётидий бромид €вл€етс€ интеркал€тором, прослаивающимс€ между двум€ парами оснований двойной спирали полинуклеотида с некоторым предпочтением к его GC-богатым участкам. Ётидий бромид более 30 лет примен€етс€ в области флюоресцентной микроскопии, флюорометрии, гель-электрофореза дл€ визуализации и количественной оценки ƒЌ -содержащих субстратов. ѕри добавлении этиди€ бромида в плазму крови интенсивность его флюоресценции пропорциональна количеству внеклеточной ƒЌ  плазмы крови. Ќиже приводим литературные ссылки по использованию различных флюоресцентных нуклеотид-специфичных красителей дл€ измерени€ количества ƒЌ : 

DNA analysis (Scientific session) Forensic Science International Volume 136, Supplement 1, 2003, Pages 31-69; Rengarajan L, Cristol SM, Mehta M, Nickerson JM: Quantifying DNA concentrations using fluorometry: a comparison of flourophores; Mol Vis 2002, 8: 416-421. 

“аким образом, применение ƒЌ азы согласно за€вл€емому способу оказывает лечебный эффект при системном бактериальном поражении.

ѕример 3. Ћечение церебральной мал€рии.

40 мышей —57¬1 получили внутрибрюшинную инъекцию эритроцитов, полученных от мышей линии BALB/c, инфицированных –. Bergehi (10 6 эритроцитов на мышь).

√руппа 1 (10 мышей) - начина€ с 24 часов после инфицировани€ мышам вводили рекомбинантную дорназу-альфа (Genetech) в дозе 500 мкг/кг четыре раза в день внутримышечно на прот€жении 3 дней.

√руппа 2(10 мышей) - получали инъекции фосфатного буфера.

√руппа 3 (10 мышей) - начина€ с 24 часов после инфицировани€ мышам вводили рекомбинантную дорназу-альфа (Genetech) в дозе 500 мкг/кг четыре раза в день внутримышечно на прот€жении 3 дней. Ќа следующий день мышам ввели внутривенно внеклеточную ƒЌ  крови (0,1 мкг на мышь), полученную от мышей —57¬1 на 5-й день инфекции –.Bergehi.

√руппа 4 (10 мышей) - начина€ с 24 часов после инфицировани€ мышам вводили рекомбинантную дорназу-альфа (Genetech) в дозе 500 мкг/кг четыре раза в день внутримышечно на прот€жении 3 дней. Ќа следующий день мышам ввели внутривенно внеклеточную ƒЌ  крови (0,1 мкг на мышь), полученную от интактных мышей C57B1.

ќценивали выживаемость мышей в опытной и контрольной группах через 7 дней после инфицировани€. –езультаты эксперимента приведены в таблице 4.

“аблица 4 
√руппа 1 √руппа 2 √руппа 3 √руппа 4 
¬ыживаемость, % 90 10 50 80 


“аким образом, внеклеточна€ ƒЌ  крови животных, инфицированных мал€рией, оказывает негативное вли€ние на течение инфекционного процесса, а ее разрушение согласно за€вленному изобретению оказывает лечебный эффект при паразитарной инфекции.

ѕример 4. ¬ли€ние терапии ƒЌ азой на жизнеспособность бета-клеток поджелудочной железы и эндотели€ аорты.

»спользовали рекомбинантную человеческую ƒЌ азу I (Genetech).

Ѕета-клетки эмбриональной поджелудочной железы человека и эндотелиальные клетки аорты человека использовали дл€ формировани€ первичной клеточной культуры. „ерез 24 часа после пассажа в одной экспериментальной серии в клеточные культуры добавл€ли внеклеточную ƒЌ , выделенную из плазмы больного т€желой формой диабета 2 типа и системным атеросклерозом (0,0025 мкг ƒЌ  на 1 мл культуральной среды), а в другой экспериментальной серии ƒЌ  того же больного перед введением в культуру подвергали обработке ƒЌ азой (1 мкг/мл; 37∞—; 30 минут). „ерез 24 часа оценивали содержание жизнеспособных клеток по включению красител€ трипанового синего.

–езультаты эксперимента приведены в таблице 5.

ѕроцентное содержание жизнеспособных клеток через 48 часов после пассировани€.

“аблица 5 
 летки  онтроль ƒЌ  больного ƒЌ  больного, обработанна€ ƒЌ азой 
¬-клетки 73% 43% 61% 
Ёндотелий 62% 35% 55% 


“аким образом, внеклеточна€ ƒЌ  крови больного т€желым диабетом II типа и атеросклерозом оказывает негативное воздействие как на здоровые ¬-клетки поджелудочной железы, так и на здоровые эндотелиальные клетки. –азрушение внеклеточной ƒЌ  крови больного ферментом ƒЌ азой преп€тствует этому согласно за€вл€емому способу. 

ѕример 5. Ћечение атеросклероза.

ћужчина 54 лет поступил в клинику в т€желом состо€нии с жалобами на сильные боли в области живота, диарею, интенсивные боли в ногах при ходьбе, потерю веса. 12 лет назад у больного был вы€влен сахарный диабет 2 типа и назначен прием глибенкламида. 15 мес€цев назад впервые по€вились эпигастральные боли, возникающие после приема пищи. Ѕольному был назначен прием антацидных средств, однако боли усиливались, в последние 3 мес€ца присоединилась обильна€ стеаторе€. ¬ последние дни перед госпитализацией развилась анорекси€ вследствие интенсивного болевого синдрома. ѕри обследовании вы€влено значительное истощение (вес тела - 44 кг при поступлении; снижение на 28 кг за последние 5 мес€цев), отсутствие пульсации артерий ног. ѕри фиброгастродуоденоскопии и колоноскопии не вы€влено органических изменений. Ё √ - в норме. ¬ крови - умеренное повышение холестерина и фракции липопротеидов низкой плотности, гликозилированный гемоглобин - 11%. ѕри аортографии вы€влена частична€ окклюзи€ аорты ниже почечных артерий (70%), частична€ окклюзи€ подвздошных артерий (90%), полна€ окклюзи€ верхней и нижней мезантериальных артерий. ¬ св€зи с невозможностью хирургического лечени€ было прин€то решение о консервативном лечении. Ѕольной был переведен на интенсивное парентеральное питание. Ѕыла назначена инсулинотерапи€. ѕроводилась антиагрегантна€ терапи€. — согласи€ больного были начаты внутривенные инфузии бычьей панкреатической дезоксирибонуклеазы в дозе 800 мг/сутки (1600000 ≈ƒ  унца) в виде 4 двухчасовых инфузий ежедневно. Ќа 7 день после начала терапии больной начал принимать диетическую пищу. Ѕолевой синдром не возобновл€лс€.   20 дню больной получал полноценное энтеральное питание. —амочувствие значительно улучшилось, началс€ прирост массы тела. Ќа 45 день в св€зи с подготовкой больного к оперативному лечению была проведена повторна€ ангиографи€. ¬ы€влено снижение степени окклюзии аорты и подвздошных артерий на 20% и 30% соответственно, по€вление кровотока в верхней и нижней мезантериальных артери€х (окклюзи€ 80%).

ќбразцы внеклеточной ƒЌ  данного больного клонированы с использованием метода, позвол€ющего конструировать неамплифицированные плазмидные библиотеки внеклеточной ƒЌ  крови с представительностью до миллиона клонов со средним размером в 300-500 пар оснований.

¬ыделенна€ по ранее описанному протоколу ƒЌ  была подвергнута дополнительной тщательной депротеинизации с применением протеиназы   (Sigma) при 65∞— дл€ удалени€ прочно св€занных белков. ѕосле депротеинизации и однократной обработки фенол-хлороформом пр 65∞— ƒЌ  осаждали 2,5 объемами этанола в течение ночи. «атем ƒЌ  либо обрабатывали рестриктазой EcoRI в течение 3 часов, либо Pfu полимеразой (Stratagene) в присутствии 300 мкћ всех дезоксинуклеотидтрифосфатов дл€ удалени€ липких концов. ƒостроенную ƒЌ  фосфорилировали полинуклеотидкиназой “4 (30U, 2 ч). ѕолученные препараты лигировали в плазмиду pBluescript (Stratagene), переваренную EcoRI или PvuII соответственно, и дефосфорилированную щелочной фосфатазой CIP (Fermentas) в течение 1 часа. ƒл€ лигировани€ обычно использовали 1 мкг вектора и 0,1-0,5 мкг сывороточной ƒЌ . Ћигирование проводили при помощи Rapid Ligation Kit (Roche) 10 часов при 16∞—. ќбъем лигазной смеси составл€л 50 мкл. Ћигированную библиотеку трансформировали в клетки DH12S (Life Technologies) с применением электропоратора ≈.Coli porator (BioRad). ƒл€ трансформации одной библиотеки использовали 12-20 электропорационных кювет. ƒл€ контрол€ на чашки с 1,5% агаром и средой LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, высевали разведени€ библиотеки 10-4, 10-5 и 10 -6. ¬ обоих случа€х представительность библиотеки составл€ла примерно 2-3Ј106 клонов.

јнализ случайно выбранных 75 клонов с длиной от 300 до 1000 пар оснований из библиотеки, полученной из внеклеточной ƒЌ  крови больного до начала лечени€, показал, что 56 из 75 клонов представл€ют собой уникальные последовательности ƒЌ  человека. »з 56 фрагментов уникальной ƒЌ , функци€ или продукт соответствующего гена с помощью Human Gene Bank были идентифицированы дл€ 11 последовательностей (см. табл.6).

“аблица 6 
Gene or correspon protein productding Reported role in Atherosclerosis and Diabetes 
neutral endopeptidase јктивность повышена в эндотелиальных клетках, гладкомышечных и стромальных клетках интимы артерий при атеросклерозе, подавление активности может снижать накопление липидов в стенке сосуда. 
muskelin 1 явл€етс€ медиатором клеточного ответа на “ромбоспондин 1. “ромбоспондин 1 - опосредуемые процессы €вл€ютс€ признанным патофизиологическим компонентом развити€ атеросклеротического поражени€ артериальной стенки. 
Nf-kappaB јктивность повышена в клетках артериальной стенки при гипергликемии и атеросклерозе. 
Transient receptor potential cation channel 
Phospholipase C, epsilon »ндуцирует экспрессию рецептора липопротеинов низкой плотности 
CRTL 1: cartilage linking protein 1 
17kD fetal brain protein 
nicotinamide nucleotide transhydrogenase 
BAI3: brain-specific angiogenesis inhibitor 
GAD2: glutamate decarboxylase 2 ќдин из основных аутоантигенов при диабете 1 типа 
E-selectin ¬ысокий уровень экспрессии €вл€етс€ фактором риска развити€ ангиопатии при диабете 2 типа 


јнализ случайно выбранных 50 клонов из библиотеки, полученной из внеклеточной ƒЌ  крови больного через 21 день после начала лечени€, показал, что более 90% вы€вленных последовательностей клонов представл€ют собой короткие фрагменты повтор€ющейс€ ƒЌ  генома человека, в основном альфа-сателлитную ƒЌ . ѕараллельно наблюдались изменени€ электрофоретического профил€ внеклеточной ƒЌ  плазмы, вы€вл€емые пульс-гельэлектрофорезом.

‘люоресценци€ этиди€ бромида в плазме крови больного до начала лечени€ по за€вл€емому способу (0) через 7, 20 и 45 дней после начала лечени€ (см. табл.7). 

“абл.7 
0 7 20 45 
‘люоресценци€ Ётиди€ бромида 100% 90% 75% 60% 


“аким образом, происходит отчетливое снижение содержани€ внеклеточной ƒЌ  крови к 45 дню лечени€.

“аким образом, применение ƒЌ азы согласно за€вл€емому способу оказывает лечебный эффект при атеросклерозе.

ѕример 6. Ћечение сахарного диабета. 

ѕлохой метаболический контроль диабета, выражающийс€ в высоком содержании гликозилированного гемоглобина в крови, и низка€ чувствительность к инсулину, требующа€ введени€ высоких доз препарата, €вл€ютс€ основными факторами, предрасполагающими к развитию осложнений, инвалидизации и смерти больных.

Ѕольной 46 лет страдает диабетом 2 типа в течение 3 лет. –анее лечащим врачам не удалось добитьс€ нормогликемии с помощью оральных антидиабетических средств и 2 года назад больному был назначен рекомбинантный человеческий инсулин длительного действи€ в дозе 0,3 U/кг (21 U) в сутки. ќднако уровень гликозилированного гемоглобина в крови продолжал оставатьс€ высоким (более 10%), нарастали про€влени€ диабетической ангиопатии с полинейропатией и ослаблением зрени€. «а 2 года суточна€ потребность в инсулине выросла до 1,2 U/кг (84 U) в сутки. Ѕольному были прописаны внутримышечные инъекции бычьей панкреатической ƒЌ азы в дозе 200 мг в сутки (две инъекции в сутки) на прот€жении 4-х мес€цев.   концу курса лечени€ самочувствие больного значительно улучшилось, снизилось содержание гликозилированного гемоглобина в крови, удалось в 2 раза снизить суточную дозу инсулина. 

Ёлектрофореграмма внеклеточной ƒЌ  больного до начала лечени€ по за€вл€емому способу ( ) через 1, 2, 3 и 4 мес€ца после начала лечени€ (на фиг.2). ќтчетливо видно как снижение общего количества внеклеточной ƒЌ  крови, так и полное исчезновение отдельных ее фракций в процессе проводимого лечени€.

Ёффект лечени€ ƒЌ азой на метаболические показатели пациента (см. табл. 8).

“аблица 8 
ƒо начала лечени€ „ерез 3 мес€ца „ерез 4 мес€ца 
√ликозилированный гемоглобин (%) 13,2 10,1 7,2 
ѕотребность в инсулине U/кг массы тела 1,2 0,9 0,6 
 оличество внеклеточной ƒЌ  плазмы крови (%). 100 85 70 


 оличество внеклеточной ƒЌ  плазмы крови оценивали, осуществл€€ денситометрию электрофореграмм. «а 100% принимали содержание внеклеточной ƒЌ  плазмы до начала лечени€.

‘люоресценци€ этиди€ бромида в плазме крови и ƒЌ -гидролититическа€ активность в плазме крови до начала лечени€ (0), через 7 и 14 дней после начала лечени€ по за€вл€емому способу (см. табл.9).

“абл.9 
0 7 14 
‘люоресценци€ Ётиди€ бромида 100% 75% 55% 
ƒЌ -√идролитическа€ активность в плазме крови (≈д. унца/литр) 65 170 210 


“аким образом, применение ƒЌ азы при диабете оказывает лечебный эффект согласно за€вл€емому способу.

ѕример 7. ѕодавление активации лимфоцитов.

20 мышей —57¬1 иммунизировали суспензией Mycobacterium Smegmatis (100 мкг антигена в 50 мкл алюминиевых квасцов) подкожно в подушечку лапы. „ерез 4 недели мышей забивали и выдел€ли спленоциты. —пленоциты сенсибилизированных и интактных мышей культивировали в чашках ѕетри в суспензионной культуре (2,5×106 клеток/мл) в среде RPMI 1640 с 2 мћ глютамина, антибиотиками и 10 эмбриональной тел€чьей сыворотки в присутствии антигена Mycobacterium Smegmatis (5 мкг/мл) в течение 24 часов в атмосфере 5% —ќ2 при 37∞—. ƒл€ определени€ степени активации спленоцитов под вли€нием антигена за 6 часов до окончани€ срока культивировани€ в среду добавл€ли [3Ќ] тимидин до финальной концентрации 0,1 mCi/мл. ѕосле окончани€ срока культивации клетки отмывали, раствор€ли в формамиде и измер€ли радиоактивность. 

—ери€ 1 (5 чашек). —пленоциты сенсибилизированных мышей. 

—ери€ 2 (5 чашек). —пленоциты сенсибилизированных мышей. ¬ среду добавл€ли рекомбинантную дорназу-альфа (Genetech) в концентрации 1 мкг/мл.

—ери€ 3 (5 чашек). —пленоциты интактных мышей. 

—ери€ 4 (5 чашек). —пленоциты интактных мышей. ¬ среду добавл€ли внеклеточную ƒЌ  крови, выделенную из крови сенсибилизированных мышей через 2 часа после повторного подкожного введени€ антигена Mycobacterium Smegmatis в дозе 200 мкг. ƒЌ  добавл€ли в количестве 0,05 мкг/мл.

—ери€ 5 (5 чашек). —пленоциты интактных мышей. ¬ среду добавл€ли внеклеточную ƒЌ  крови, выделенную из крови интактных мышей через 2 часа после повторного подкожного введени€ антигена Mycobacterium Smegmatis в дозе 200 мкг. ƒЌ  добавл€ли в количестве 0,05 мкг/мл.

—ери€ 6 (5 чашек). —пленоциты интактных мышей, культивировавшиес€ без добавлени€ антигена.

–езультаты эксперимента представлены на диаграмме (см. фиг.3). 

¬ключение спленоцитами [3Ќ] тимидина через 24 часа после культивировани€ с антигеном.

“аким образом, внеклеточна€ ƒЌ  плазмы крови усиливает специфическую активацию лимфоцитов под вли€нием антигенной стимул€ции, а применение ƒЌ азы приводит к подавлению антигенной активации лимфоцитов согласно за€вл€емому способу.

ѕример 8. Ћечение аллергии, св€занной с реакцией гиперчувствительности замедленного типа.

ћужчина 23 лет поступил в клинику в т€желом состо€нии. „етыре года назад, в 1999 году у него был диагносцирован хронический миелолейкоз. ѕациент ранее получал терапию препаратами гидроксимочевины и альфа-интерферона. Ѕыстрое прогрессирование болезни потребовало проведени€ процедуры трансплантации костного мозга. Ѕыла проведена трансплантаци€ костного мозга от HLA-совместимого, но ј¬ќ несовместимого донора с тотальным облучением и введением циклофосфана. ƒл€ профилактики –“ѕ’ больной получал метотрексат.

Ќа 9 день развилась выраженна€ реакци€ –“ѕ’ с генерализованной сыпью и диареей. ¬ течение 9 дней больной получал пульс-терапию метилпреднизолоном и антилимфоцитарным глобулином. —осто€ние больного улучшилось.   30-му дню функци€ костного мозга восстановилась и больной был выписан.

„ерез неделю больной вновь поступил в клинику с лейкопенией (лейкоциты 0,9Ј109), изъ€звлени€ми в полости рта и лихорадкой. јспирационна€ биопси€ костного мозга вы€вила гипоплазию и эозинофилию. Ѕыла назначена терапи€ јзатиоприном и Ћейкомаксом, но через 6 дней вновь развилась лейкопени€ (лейкоциты 0,7Ј109 ). јзатиоприн был отменен и была проведена повторна€ пульс-терапи€ метилпреднизолоном в сочетании с лейкомаксом. Ћихорадка, лейкопени€ и изъ€звлени€ в полости рта оставались. ¬скоре после окончани€ терапии у больного развились эпизоды внутрисосудистого гемолиза, на фоне прогрессировани€ которых продолжилось падение уровн€ лейкоцитов и тромбоцитов. Ѕольному были назначены внутривенные инфузии бычьей панкреатической дезоксирибонуклеазы в дозе 400 мг/сутки (800000 ≈ƒ  унца) в виде 6 одночасовых инфузий ежедневно в течение 2 недель. ѕри этом уровень ƒЌ  гидролитической активности, измер€емый в плазме крови, превысил 180 ≈ƒ  унса на литр плазмы в течение более 12 часов. Ќачина€ с 5 дн€ состо€ние больного стало улучшатьс€. —одержание лейкоцитов возросло к 7 дню до 1,7Ј10 9, а к 15 дню составило 2,4Ј109, исчезли признаки гемолиза, нормализовалась температура и произошла санаци€ €зв в полости рта. Ќормализовалось содержание гемоглобина и эритроцитов. ѕациент был выписан в удовлетворительном состо€нии. ѕри контрольном визите госпитализации через мес€ц формула крови в пор€дке.

“аким образом, применение ƒЌ азы согласно за€вл€емому способу оказывает лечебный эффект при аллергических заболевани€х, св€занных с гиперчувствительностью замедленного типа.

ѕример 9. ѕодавление распространени€ мутантного гена.

–€д заболеваний человека возникает вследствие развити€ состо€ни€ соматического мозаицизма - экспансии мутантного гена в попул€ции соматических клеток (Youssoufian H., Pyeritz RE. Mechanisms and Consequences of Somatic Mosaicism in Humans. Nature Reviews Genetics, 2002, 3: 748-758).

¬ качестве модели развити€ соматического мозаицизма была изучена частота мутаций гена HPRT в “-лимфоцитах крови. „еловеческий HPRT ген (’ромосома Xq26) кодирует конститутивно экспрессируемый, но не эссенциальный фермент, вовлеченный метаболизм пуриновых оснований.  лонирование проводили по методике, описанной Bigbee W (Bigbee W. Et al., Mutation Res., 1998, v.397, pp.119-136).  лонированию подвергались лимфоциты периферической крови 8 больных, получавших курс 3-недельной иммуностимулирующей терапии препаратом Ќеовир после хирургического удалени€ опухоли. »з 8 больных 4 пациента дополнительно получали терапию человеческой рекомбинантной ƒЌ азой I (Genetech) (200 мкг/кг внутривенно, 4 раза в сутки в течение 3 недель). „астота встречаемости HPRT-дефицитных клонов в крови больных, получавших терапию ƒЌ азой I, в среднем была в 3 раза ниже таковой в крови больных, получавших только иммуностимулирующую терапию. ƒобавление внеклеточной ƒЌ  крови больных, не получавших ƒЌ азу в культуральную среду при клонировании “-лимфоцитов больных, получавших терапию ƒЌ азой, повышает частоту встречаемости HPRT-дефицитных клонов при клонировании последних.

“аким образом, разрушение внеклеточной ƒЌ  крови больного ферментом ƒЌ азой преп€тствует развитию соматического мозаицизма согласно за€вл€емому способу. 

ѕример 10. ”ничтожение патогенных свойств внеклеточной ƒЌ  крови различными способами разрушени€.

ћыши —57¬1 получили прививку высокометастатического или низкометастатического штамма опухоли LLC. Ќа 9 день после перевивки животных усыпл€ли и собирали суммарную плазму крови мышей. —уммарна€ фракци€ внеклеточной ƒЌ  крови после выделени€ хранилась при -20∞— в фосфатном буфере.

¬ эксперименте участвовало 7 групп мышей, привитых низкометастатическим штаммом LLC.

√руппа 1 - 6 мышей с привитым низкометастатическим штаммом LLC.

√руппа 2 - 6 мышей с привитым низкометастатическим штаммом LLC + внутривенное двукратное (на седьмой и восьмой день после перевивки) введение суммарной фракции внеклеточной ƒЌ  мышей с привитым высокометастатическим штаммом (0,05 мкг ƒЌ  перед введением раствор€лись в 500 мкл свежей гепаринизированой крови).

√руппа 3 - 6 мышей с привитым низкометастатическим штаммом LLC + внутривенное двукратное (на седьмой и восьмой день после перевивки) введение суммарной фракции ƒЌ  мышей с привитым высокометастатическим штаммом (0,05 мкг ƒЌ  перед введением раствор€ли в 500 мкл свежей плазмы). ѕеред введением образец ƒЌ  подвергали фотохимической дезинфекции (добавление 1 мкћ метиленового синего с последующим облучением красным светом в течение 10 минут (˜60000 Ћюкс).

√руппа 4 - 6 мышей с привитым низкометастатическим штаммом LLC + внутривенное двукратное (на седьмой и восьмой день после перевивки) введение суммарной фракции ƒЌ  мышей с привитым высокометастатическим штаммом (0,05 мкг ƒЌ  перед введением раствор€ли в 500 мкл свежей плазмы). ѕеред введением образец ƒЌ  смешивали с 10 мкг анти-ƒЌ  гидролизующих антител.

√руппа 5 - 6 мышей с привитым низкометастатическим штаммом LLC + внутривенное двукратное (на седьмой и восьмой день после перевивки) введение суммарной фракции ƒЌ  мышей с привитым высокометастатическим штаммом (0,05 мкг ƒЌ  перед введением раствор€ли в 500 мкл свежей гепаринизированной крови). ѕеред введением в образец добавл€ли 1 мкг фрагмента ј растительного токсина –ицина и инкубировали 1 час при 37∞—. –ицин €вл€етс€ представителем семейства RIP (белки, инактивирующие рибосомы) токсинов, широко используемых дл€ создани€ иммунотоксинов.  роме способности инактивировать рибосомы, эти белки обладают способностью деаденилировать ƒЌ  и осуществл€ть ее гидролиз. ƒл€ реализации токсического эффекта каталитическа€ единица ј токсинов RIP II типа должна быть доставлена в клетку субьединицей ¬. ¬ отсутствие субъединицы ¬ цепь ј не токсична, однако, полинуклеотид-аденингликозидазна€ и ƒЌ -гидролазна€ активность цепи ј может быть использована дл€ разрушени€ ƒЌ , циркулирующей в плазме.

√руппа 7 - 6 мышей с привитым низкометастатическим штаммом LLC + внутривенное двукратное (на седьмой и восьмой день после перевивки) введение суммарной фракции внеклеточной ƒЌ  мышей, привитых низкометастатическим штаммом LLC.

ќценивали количество метастатических узлов в легких на 15 день после перевивки. 

–езультаты эксперимента приведены в таблице 10.

“аблица 10 
N √руппы Ncp. 
1 12,0 
2 22,5 
3 14,1 
4 15,5 
5 15,1 
7 13,3 


“аким образом, различные способы разрушени€ внеклеточной ƒЌ  крови подавл€ют ее патогенные свойства

ѕример 11. Ћечение флегмон челюстно-лицевой области

¬ исследование было включено 12 больных в состо€нии средней т€жести, поступивших в клинику челюстно-лицевой хирургии с диагнозом флегмона челюстно-лицевой области. Ѕольные были разделены на 2 группы:

1 группа больных (6 человек) получала стандартную антибактериальную терапию в течении 5 суток (÷ефотаксим 3 грамма в сутки внутримышечно).

2 группа больных (5 человек) получала 4 внутривенные инфузии ƒЌ азы (Seravac; ёј–) в суточной дозе 2500000 ≈диниц  унца в течение 3 суток и стандартную антибактериальную терапию в течении 5 суток (÷ефотаксим 3 грамма в сутки внутримышечно).

–езультаты лечени€ приведены в “аблице 11.

“аблица 11 
—имптомы выздоровлени€ √руппа 1 √руппа 2 
—роки прекращени€ лихорадки после начала лечени€ 5 день 2 день 
—роки очищени€ раны после начала лечени€ 7 день 3 день 
—роки закрыти€ раны после начала лечени€ 12 день 7 день 
Ќаличие резистентных к примен€емому антибиотику микроорганизмов 2 из 5 0 


‘иг.4. ƒинамика профил€ электрофореграмм и флуоресценции этиди€ бромида в плазме крови больных, получавших лечение ƒЌ азой по поводу флегмон челюстно-лицевой области.

“аблица 12 
Ѕольной ј. 
ѕолоса электрофореграммы —роки ѕроцентное снижение флуоресценции этиди€ бромида в плазме крови 
ѕолоса 2 до лечени€ 0 
ѕолоса 3 1 сутки 10 
ѕолоса 4 3 сутки 15 
Ѕольной Ѕ. 
ѕолоса электрофореграммы —роки ѕроцентное снижение флуоресценции этиди€ бромида в плазме крови 
ѕолоса 5 до лечени€ 0 
ѕолоса 6 3 сутки 30 
Ѕольной —. 
ѕолоса электрофореграммы —роки ѕроцентное снижение флуоресценции этиди€ бромида в плазме крови 
ѕолоса 12 до лечени€ 0 
ѕолоса 13 1 сутки 20 
ѕолоса 14 3 сутки 60 


ѕример 12. Ћечение системной красной волчанки

¬ исследование было включено 16 пациентов с установленным диагнозом системной красной волчанки и лабораторными симптомами гломерулонефрита (протеинури€, микрогематури€). ¬се пациенты получали стандартную терапию (Ќестероидные противовоспалительные средства, хлороквин). ѕациенты опытной группы (8 человек) получали дополнительно утром, днем, вечером три 3-часовые инфузии ƒЌ азы (Seravac; ёј–) в суточной дозе 6000000 ≈диниц  унца прот€жении 15 суток. »зучали концентрацию ƒЌ  в плазме крови до начала лечени€ и после его окончани€. ќценивали состо€ние больных по шкале SLAM (Sustemic Lupus Activity Measure). —одержание ƒЌ  в плазме у контрольных больных достоверно не изменилось. ” больных опытной группы вы€влено двухкратное снижение ƒЌ  в плазме крови по окончании 15-дневного курса лечени€. јктивность заболевани€ у больных контрольной группы снизилась на 20% (среднее значение до начала терапии - 9,8; после окончани€ терапии - 7,4). јктивность заболевани€ у больных в опытной группе снизилась на 50% (среднее значение до начала терапии - 9,2; после окончани€ терапии - 4,9).

ѕример 13 Ћечение сахарного диабета

¬ продолжающеес€ исследование включено 10 больных с установленным диагнозом диабета 2 типа. ¬се больные ранее были переведены на лечение рекомбинантным человеческим инсулином длительного действи€ в св€зи с невозможностью обеспечить нормогликемию с помощью оральных противодиабетических средств. —редний возраст больных составил 54 года. —редн€€ длительность заболевани€ от момента постановки диагноза составила 4,5 года. ѕ€терым больным опытной группы были прописаны внутримышечные инъекции бычьей панкреатической ƒЌ азы в дозе 200 мг в сутки (две инъекции в сутки) на прот€жении 6 мес€цев. »сследовали содержание гликозилированного гемоглобина в крови, индекс атерогенности липопротеидов крови (как показатель активности атерогенеза; известно, что сосудистые осложнени€ диабета закономерно возникают вследствие быстро развивающегос€ атеросклероза крупных артерий). ¬ычисл€ли суточную потребность в инсулине (как показатель активности основного заболевани€). –езультаты опыта приведены в “аблице 13.

Ёффект лечени€ ƒЌ азой на метаболические показатели в группе пациентов, получавших лечение по за€вл€емому способу.

“аблица 13 
ƒо начала лечени€ „ерез 4 мес€ца „ерез 8 мес€цев 
√ликозилированный гемоглобин (%) 12,7 10,3 7,9 
»ндекс атерогенности липопротеидов крови 7,31 6,1 4,56 
ѕотребность в инсулине U/кг массы тела 1,34 0,87 0,63 
—одержание внеклеточной ƒЌ  крови; нг/мл 170 125 90 


ƒвум больным опытной группы до начала исследовани€ была произведена перфузионна€ сцинтиграфи€ миокарда с таллием 201 в св€зи с подозрением на коронарный атеросклероз и Ђбезболевуюї форму ишемической болезни сердца. ” обеих больных были вы€влены диффузно-очаговые зоны с нарушенным накоплением радиофармпрепарата, свидетельствующие о наличии коронарного атеросклероза. Ѕольным была прописана стандартна€ терапи€ (бета-блокаторы + нитраты). ѕо завершении исследовани€ больные были направлены на повторную перфузионную сцинтиграфию миокарда. ¬ динамике отмечено улучшение картины накоплени€ радиофармпрепарата в миокарде, свидетельствующее об улучшении кровотока в бассейне коронарных артерий.

ѕример 14. Ћечение болезни ћаркиафавы-ћикели

Ѕолезнь ћаркиафавы-ћикели очень редкое заболевание, св€занное с наличием соматической генной мутации в локусе гена PIG-A (phosphatidyl glycan class ј). Ѕольна€ ќ., 17 лет, страдает данным заболевание в течение 3 лет. ¬ течение последних 2 лет заболевание удавалось компенсировать приемом глюкокортикостероидных гормонов. ¬ течение последнего года вновь по€вились и стали интенсивно прогрессировать симптомы заболевани€: эпизоды гемолиза (2-3 раза в мес€ц), гемоглобинурии, гепатоспленомегали€, макроцитоз, анизоцитоз. Ѕьшо произведено 4 гемотрансфузии. „етыре мес€ца назад у больной развилс€ эпизод острой почечной недостаточности (креатинин - 8,2 мг/дл) вследствие интенсивного эпизода внутрисосудистого гемолиза на фоне перенесенной гнойной ангины. ¬ течение недели больной проводились процедуры гемодиализа. ѕосле компенсации функции почек с согласи€ больной ей были прописаны еженедельные инфузии человеческих донорских ƒЌ  абзимов, выделенных у больных системной красной волчанкой, в разовой дозе 500 мг (1, 2, 3 и 4 недели). ¬ течение этого мес€ца наблюдалс€ только один пароксизм заболевани€ (2 недел€) значительно меньшей интенсивности, чем предыдущий.  риз был легко купирован трехдневным курсом преднизолона в дозе 50 мг в сутки. Ќа 5 неделе больной были прописаны ежедневные однократные внутримышечные инъекции ƒЌ азы I в дозе 2000000 ≈д.  унца в сутки. ¬ течение последующих трех мес€цев наблюдени€ у больной нормализовалась формула крови, исчезла желтушность и гепатоспленомегали€. ѕароксизмы заболевани€ не повтор€лись (фиг.5).

ѕример 15. Ћечение церебральной мал€рии различными агентами, разщрушающими внеклеточную ƒЌ  крови.

40 мышей —57¬1 получили внутрибрюшинную инъекцию эритроцитов, полученных от мышей линии BALB/c, инфицированных –.Bergehi (106 эритроцитов на мышь).

1 группа (10 мышей) - начина€ с 24 часов после инфицировани€ мышам вводили рекомбинантную дорназу-альфа (Genetech) в дозе 500 мкг/кг четыре раза в день внутримышечно на прот€жении 3 дней.

2 группа (10 мышей) - получали инъекции фосфатного буфера.

3 группа (10 мышей) - начина€ с 24 часов после инфицировани€ мышам вводили ƒЌ -гидролитические антитела, выделенные из крови мышей линии SJL, спонтанно болеющих аутоимунным энцефаломиелитом в дозе 500 мкг/кг однократно внутривенно.

4 группа (10 мышей) - начина€ с 24 часов после инфицировани€ мышам вводили цепь ј –ицина в дозе 100 мкг/кг один раз в сутки внутривенно на прот€жении 3 дней.

ќценивали выживаемость мышей в опытной и контрольной группах через 7 дней после инфицировани€ и содержание внеклеточной ƒЌ  крови через 5 дней после инфицировани€. –езультаты эксперимента приведены в таблице 14.

“аблица 14 
1 √руппа 2 √руппа 3 √руппа 4 √руппа 
¬ыживаемость, % 90 10 60 40 
—одержание ¬ƒЌ   35 нг/мл 170 нг/мл 75 нг/мл 115 нг/мл 





‘ќ–ћ”Ћј »«ќЅ–≈“≈Ќ»я


1. —пособ лечени€ генерализованных инфекций, вызываемых бактери€ми, или заболеваний, вызываемых грибами и простейшими, или атеросклероза, или сахарного диабета, или заболеваний, св€занных с реакцией гиперчувствительности замедленного типа, или заболеваний, обусловленных мутаци€ми генов соматических клеток, характеризующийс€ тем, что в кровь ввод€т агент, разрушающий внеклеточную ƒЌ  крови.

2. —пособ по п.1, характеризующийс€ тем, что в кровь ввод€т фермент ƒЌ азу.

3. —пособ по п.2, характеризующийс€ тем, что фермент ƒЌ азу ввод€т в дозах, обеспечивающих изменение электрофоретического профил€ внеклеточной ƒЌ  крови, вы€вл€емое пульс-гельэлектрофорезом. 

4. —пособ по п.2, характеризующийс€ тем, что фермент ƒЌ азу ввод€т в дозах и режимах, обеспечивающих уровень ƒЌ -гидролитической активности плазмы крови, измер€емый в плазме крови и превышающий 150 единиц  унца на литр плазмы, на прот€жении суммарно более 12 ч в сутки.