СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ИСХОДОВ ОСТРОГО ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА С

СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ИСХОДОВ ОСТРОГО ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА С


RU (11) 2269134 (13) C2

(51) МПК
G01N 33/576 (2006.01)
G01N 33/68 (2006.01) 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 10.08.2007 - может прекратить свое действие 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(14) Дата публикации: 2006.01.27 
(21) Регистрационный номер заявки: 2003135523/15 
(22) Дата подачи заявки: 2003.11.27 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2003.11.27 
(43) Дата публикации заявки: 2005.05.10 
(45) Опубликовано: 2006.01.27 
(56) Аналоги изобретения: ZIBERT et al., Early antibody response against hypervariable region 1 is associated with acute Hepatitis С virus, Hepatology, 1997, v. 25, pp.1245-1249. RU 2159936 С2, 27.11.2000. RU 2158928, 10.11.2000. SANSONNO D. et al., Jmmunochemical and biomolecular studies of circula ting immune complexes isolated from patients with chronic hepatitis (virus infection, Eur. Clin. Jnvest, 1996, v. 26, №6, рр.465-475. 
(72) Имя изобретателя: Мукомолов Сергей Леонидович (RU); Плотникова Валентина Андреевна (RU); Калинина Ольга Викторовна (RU); Колобов Александр Александрович (RU) 
(73) Имя патентообладателя: Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера (RU) 
(98) Адрес для переписки: 197101, Санкт-Петербург, ул. Мира, 14, НИИЭМ им. Пастера, ОНМИ, Г.Л. Никифоровой 

(54) СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ИСХОДОВ ОСТРОГО ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА С
Изобретение относится к медицине, точнее к клинической вирусологии, и может найти применение в клинике инфекционных заболеваний для раннего прогноза исходов острого гепатита С. Сущность изобретения заключается в определении антител к нескольким антигенным участкам двух поверхностных белков (Е1 и Е2) с использованием в качестве антигенов 5 синтетических пептидов:

1. NH2 - SGHRMAWDMMMNWSP - CONH2

2. NH2 - STLTSLPTPGASG - CONH2

3. NH2 - RPYAWHYAPRPAGIVPASQV - CONH2

4. NH2 - TTDRIFGAPTYSWGENETDVL - CONH2

5. NH2 - TWIMNSTGFTKTAGGPPANIGGVGNNT - CONH2

и при обнаружении антител в первые 3-4 недель заболевания, прогнозируют благоприятный исход. Преимущество изобретения заключается в прогнозировании исхода заболевания на ранней стадии заболевания. 6 табл.




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Изобретение относится к медицине, точнее к клинической вирусологии, и может найти применение в клинике инфекционных заболеваний для раннего прогноза исходов острого гепатита С.

Известна публикация (Zibert A., Meisel H., Kraas W. et al. Early antibody response against hypervariable region 1 is associated with acute self-limiting infections of acute Hepatitis С virus.// Hepatology 1997; 25:1245-1249), в которой авторы определяли антитела к гипервариабельному региону 1 (ГВР-1) поверхностного белка Е2 вируса гепатита С у пациентов, инфицированных вирусом гепатита С геноварианта 1b, и обнаружили, что, у больных с благоприятным исходом заболевания (выздоровление) антитела к этому региону обнаруживались в 43% случаев в первые 6 месяцев после заражения, тогда как у пациентов с неблагоприятным исходом в хроническую форму такие антитела в указанные сроки выявлялись только в 13% случаях. Исходя из полученных данных, авторы делают вывод о важности определения антител к ГВР-1 для прогноза исхода заболевания.

Однако обследование пациентов для определения антител на таких поздних сроках (6 и более месяцев) не может удовлетворить клинику инфекционных болезней, которой необходимы более ранние прогностические критерии исхода заболевания для использования своевременных адекватных терапевтических мероприятий. Кроме этого, для определения антител к поверхностным белкам вируса ГС авторы использовали в качестве антигена только один достаточно короткий фрагмент белка из ГВР-1, тогда как существует еще несколько антигенных детерминант на участке двух поверхностных белков вируса Е1 и Е2, использование которых могло бы существенно повысить частоту выявления антител и увеличить достоверность прогноза исхода заболевания. Изобретение направлено на разработку способа прогнозирования исходов острого гепатита С путем определения антител к нескольким антигенным участкам двух поверхностных белков (Е1 и Е2) с использованием в качестве антигенов 5 синтетических пептидов. Цель изобретения - прогноз исходов острого гепатита С на ранней стадии заболевания и повышение достоверности прогноза. 

Показано, что у пациентов, инфицированных не только геновариантом. 1b, но и геновариантом 3а (самыми распространенными геновариантами вируса в мире), с благоприятным исходом заболевания (выздоровление), антитела ко всем 5 антигенным детерминантам поверхностных белков обнаруживаются в первые 7 недель заболевания, т.е на ранних сроках инфекционного процесса. У пациентов с неблагоприятным исходом заболевания в хроническую форму, антитела к поверхностным белкам в первые 7 недель в большинстве случаев не выявляются. Таким образом, раннее, в пределах 7 недель от начала заболевания, обнаружение антител к антигенным детерминантам поверхностных белков Е1 и Е2 позволяет прогнозировать благоприятный исход.

Антитела к поверхностным белкам определяются методом иммуноферментного анализа. Для обнаружения антител в сыворотке крови необходимо обеспечить контакт исследуемой сыворотки с антигеном и конъюгатом. Выявление антител к поверхностным белкам осуществляется за счет их взаимодействия со специфическими синтетическими пептидами, адсорбированными на поверхности лунок полистироловых микропланшетов. Образовавшийся комплекс антиген-антитело выявляется с помощью конъюгата на основе моноклональных антител против Ig G человека после добавления субстратного раствора.

В качестве антигенов используют 5 синтетических пептидов следующей структуры:

1. NH2-SGHRMAWDMMMNWSP-CONH2

2. NH 2-STLTSLPTPGASG-CONH2

3. NH2 -RPYAWHYAPRPAGIVPASQV-CONH2

4. NH 2-TTDRIFGAPTYSWGENETDVL-CONH2

5. NH 2-TWIMNSTGFTKTAGGPPANIGGVGNNT-CONH2

Все пептиды соответствуют предполагаемым антигенным детерминантам поверхностных белков Е1 и Е2 вируса гепатита С.

Специфичность реагирования указанных антигенных участков вирусного протеина с сыворотками, содержащими и не содержащими антитела к вирусу гепатита С (анти-ВГС) оценивалась в твердофазном иммуноферментном анализе (ИФА) с использованием аттестованных в коммерческих российских и зарубежных скрининговых (Аквагеп С, Monolisa HCV, Immunocomb HCV) и подтверждающих тестах (LiaTek HCV, Wellcozyme HCV immunoblot) панелей сывороток.

Авторами установлено, что все синтезированные пептидные фрагменты полипротеина вируса гепатита С специфично реагируют с анти-ВГС-позитивными сыворотками.

Специфичность реагирования синтетических пептидов-аналогов антигенных детерминант поверхностных белков оценивалась по следующим параметрам:

- отсутствие перекрестных реакций с антителами класса IgG к ядерному белку вируса гепатита В, к вирусу гепатита А;

- отсутствие реакции с сыворотками крови анти-ВГС-негативных инфекционных больных, этиологически не связанных с вирусами гепатитов (ВИЧ-инфицированных);

- отсутствие реакции с сыворотками крови анти-ВГС-негативных доноров крови;

- наличие реакции с сыворотками крови больных хроническим гепатитом С, инфицированных разными геновариантами вируса, содержащими суммарные анти-ВГС по данным коммерческих тестов.

Оценка прогностической ценности выявления антител к поверхностным белкам вируса гепатита С проводилась по частоте выявления этих антител у больных острым гепатитом С на разных сроках заболевания в сопоставлении с обнаружением специфической РНК вируса гепатита С в сыворотке крови на этих же временных отрезках. За благоприятный исход (выздоровление) принимали полную нормализацию клинико-биохимических показателей и отсутствие РНК вируса в сыворотке крови через 50-60 недель после появления первых симптомов заболевания. Неблагоприятное развитие заболевания с формированием хронической инфекции характеризовалось присутствием РНК вируса в сыворотке крови через 50-60 недель после начала болезни и повышенным уровнем аланинаминотрансферазы. Изобретение реализуется следующим образом. Для выявления антител к поверхностным белкам использовали иммуносорбент, представляющий собой полистироловые микропланшеты, лунки отдельных стрипов которых покрыты синтетическими пептидами:

1. NH2-SGHRMAWDMMMNWSP-CONH 2

2. NH2-STLTSLPTPGASG-CONH2 

3. NH2-RPYAWHYAPRPAGIVPASQV-CONH 2

4. NH2-TTDRIFGAPTYSWGENETDVL-CONH 2

5. NH2-TWIMNSTGFTKTAGGPPANIGGVGNNT-CONH 2

Источник: пептид №1 - поверхностный белок E1 вируса гепатита С, фрагмент 314-328; пептиды №2, 3, 4, 5 - поверхностный белок Е2 вируса гепатита С, фрагменты 397-411, 483-502, 514-531, 553-578 соответственно. Заявленные пептиды получают твердофазным методом с последовательным наращиванием пептидной цепи на сополимере стирола с 1% дивинилбензола, -аминогруппы аминокислот блокируют трет-бутилоксикарбонильными группами. Для защиты боковых радикалов трифункциональных аминокислот используют следующие группы: для лизина - 2-хлорбензилоксикарбонильную; для гистидина-тозиильную; для треонина, глютаминовой кислоты - соответствующие бензиловые эфиры; для аспаргиновой кислоты - циклогексиловый эфир; для аргинина - мезитиленсульфонильную; для тирозина - 2,6-дихлорбензильную. Для конденсации используют дициклогексилкарбодиимид или дициклогексилкарбодиимид с добавкой 1-оксибензотриазола. Деблокирование ведут с помощью 50% раствора трифторуксусной кислоты в среде СН2Cl2, а нейтрализацию 5%-ным раствором диизопропиламина в СН2 Cl2. Отщепление полученных пептидов от полимера и деблокирование боковых защитных групп ведут с помощью HF, а очищают гель- и обращеннофазовой хроматографией. Метод получения пептидов твердофазным методом описан в работе Barany G., Merrifield R.B., Solid-phase peptide synthesis. In: Peptides. Analysis, Synthesis, Biology. Eds.: Gross E., Meienhofer J., N.Y.- Academic Press.- 1980. - vol.2 - p.3-285/

Пример 1. Для синтеза одного пептида указанных формул загружают в реакционный сосуд 0,5 г бензгидриламинополимера. Содержание аминогрупп 1 мМ/г полимера. Пептидную цепь далее наращивают по следующей программе (на присоединение одной аминокислоты, см. таблицу 1).

Если нингидриновый тест положителен, повторяют конденсацию, начиная с п.5. В случае отрицательного результата теста производят присоединение следующего аминокислотного остатка, проходя программу с п.1. По завершении синтеза пептидил-полимер высушивают в вакуум-эксикаторе над пятиокисью фосфора до постоянной массы. Выход 2,4 г (60% от теории). 1 г пептидил-полимера переносят в реактор установки для работы с жидким фтористым водородом, добавляют 0,5 мл тиоанизола и 0,5 мл мета-крезола, охлаждают до температуры -78°С и в течение 10 мин перегоняют 10 мл безводного фтористого водорода. Реакционную смесь нагревают до 0°С и перемешивают в течение 90 мин, затем отгоняют фтористый водород. Остаток переносят на фильтр Шотта и промывают этилацетатом и эфиром. Пептид экстрагируют 50 мл 25%-ной уксусной кислоты, разбавляют водой и лиофилизуют. Выход с 1 г пептидил-полимера 135 мг (59%). После обессоливания на колонке с Sephadex G-10 (элюент 50%-ная уксусная кислота) продукт очищают на колонке Altech Rsil С 18 в 0,1%-ной трифторуксусной кислоте в градиенте 20-50% ацетонитрила. Фракции, содержащие пептид, собирают и лиофилизуют. Очищенный пептид индивидуален по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии (колонка Delta PAKC 18,5 0,4 15,0 cm, скорость потока 1 мл/мин, элюент 0,1%-ная трифторуксусная кислота, градиент 20-50% ацетонитрила). Время удерживания 8,44 мин. Данные аминокислотного анализа гидролизатов пептидов показали полное их соответствие с теоретически рассчитанными параметрами.

Пример 2. Проведение иммуноферментного анализа и оценка специфичности реагирования пептидов с исследуемыми сыворотками.

Оценку специфичности реагирования пептидов с исследуемыми сыворотками проводили в твердофазном иммуноферментном анализе (ИФА). Методика ИФА предусматривает наличие иммуносорбента. Для его получения каждый синтезированный пептид растворяли до концентрации 1 мкг/мл в стандартном карбонат-бикарбонатном буферном растворе (КБК) с рН 9,5. Полученные растворы вносили в отдельный для каждого пептида полистироловый микропланшет с высокой адсорбционной емкостью марки Biohit (Финляндия) по 120 мкл во все лунки и инкубировали 18-24 часа при температуре +2-8°С. После инкубации раствор из лунок удаляли, а микропланшеты высушивали при комнатной температуре, запаивали в полиэтиленовые мешочки и хранили при температуре +2-8°С до использования.

Поскольку не существует специальных аттестованных панелей сывороток, содержащих антитела к поверхностным белкам вируса гепатита С, необходимо было установить как реагируют сыворотки крови, полученные от 90 абсолютно здоровых доноров крови и не содержащие анти-ВГС по данным коммерческих скрининговых тест-систем, выпускаемых фирмами «Аквапаст» (Россия, Санкт-Петербург) и Orgenics (Израиль), с подготовленными иммуносорбентами. Исследование указанных образцов сывороток крови в ИФА проводили следующим образом:

1. Гидратация адсорбированного антигена. Все лунки микропланшета с адсорбированным антигеном заполняют до краев стандартным фосфатно-солевым буферным раствором (ФСР) с рН 7,5, а затем раствор удаляют насосом. Процедуру выполняют 1 раз.

2. Связывание антител. Одну из лунок (А1) оставляют незаполненной (контроль субстрата). Во все остальные лунки вносят по 90 мкл ФСР и по 10 мкл исследуемых образцов, получая разведение исследуемой пробы в 10 раз. Микропланшет закрывают крышкой и инкубируют при температуре 37±1°С в течение 1 часа во влажной камере. После инкубации лунки промывают ФСР 3 раза.

3. Присоединение конъюгата. Во все лунки кроме А1 вносят по 100 мкл раствора конъюгата (моноклональные антитела против IgG человека, меченные пероксидазой). Микропланшет закрывают крышкой и инкубируют при температуре 37±1°С в течение 1 часа во влажной камере. После инкубации лунки промывают 5 раз ФСР.

4. Проведение ферментативной реакции. Во все лунки вносят по 100 мкл субстратного раствора. Планшет закрывают крышкой и выдерживают в темноте при комнатной температуре в течение 15±1 мин во влажной камере.

5. Остановка ферментативной реакции. Реакцию останавливают внесением в каждую лунку по 50 мкл раствора серной кислоты.

6. Инструментальный учет результатов. Измерение оптической плотности (ОП) проводят при длине волны 490 нм непосредственно в лунках микропланшетов с помощью вертикальных фотометров. В качестве кюветы сравнения служит лунка А1 с контролем субстрата. 

Исследование 90 сывороток от здоровых доноров крови показало, что все иммуносорбенты продемонстрировали очень слабые фоновые реакции, не превышающие 0,2 оптические единицы. Это дало основание использовать пул сывороток от здоровых доноров в качестве негативного контрольного образца в последующих экспериментах по оценке специфичности пептидов на различных панелях сывороток. Во всех последующих экспериментах в постановку ИФА были внесены следующие изменения: 

1. На стадии связывания антител в 3 лунки (B1, C1, D1) вносят по 10 мкл негативного контрольного образца - пул сывороток от здоровых доноров.

2. На стадии инструментального учета результатов. Проводится количественная оценка результатов ИФА по формуле:

К= Средняя ОП в лунках с негативными образцами × 2,1

Если ОП исследуемой пробы больше К, то ее считают реагирующей с иммуносорбентом (содержащей антитела к адсорбированному антигену). Если ОП исследуемой пробы меньше или равно К, то ее считают не реагирующей с иммуносорбентом (не содержащей антитела к адсорбированному антигену).

Оценка специфичности иммуносорбентов проводили на аттестованных с помощью коммерческих тест-систем панелях сывороток, содержащих антитела класса IgG к ядерному белку вируса гепатита В (45 сывороток), к вирусу гепатита А (57 сывороток), к вирусу иммунодефицита человека (86 сывороток), к вирусу гепатита С (30 сывороток). Последняя группа сывороток была получена от больных с хроническим гепатитом С. Результаты исследований суммированы в таблице 2. Все иммуносорбенты не реагировали с сыворотками, содержащими антитела к вирусу гепатита В, к вирусу гепатита А, к вирусу иммунодефицита человека. В то же время, все иммуносорбенты прореагировали с сыворотками от больных хроническим гепатитом С с частотой от 61,3% (пептид 3 Е2 483-502) до 83,9% (пептид 5 Е2 553-578). Отмечено, что иммуносорбенты практически одинаково часто реагировали как с сыворотками больных, инфицированных геновариантом 1b, так и геновариантом 3а (таблица 3). Это свидетельствует о том, что все пептиды - аналоги антигенных детерминант поверхностных белков вируса гепатита С специфично реагируют только с сыворотками от больных гепатитом С, причем инфицированных двумя разными геновариантами. 

Пример 3. Оценка прогностической ценности. Под наблюдением находился 21 пациент с установленным диагнозом острого гепатита С. Диагноз основывался на следующих критериях: обнаружение анти-ВГС в ИФА, обнаружение РНК вируса ГС в полимеразной цепной реакции (ПЦР), повышение уровня сывороточной аланинаминотрансферазы (АлАт) в 5 раз и более по сравнению с нормой (40 ME); результаты тестирования на маркеры вируса гепатита В (HBsAg, anti-HBc IgM) и вируса гепатита A (anti-HAV IgM) - отрицательные. Средний уровень АлАт у пациентов при поступлении составил 706,3 ME. Программа наблюдения включала определение в динамике анти-ВГС, РНК вируса ГС, антител к поверхностным белкам вируса ГС, уровень АлАт.

Определение антител к поверхностным белкам показало, что уже на 2-3 неделе после начала заболевания они присутствовали у 38,8-61,1% обследованных в зависимости от использованного иммуносорбента (см. таблицу 4). Частота обнаружения этих антител увеличивалась со временем и достигла наибольших значений в конце наблюдения (в среднем через 56 недель после начала заболевания). При этом антитела обнаруживались в 66,7-91,7% случаев. Результаты длительного лабораторного наблюдения оказались доступными для оценки у 12 пациентов. Из этих 12 человек у 5 было зафиксировано выздоровление, а у 7 - развитие хронического инфекционного процесса. При анализе иммунного ответа на антигенные детерминанты поверхностных белков вируса ГС в этих 2-х группах были установлены существенные различия, В группе с благоприятным исходом заболевания у всех пациентов уже на 3-7 неделе обнаруживались антитела практически ко всем антигенным детерминантам, представленным соответствующими синтетическими пептидами (таблица 5). Исключение составил 1 пациент, у которого в начале заболевания не обнаруживались антитела к антигенным детерминантам 4 и 5. В процессе наблюдения у всех пациентов в сыворотке крови перестала выявляться РНК вируса и при заключительном обследовании, проведенном на 45-63 неделях после начала заболевания (в среднем 57 неделя) тест на РНК оказался отрицательным. У всех пациентов полностью нормализовались биохимические показатели. Следует отметить, что у всех пациентов наблюдалась динамика снижения количественного содержания антител к поверхностным белкам, а у двух из 5 указанные антитела вообще перестали определяться на заключительном этапе наблюдения. При оценке уровня общих антител к вирусу гепатита С (анти-ВГС) также отмечалась динамика к значительному снижению - соотношение ОП/к в начале наблюдения составляло 4,48, а в конце наблюдения - 2,18. Это указывает на отсутствие антигенного раздражения, связанного с репродукцией вируса и образованием вирусных белков, и угасания иммунной реакции, что свидетельствует об очищении организма от вируса, а следовательно, и о выздоровлении. 

Другая картина выработки антител установлена в группе пациентов с неблагоприятным исходом заболевания с формированием хронической инфекции. У 4 из 7 человек этой группы антитела к поверхностным белкам на 3-7 неделях вообще не выявлялись (таблица 6). Их появление зафиксировано значительно позже, а в конце наблюдения ( в среднем 57 неделя) они выявлены у 6 из 7 обследованных. У 1 пациента антитела к поверхностным белкам так и не появились в течение 62 недель наблюдения.

РНК вируса ГС у всех пациентов обнаруживалась постоянно, в том числе на завершающей стадии наблюдения (57 недель). Это свидетельствует о продолжающейся репродукции вируса, а следовательно, и продолжающемся антигеном раздражении. На это же указывает и динамическое повышение уровня общих анти-ВГС у обследованных этой группы. В начале наблюдения средний показатель ОП/к составлял 4,1, а в конце наблюдения - 7,1. Дополнительно следует отметить, что у всех пациентов этой группы наблюдались периодические повышения уровня АлАт, что также указывает на продолжающееся повреждение клеток печени. Таким образом, раннее появление антител к поверхностным белкам вируса ГС способствует очищению организма от вируса и выздоровлению. Определение этих антител в клинической практике позволяет прогнозировать исход заболевания.

Таблица №1

Программа присоединения одного аминокислотного остатка 
№ Операция Реагенты Кратность повторения Время (мин) Объем реагентов

(мл) 
1 Деблокирование 50% трифторуксусная кислота в хлористом метилене 2 2

30 50

50 
2 Промывка Хлористый метилен 6 2 80 
3 Нейтрализация 5% диизопропилэтиламин в хлористом метилене 3 2 50 
4 Промывка Хлористый метилен 6 2 80 
5 Конденсация Раствор производного аминокислоты, дициклогексилкарбодиимида и 1-оксибензотриазола в смеси диметилацетамида и хлористого метилена 1 120 35 
6 Промывка Диметилацетамид 2 2 80 
7 Промывка Изопропанол 3 2 80 
8 Промывка Хлористый метилен 3 1 80 
9 Нингидрйновый тест - - - - 


Таблица 2.

Частота реагирования сывороток, содержащих антитела к некоторым вирусным антигенам, с иммуносорбентами на основе пептидов, соответствующих антигенным детерминантам поверхностных белков вируса гепатита С. 
Группа сывороток Количество Частота положительных реакций с иммуносорбентами на основе пептидов из области поверхностных белков 
1 (E1 314-328) 2 (Е2 397-411) 3 (Е2 483-502) 4 (Е2 514-531) 5 (Е2 553-578) 
абс % абс % абс % абс % абс % 
С IgG антителами к ядерному белку вируса ГВ (анти-НВс) 45 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 
С IgG антителами к вирусу гепатита А (анти-ВГА) 57 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 
С IgG антителами к вирусу иммунодефицита человека (анти-ВИЧ) 86 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 
С IgG антителами к вирусу гепатита С (анти-ВГС) 30 21 67,7 25 80,6 19 61,3 24 77,4 26 83,9 


Таблица 3

Частота реагирования в иммуноферментном анализе синтетических пептидов, соответствующих антигенным детерминантам поверхностных белков вируса гепатита С, с сыворотками больных хроническим гепатитом С, инфицированных генотипами вируса HCV-1b и HCV-3а 
Генотип вируса гепатита С Количество обследованных больных Анти-ВГС Частота реагирования с пептидами 
Е1-1*

(314-328) Е2-2

(397-411) Е2-3

(483-502) Е2-4

(514-531) Е2-5

(553-578) 
HCV-1 24 24/100,0 16/66,7** 19/79,2 14/58,3 18/75,0 20/83,3 
HCV-3 7 7/100,0 5/71,4 6/85,7 5/71,4 6/85,7 6/85,7 
Всего 31 31/100,0 21/67,7 25/80,6 19/61,3 24/77,4 26/83,9 
* - наименование пептидов, соответствующих белкам вируса гепатита С: Е1 - поверхностный белок 1, Е2 -поверхностный белок 2. В скобках показаны позиции синтезированных участков белков вируса по последовательности аминокислот

** - в числителе - количество позитивных проб/ в знаменателе - доля позитивных проб в % 


Таблица 4

Частота реагирования в иммуноферментном анализе синтетических пептидов, соответствующих антигенным детерминантам поверхностных белков вируса гепатита С, с сыворотками крови больных острым гепатитом С, полученными на различных сроках заболевания 
Сроки тестирования от начала заболевания (в неделях) Количество обследованных больных анти-ВГС Частота реагирования с пептидами 
Е1-1*

(314-328) Е2-2

(397-411) Е2-3

(483-502) Е2-4

(514-531) Е2-5

(553-578) 
2-3 18 18/100,0 11/61,1** 7/38,8 11/61,1 11/61,1 9/50,0 
4-6 15 15/100,0 10/66,7 7/46,7 7/46,7 10/66,7 12/80,0 
7-9 11 11/100,0 9/81,8 6/54,5 7/63,6 8/72,7 9/81,8 
10-26 15 15/100,0 12/80,0 6/40,0 7/46,7 12/80,0 11/73,3 
26-66 12 12/100,0 9/75,0 9/75,0 8/66,7 11/91,7 10/83,3 
* - наименование пептидов, соответствующих белкам вируса гепатита С: Е1 - поверхностный белок 1, Е2 - поверхностный белок 2. В скобках показаны позиции синтезированных участков белков вируса по последовательности аминокислот

** - в числителе - количество позитивных проб/ в знаменателе - доля позитивных проб в % 


Таблица 5

Определение антител к антигенным детерминантам поверхностных белков вируса гепатита С в сыворотках крови 5 больных острым гепатитом С, у которых инфекция завершилась выздоровлением. 
Идентификационный номер пациента Генотип вируса гепатита С Сроки тестирования от начала заболевания (в неделях) РНК вируса гепатита С Анти-ВГС (отношение ОП/к*) Уровень антител к антигенным детерминантам поверхностных белков, выраженный отношением ОП/к* 
Е1-1**

(314-328) Е2-2

(397-411) Е2-3

(483-502) Е2-4

(514-531) Е2-5

(553-578) 
1672 1b 3 +*** 1,5 2,7 1,6 2,0 2,1 2,1 
63 -*** 1,4 1,3 1,3 2,0 1,7 1,5 
5688 1b 6 + 5,3 2,3 1,6 1,6 2,0 1,9 
61 - 1,8 1,2 1,1 1,0 1,6 1,3 
10797 3а 5 + 5,5 1,7 1,1 1,4 1,5 1,8 
45 - 1,7 - - - - - 
2913 3а 3 + 5,2 2,4 1,4 2,1 2,0 2,4 
62 - 4,1 - - - + - 
8755 3а 7 + 4,9 1,1 1,8 1,2 - - 
55 - 1,9 - 1,2 - 1,5 1,5 
* - ОП/к - отношение оптической плотности образца в иммуноферментном анализе к отсекающему уровню (коэффициент к;

** - наименование пептидов, соответствующих белкам вируса гепатита С: Е1- поверхностный белок 1, Е2 - поверхностный белок 2. В скобках показаны позиции синтезированных участков белков вируса по последовательности аминокислот

*** - (+)- позитивный результат, (-) - негативный результат 


Таблица 6

Определение антител к антигенным детерминантам, поверхностных белков вируса гепатита С в сыворотках крови 7 больных острым гепатитом С, у которых инфекция завершилась формированием хронического процесса. 
Идентификационный номер пациента Генотип вируса гепатита С Сроки тестирования от начала заболевания (в неделях) РНК вируса гепатита С Анти-ВГС (отношение ОП/к*) Уровень антител к антигенным детерминантам поверхностных белков, выраженный отношением ОП/к * 
Е1-1** (314-328) Е2-2 (397-411) Е2-3 (483-502) Е2-4 (514-531) Е2-5 (553-578) 
2264 1b 3 +*** 2,5 - - - - - 
66 + 4,9 1,5 1,4 1,6 1,7 2,0 
3373 1b 4 + - - - - - - 
57 + 5,8 1,5 1,9 2,1 2,0 2,0 
4158 1b 4 + 5,7 1,1 - 1,2 1,2 1,6 
56 + 7,3 1,3 2,1 2,1 1,8 2,0 
7193 1b 6 + 2,5 - - - - - 
62 + 5,6 - - - - - 
4718 1b 3 + 5,7 1,2 1,1 1,4 1,1 - 
56 + 8,7 1,2 1,0 1,5 1,1 1,5 
11529 3а 3 + 4,1 1,1 1,0 1,1 1,2 1,3 
45 + 9,3 2,0 1,8 1,9 2,3 2,4 
5016 3а 5 + 3,6 - - - - - 
56 + 8,1 1,2 1,6 3,0 2,1 2,2 
* - ОП/к - отношение оптической плотности образца в иммуноферментном анализе к отсекающему уровню (коэффициент к);

** - наименование пептидов, соответствующих белкам вируса гепатита С: Е1- поверхностный белок 1, Е2 - поверхностный белок 2. В скобках показаны позиции синтезированных участков белков вируса по последовательности аминокислот

*** - (+)- позитивный результат, (-) - негативный результат 






ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


Способ прогнозирования исходов острого вирусного гепатита С путем определения антител к поверхностным белкам вируса гепатита С твердофазным иммуноферментным анализом, отличающийся тем, что исследования проводят с использованием в качестве антигенов 5 синтетических пептидов, соответствующих антигенным детерминантам, поверхностных белков Е1 и Е2 следующей формулы:

NH 2 - SGHRMAWDMMMNWSP - CONH2

NH2 - STLTSLPTPGASG - CONH2

NH2 - RPYAWHYAPRPAGIVPASQV - CONH2

NH2 - TTDRIFGAPTYSWGENETDVL - CONH2

NH2 - TWIMNSTGFTKTAGGPPANIGGVGNNT - CONH2

и при обнаружении антител в первые 3-7 недель заболевания прогнозируют благоприятный исход (выздоровление).